Abstract
的芽孢杆菌种含有支链和不饱和脂肪酸（FAS）的甲基支链的多样的位置（异或反异）和双键。在FA组成的变化发挥细菌的适应了至关重要的作用，以他们的环境。这些修改意味着在异相对于反异支链的FA的比例的变化，并在的FA相对不饱和与饱和的FA，以在特定位置产生双键的比例。在FA轮廓的精确识别是必要了解芽孢杆菌物种的适应机制。
许多从芽孢杆菌的FA都没有可商购的。这里提出的策略识别的FA通过与三种类型的FA衍生物的质谱相结合上的保留时间（由等效链长（ECL）的计算）信息：脂肪酸甲酯（脂肪酸甲酯），4,4-二甲基恶唑啉衍生物（DMOX），和3 pyridylcarbinyl酯（皮考）。该方法可以识别的FA，而不需要净化未知的FA。
比较从蜡样芽胞杆菌制备的标准商业混合物FAME色谱型材允许直链的识别饱和的FA时，ECL的计算，并假设在其他的FA的身份。的脂肪酸甲酯支链饱和的FA，异或反异，显示在ECL恒定负移位相比，具有相同数目的碳的直链饱和的FA。不饱和的FA的脂肪酸甲酯可以通过它们的分子离子的质量进行检测，并导致在ECL正移位相比相应的饱和的FA。
的FA的和分支位置的不饱和的FA的双键位置可以通过甲代吡啶并DMOX衍生物的电子电离质谱分别进行识别，。这种方法确定所有未知的饱和支ED FAS，不饱和直链FAS和从蜡样芽孢杆菌提取物的不饱和支的FA。
Introduction
脂肪酸甲基酯（FAME）气相色谱（GC）为脂质表征的基本方法。它迅速分离和短提取步骤后量化的样品的各种脂肪酸（FAS）。酸甲酯衍生物是极不稳定的，稳定的和惰性朝色谱柱，从而避免拖尾峰。他们的身份是相当简单的，当样本包括知名的FA，因为色谱配置文件登载或比较的标准。此外，校准标准关于各种的FA的量化的重复注射是不需要的，因为它们对火焰离子化检测器（FID）1几乎恒定的响应。
除了FID，质谱（MS）检测提供了一个互补组的信息，以确认脂肪酸甲酯。然而，当脂肪酸甲酯使用电子电离（EI）充电，由此产生的光谱并不总是允许日FA精细结构的E识别。例如，分支位置（ 即，支甲基）很难预测，因为诊断离子是很难检测1和目标离子丰度的特性的改变是依赖于机器的，防止使用质谱库2。另一个挑战在于确定双键的位置，因为EI使双键迁移。因此，具有不同双键位置的FA的异构体不能由它们的质谱鉴别。幸运的是，其他的工具已经开发了FA鉴定。例如，存在和支化或中的FA双键的位置可以通过计算等效链长（ECL）3进行推测。
其它衍生方法导致不同的质谱，依赖于一个双键或支链甲基的位置。 4,4-二甲基唑啉衍生物（DMOX）4允许EASŸ识别单不饱和脂肪酸双键的位置。 3- pyridylcarbinyl酯（甲代吡啶酯）衍生物允许甲基的位置的明确识别支链的FA 5。结合色谱保留（ECL）和质谱（DMOX和甲代吡啶）的信息允许对大部分的FA的鉴定，而不需要使用纯化的复杂的方法，因为需要用于核磁共振（NMR）谱，进行结构表征1无可争辩方法。
芽孢杆菌属，包括一些人类和动物病原体的细菌，都能够定殖高度多样化龛，因此被广泛分布于环境6。间的芽孢杆菌属，FA组成是由物种的生态位的影响，在FA模式调制，以适应范围广泛的环境变化（ 例如 ，生长培养基，温度，pH 等 ）7-9。因为在标准化条件生长期间通过芽孢杆菌属物种的FA图案的相对同质性，FA组成的测定是用来定义芽孢杆菌物种的主要标准之一。 芽孢杆菌属的一个独特属性是含有12-17个碳10-12用异和反异异构体是适应的对环境条件的关键决定因素之间的比支链的FA的丰度。 杆菌物种还通过改变不饱和脂肪酸的比例适应环境的波动。在一些物种中，如蜡状芽孢杆菌，二脂肪酸去饱和酶中创建与适应9不同的角色烷基链13的不同位置上的双键。 芽孢杆菌属的实施例说明的精确识别所述双键位置和FA分支的重要性。搜集ively， 芽孢杆菌 FA模式的识别有几个有用的应用程序。这里，我们提出了一种克服经典GC-MS分析的固有局限性芽孢 FA图案识别的新颖GC-MS的方法。
这种创新的方法，可以直接使用原料的生物材料，和由现有技术的组合的：保留时间（ECL）和不同的FA衍生物（FAME，DMOX和甲代吡啶酯）的质谱信息。
我们用下面的FA命名。 I，A和n表示异，反异甲基支链的，直链脂肪酸，分别。不饱和的FA由名为C：d，其中C是在脂肪酸的碳原子数以及d的数目的双键的数量。 Δx表示双键，其中双键位于第x个碳-碳键，从该羧酸端计数的位置。
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Protocol
1.细菌培养
- 通过扩频将100μl的LB（Luria液体-Bertani培养基）在30℃培养菌株的过夜培养物，LB琼脂培养基的板的表面上制备的细菌（ 蜡状芽孢杆菌菌株ATCC 14579）的草坪。过夜孵育所述板在30℃。
2. ECL：等效链长
- 计算ECL如下：
搭配：
我，感兴趣的溶质;
n中，直链饱和脂肪酸甲酯溶质之前洗脱的碳原子数我;
的n + 1中，直链饱和脂肪酸甲酯的溶质后洗脱的碳原子数我;
RTI，RTN，RT（N + 1）上述的FAME峰的保留时间。
注意：通过标准的混合物的注射获得直链饱和脂肪酸的甲酯的保留时间（BAME）。
搭配： 3. FAME制备及分析
- 为了通过从琼脂平板刮落，以获得脂质的脂肪酸，收获细菌细胞和细菌的40毫克（鲜重，相当于10 9活细胞）转移到10ml玻璃管螺丝帽和PTFE密封。
- 通过下文详述的酯键的方法14,15进行酯交换反应。
- 在甲醇加入5毫升的0.2M的KOH的新鲜细菌细胞，并在37℃下孵育1小时。这个反应由碱性甲醇分解的，打破在脂的酯链接并产生脂肪酸甲酯。
- 加入1毫升1M乙酸将pH值降低至7.0。检查其pH值试纸。
- 加入3毫升己烷提取脂肪酸甲酯。
- 在室温下转移上清液（有机相）转化为清洁管和浓缩通过蒸发在氮气下的连续流，以获得约200微升的提取物。将样品转移到与插入一个GC小瓶。
- 注入提取成气相色谱 - 质谱（GC-MS）系统。
4. GC / MS条件
- 注入FAME样品到装有毛细管柱ZB-WAX（长度30米;直径0.25毫米;膜厚为0.25μm）的GC-MS仪器。
- 设置注入口（在无分流模式）温度至250℃。使用氦作为载气，用37厘米/秒的线速度。保持在50℃的烘箱温度下进行1分钟，增加至190℃以20℃/分钟的速度，并以2℃/分钟的速率进一步提高到230℃的最终温度。
- 为MS，在70伏特记录由电子电离（EI）的质谱，并设置50和400原子质量单位（AMU）（2次扫描/秒）之间的采集的总离子电流。
- 当需要时，注射在相同的条件下excep DMOX和甲代吡啶基衍生物t是温度程序烘箱如下：
DMOX：50℃（1分钟），20℃/分钟直到210℃和2℃/分钟直到240℃（5分钟）;
甲代吡啶：6℃（1分钟），20℃/分钟直到220℃和2℃/分钟直到250℃（20分钟）。
5.代吡啶酯准备从16 FAME
- 蒸发从第3节的FAME提取与氮气流（至少10mg干基料）和在1毫升无水二氯甲烷溶解。
- 制备钾叔叔丁醇在四氢呋喃中的1.0M溶液。
- 添加FAME提取和0.2毫升3吡啶甲醇0.1毫升溶液在步骤5.2制成。
- 加热在40℃下在密闭的小瓶中的溶液30分钟。
- 在冷却至室温后，加入精制去离子水（2毫升，见材料表 ）和己烷（4ml）中。用涡旋混合，让相分离，并收集有机相。
- 博士ý它加入无水硫酸钠，直至有机相是完全清楚的。它转移到一个干净的试管中。然后蒸发至200微升。将样品转移到与插入一个GC小瓶。
6. DMOX准备从17 FAME
- 蒸发从第3节的FAME提取用氮气（至少10mg干基料）的流动。
- 向FAME干提取物，加入250毫克的2-氨基-2-甲基-1-丙醇。用氮气冲洗容器，添加一个塞子，并将其放置在一个加热块过夜，在190℃。
- 在冷却至室温后，加入3毫升二氯甲烷的管，和5ml纯化的去离子水（见材料表 ）。
- 摇相分离，然后取出水相。
- 洗涤有机相用5毫升水。摇相分离，然后取出水相。
- 加入无水硫酸钠，直至有机相干燥是完全清楚，将其转移到一个干净的试管中。在氮气流中蒸发，直至达到200微升的体积。将样品转移到与插入一个GC小瓶。
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Representative Results
从细菌细胞FA识别该战略提出了如图1所示 。每一步都提供了互补的光谱信息或有关色谱保留的信息。步骤1包括使用标准溶液初步FA鉴定。第2步允许FAME EI谱和ECL的解释，以初步确定的产品。步骤3识别支链-FAS的确切分布位置。最后，第4步确定的不饱和的FA双键的精确位置。
FAME和ECL
该BAME混合物使我们能够确定一系列直链饱和脂肪酸（N12在N17）和一些甲基支链脂肪酸（I15，A15，I16，I17）。然而，在我们的样本中检测到极少数的FA具体到蜡样芽胞杆菌 ，证明该开发板的的识别方法的pment如下所述。
不论链长的，支链的饱和的FA同源系列（异或反异）（ 即 ，具有相同的通式的一系列化合物）显示在ECL恒定移位相比具有相同数目的碳的直链饱和FA其碳链。这种转变，称为小数链长（FCL），允许在同系列的标识的FA的。例如，ISO-FAS（表示前缀为“I”）有一个-0.48整箱价值，而反异的FA（前缀为“A”表示）有一个-0.33整箱。它是那么容易识别I14和I13与13.52分别为12.52和，一个ECL，以及A13和A15与12.67分别为14.66和，一个ECL。
表我们的样本中检测出1显示的ECL每个细胞Fas。保留时间预测ED的ISO和反异系列，MS谱连同脂肪酸甲酯获得，使我们能够从我们的样本识别所有的支链-FA的。在这一步这样的鉴定试探性的，但后来由皮考的FA衍生物获得EI谱证实。
与不对应于异或的ECL反异移位脂肪酸甲酯是不饱和的，直链或支链的FA，通过它们的分子离子的质量所指示的。不饱和的FA显示ECL正移位相比于相应的饱和的FA。谱从DMOX衍生物，与从支链的FA甲代吡啶衍生物光谱结合起来，允许双键位置的识别。
这样的衍生方法适用于FA标识，只有当洗脱顺序被保留，如在图三个衍生混合物（ 即 FAME，DMOX和皮考）2数16：1的FA。这种方法允许使用3衍生方法可结合，以确定FA结构中的一个峰的补充光谱信息的收集。 3衍生物间未观察到洗脱顺序没有差别，虽然保留时间和烘箱温度是不同的。
异的甲代吡啶酯和反异甲基支链饱和脂肪酸
被EI得到的光谱证实甲基支链的FA的存在。的确，分子离子具有对应于饱和的FA的M / Z。我们观察到与对应于亚甲基基团的损失14质量单位（AMU）的间隙的离子系列除了在分支点对应于被取代的碳原子上的离子丢失的区域。然后，我们看到之前创建的28 AMU的对应片段两种离子之间的差距，后支的碳。 图3示出I16与表示分支地点的诊断离子（304和332）的频谱。
的直链不饱和脂肪酸DMOX
图2呈现与16相关联五个不同的峰：1脂肪酸。前两个峰具有ECL值<16。我们的结论是他们的结构当然是支链的。这些化合物的鉴定需要由DMOX和甲代吡啶酯衍生物产生的质谱的解释。三个峰值拥有ECL> 16匹配的单不饱和直链脂肪酸。 DMOX衍生物质谱表明鉴定这些化合物的双键的位置诊断离子。在图4中，我们可以看到指示与N16的碳8双键的存在196和208之间12原子量的离子的间隙：1Δ
甲基支链DMOX和甲代吡啶质谱monounsatured脂肪酸
图6给出DMOX的光谱和甲代吡啶酯衍生物，用于确定I16的结构：1Δ9 FA。的位置分支是由28 AMU的两种衍生品的缝隙表示。 12原子量为DMOX和26为甲代吡啶酯A间隙标识双键的位置， 如图6。
的脂肪酸和诊断离子识别
表1示出所确定的各种脂肪酸，与相应的诊断离子， 蜡样芽胞杆菌 ATCC 14579在30℃下生长。这些诊断离子识别为DMOX和甲代吡啶酯衍生物，它们提供互补的结构信息的碳链中的甲基支化的位置和双键。这两种方法是真正的互补性，作为诊断离子有时更容易DMOX衍生品来观察，而在其他时候更容易衍生皮考观察。
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图1：策略在蜡样芽胞杆菌的鉴定的脂肪酸。
连续步骤产生的保留时间（ECL）的信息，在FAME的质谱DMOX的，和皮考酯的显示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 蜡状芽孢杆菌检测1脂肪酸：对于不同的16的色谱图比较。
（A）FAME衍生物（在m提取的分子离子/ Z 268）; （B）DMOX衍生物（在m提取的分子离子/ Z 307）; （C）的甲代吡啶衍生物（在m / z 345提取分子离子）。尔斯/ ftp_upload / 54960 / 54960fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图3：通过电子电离产生I16甲代吡啶衍生物质谱。
在m / z 151和m / z 164离子表明存在的脂肪酸甲代吡啶基衍生物。在m / z 347的分子离子被识别为棕榈酸的异构体。在米之间离子AMU 28的间隙的存在/ Z 304和m / z 332表明I16的。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：N16：1Δ8 DMOX衍生质谱通过电子产生电离。
在m离子/ Z 126表示DMOX衍生物，M / Z 307是16的分子离子：1 DMOX和在m / z 196和m / z 208离子之间12原子量的间隙的存在标识的位置碳8.双键请点击此处查看该图的放大版本。
图5：N16：由电子电离生成1Δ5 DMOX衍生物质谱。
离子在m / z 126是指示DMOX衍生物和m / Z 307是16个分子离子：1 DMOX。强烈的M / Z 153离子是位于5碳双键的特点，请点击此处查看该图的放大版本。
图6：DMOX（上）和甲代吡啶（底部）I16的比较：1Δ9光谱 。
在这两种情况下28原子量的间隙指示甲基分支的位置。双键位置可以通过12阿拉伯马格里布联盟的DMOX和代吡啶衍生物差距，26 AMU分别导出。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 假定化合物 | 分子离子（M / Z）FAME; DMOX;皮考 | RT | ECL | 确认身份 | 诊断离子DMOX | 诊断离子皮考 |
| I12 | 214; 253; 291 | 7.93 | 没有参考 | I12 | [276（15）; 262（0）; 248（15）] mb个 | |
| N12 | 214; 253; 291 | 8.21 | 12.00 | N12 | [276（10）; 262（20）; 248（20）] mb个 | |
| I13 | 228; 267; 305 | 8.53 | 12.5 | I13 | [290（15）; 276（0）; 262（48）] mb个 | |
| A13 | 228; 267; 305 | 8.64 | 12.67 | A13 | [276（48）; 262（0）; 248（65）] MB | |
| I14 | 242; 281; 319 | 9.24 | 13.52 | I14 | [304（20）; 276（45）290（0）] mb个 | |
| N14 | 242; 281; 319 | 9.60 | 14.00 | N14 | [304（7）; 290（17）; 276（17）] mb个 | |
| I15 | 256; 295; 333 | 10.06 | 14.51 | I15 | [318（20）; 314（0）; 290（50）MB | |
| A15 | 256; 295; 333 | 10.19 | 14.66 | A15 | [304（30）; 290（TR）; 276（62）] MB | |
| N15 | 256; 295; 333 | 10.49 | 15.00 | N15 | [318（5）; 304（13）; 290（18）] MB | |
| I16 | 270; 309; 347 | 11.04 | 15.5 | I16 | [332（18）; 318（TR）; 304（42）] mb个 | |
| 甲基支链16：1 | 268; 307; 345 | 11.19 | 15.64 | I16：1Δ5 | [152（2）; 153（10）]分贝[292（3）; 278（TR）; 264（2）] mb个 | |
| 甲基支链16：1 | 268; 307; 345 | 11.40 | 15.83 | I16：1Δ9 | [210（3）; 222（3）]分贝[292（12）; 278（TR）; 264（40）] mb个 | |
| N16 | 270; 309; 347 | 11.59 | 16.00 | N16 | [332（5）; 318（15）; 304（15）] mb个 | |
| 16：1 | 268; 307; 345 | 11.78 | 16.14 | N16：1Δ5 | [152（2）; 153（10）]分贝 | |
| 16：1 | 268; 307; 345 | 11.94 | 16.24 | N16：1Δ8 | [196（5）; 208（3）]分贝 | |
| 16：1 | 268; 307; 345 | 12.00 | 16.31 | N16：1Δ9 | [210（3）; 222（3）分贝 | |
| 16：2 | 266; 305; 343 | 12.18 | 16.44 | N16：2Δ5，Δ9 | [152（2）; 153（12）]分贝[208（1）; 220（2）]分贝 | |
| I17 | 284; 323; 361 | 12.25 | 16.5 | I17 | [346（20）; 332（TR）; 318（35）] mb个 | |
| 甲基支链17：1 | 282; 321; 359 | 12.43 | 16.64 | I17：1Δ5 | [152（2）; 153（10）]分贝 | [344（10）; 316（5）] mb个 |
| A17 | 284; 323; 361 | 12.47 | 16.66 | A17 | [332（30）; 318（0）; 304（52）] mb个 | |
| 甲基支链17：1 | 282; 321; 359 | 12.57 | 16.74 | I17：1Δ8 | [196（2）; 208（2）]分贝 | [344（10）; 316（5）] mb个 |
| 甲基支链17：1 | 282; 321; 359 | 12.64 | 16.79 | I17：1Δ9 | [210（3）; 222（3）]分贝 | |
| 甲基支链17：1 | 282; 321; 359 | 12.70 | 16.84 | I17：1Δ10 | [224（1）; 236（1）]分贝 | |
| 甲基支链17：1 | 282; 321; 359 | 12.84 | 16.94 | A17：1Δ9 | [210（3）; 222（4）]分贝 | [330（10）; 316（0）; 302（90）] mb个 |
表1：来自蜡状芽孢杆菌 ATCC 14579脂肪酸鉴定 。
保留时间，相当于链长（ECL）的值，和对于脂肪酸甲基酯（脂肪酸甲酯）分子离子被示出，与分子离子和DMOX诊断离子和甲代吡啶衍生物在一起。
[] mb个诊断离子对指示对应于片段之前和碳支后28原子量的损失。
[]分贝诊断离子对指示对应于双键的裂解12原子量的损失。
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Discussion
在表1所示的的FA色谱轮廓对应蜡状芽孢杆菌 ATCC 14579生长在琼脂平板的表面。当细菌在充气液体介质在相同温度下8生长得到类似的轮廓。在液体培养基中生长的细菌的情况下，细菌的生物量是通过生长培养基的离心收集，并可以根据取决于生长条件8,19先前描述协议来洗涤。由蜡状芽孢杆菌产生的各种的FA的识别允许在的FA的比例细变化突变对低温7,9-生长所必需的一些基因的菌株被检测到。
通常，ECL使用的在固定的温度来确定调整后的保留时间日志值计算（使用等温的温度控制烘箱）20。这里，因为使用了非等温炉的为p的ermit感兴趣的FAME的优化分离，使用的计算方法是，先前为线性保留指数3.21描述。
这项工作的目的不是要比较所计算的ECL值与在文献中描述，但预测的FA结构，同样的色谱轮廓内，基于这些保留数据和光谱信息。的确，对于饱和的FA，一个给定的支化（异或反异）总是导致ECL同一移，相比于等效直链的FA。此外，电致化学发光与由Stransky 22上相当于极性的一列测量值相匹配的本研究计算。此同意与先前报道的值表示ECL值因此可用于从在其他条件，或其它菌株生长蜡状芽孢杆菌的芽孢杆菌的的FA色谱型材（ 例如 ，突变体）的峰的快速鉴定非常有用的。
甲代吡啶衍生物提供表示比由DMOX衍生物产生的离子的分支位置的多个特征离子，而双键的位置被更容易地与DMOX衍生物分配。本研究显示了来自两个衍生物组合的信息以识别甲基支链从蜡状芽孢杆菌 ，直到现在已经在文献中已经很差描述不饱和的FA的实用性。
jove_content“>提出的方法可在2天内完成。作为对比，用于NMR光谱，各个FA应当纯化，代表几个星期的工作和大量的生物材料制成。然而，该方法不区分几何（双键的顺式，反式）。一旦各个FA被识别，它们可常规通过FAME衍生物， 如量化，比较菌株和突变体或研究的生长条件的影响。在我们手中，少至8毫克的新鲜细菌细胞足够的FA的量化，这使得适用于难以生长的细菌的方法。对于每个识别的FA的定量极限是溶液1毫微克/微升的GC / MS的注入。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
作者感谢MISON托马斯对他的技术支持，并藉由完整雷切尔修订的手稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
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