Abstract
Bacillus-arten indeholder forgrenede og umættede fedtsyrer (FAS) med forskellige positioner af methyl gren (iso eller anteiso) og af dobbeltbindingen. Ændringer i FA sammensætning spiller en afgørende rolle i tilpasningen af bakterier til deres miljø. Disse modifikationer medfører en ændring i forholdet mellem iso versus anteiso forgrenet FA'er, og i andelen af umættede FA'er forhold til mættet FA'er, med dobbeltbindinger oprettet i specifikke positioner. Præcis identifikation af FA profil er nødvendigt at forstå de tilpasningsmekanismer af Bacillus arter.
Mange af de FA'er fra Bacillus ikke er kommercielt tilgængelige. Den her foreslåede strategi identificerer FA'er ved at kombinere oplysninger om lagring tid (beregning af den ækvivalente kædelængde (ECL)) med massen spektre af tre typer af FA deraf: methylesterolier (fames), 4,4-dimethyl oxazolin derivater (DMOX), og3-pyridylcarbinyl ester (picolinyl). Denne metode kan identificere de FA'er uden behov for at oprense det ukendte FA'er.
Sammenligning kromatografiske profiler for FAME fremstillet fra Bacillus cereus med en kommerciel blanding af standarder giver mulighed for identifikation af ligekædede mættede FA'er, beregningen af ECL, og hypoteser om identiteten af den anden FA'er. FAME'er af forgrenede mættede FA'er, iso eller anteiso, vise en konstant negativ skift i ECL, sammenlignet med lineære mættede FA'er med det samme antal carbonatomer. kan detekteres FAME'er af umættede FA'er ved massen af deres molekylære ioner, og resultere i et positivt skift i ECL sammenlignet med de tilsvarende mættede FA'er.
Den forgrening stilling FA'er og dobbeltbindingen stilling umættet FA'er kan identificeres ved elektron ionisering massespektre picolinyl og DMOX derivater hhv. Denne tilgang identificerer alle de ukendte mættet grened FA'er, umættede ligekædede FA'er og umættede forgrenede FA'er fra B. cereus ekstrakt.
Introduction
Fatty acid methyl ester (FAME) gaskromatografi (GC) er en væsentlig metode til lipid karakterisering. Det adskiller sig hurtigt og kvantificerer de forskellige fedtsyrer (FAS) af en prøve efter en kort ekstraktion. Derivater af methylestere er meget svingende, stabil og inert mod kromatografikolonnen, derved undgå toppe med hale. Deres identifikation er temmelig ligetil, når prøven består af kendte FA'er, fordi de kromatografiske profiler enten offentliggøres eller i forhold til standarderne. Desuden er den gentagne injektioner af kalibreringsstandarder til kvantificering af forskellige FA'er ikke påkrævet på grund af deres næsten konstant respons på flammeioniseringsdetektion (FID) 1.
Udover FID, massespektrometri (MS) detektion giver et supplerende sæt oplysninger for at bekræfte FAME'er. Men når FAME'er debiteres hjælp elektron ionisering (El), de resulterende spektre ikke altid giver mulighed for the identificering af FA finstruktur. For eksempel forgrener position (dvs. en forgrenet methylgruppe) er vanskeligt at forudsige, fordi de diagnostiske ioner er vanskelige at opdage en og den karakteristiske forandringer i målion overflod er maskinafhængig, at forhindre, at massespektre biblioteker 2. En anden udfordring ligger i at identificere dobbeltbindingen holdning, fordi EI forårsager dobbeltbinding migration. Således kan FA isomerer med varierende dobbelte bond positioner ikke differentieres af deres masse spektre. Heldigvis har andre værktøjer er udviklet til FA identifikation. For eksempel kan tilstedeværelsen og positionen af forgrening eller af dobbeltbindinger i FA'er blive conjectured ved at beregne den ækvivalente kædelængde (ECL) 3.
Andre derivatiseringsmetoder metoder resulterer i forskellige massespektre, afhængig af placeringen af en dobbeltbinding eller en forgrenet methylgruppe. 4,4-dimethyl oxazolin derivater (DMOX) 4 giver mulighed for easy identifikation af positionen af monoumættet fedtsyre dobbeltbindinger. 3-pyridylcarbinyl ester (picolinyl ester) derivater tillader utvetydig identifikation af placeringen af methyl forgrenede FA'er 5. Kombinere kromatografisk retention (ECL) og massespektrum (DMOX og picolinyl) information muliggør identifikation af de fleste FA'er uden behov for at anvende komplekse fremgangsmåder til oprensning, som kræves for kernemagnetisk resonans (NMR) spektrum, den bestrides fremgangsmåde til strukturel karakterisering 1 .
Bakterier af slægten Bacillus, som omfatter nogle humane og animalske patogener, er i stand til at kolonisere meget forskellige nicher og er derfor vidt udbredt i miljøet 6. Blandt Bacillus genus, er FA sammensætning påvirket af den økologiske niche af arterne med modulationer i FA mønstre til at tilpasse sig til en lang række miljømæssige ændringer (f.eks, vækstmedium, temperatur,pH, etc.) 7-9. På grund af den relative ensartethed af FA mønster hen arter af slægten Bacillus under vækst i standardiserede betingelser, bestemmelse af FA sammensætning er et af de vigtigste kriterier anvendes ved formuleringen af Bacillus-arter. En unik egenskab af Bacillus slægten er den overflod af forgrenede FA'er indeholdende 12-17 kulstofatomer 10-12 med forholdet mellem iso og anteiso isomerer er en vigtig faktor for tilpasning til miljøforholdene. Bacillus-arter også tilpasse sig miljømæssige udsving ved at ændre den andel af umættede fedtsyrer. I nogle arter, såsom Bacillus cereus, to fedtsyredesaturaser skabe dobbeltbindinger i forskellige positioner af alkylkæden 13 med forskellige roller i tilpasning 9. Eksemplet med Bacillus slægten illustrerer vigtigheden af nøjagtig inddeling dobbeltbindingen position og FA forgrening. Indsamlelukkende, identifikation af Bacillus FA mønstre har flere nyttige programmer. Heri foreslår vi en ny GC-MS metode til Bacillus FA mønster identifikation, der overvinder de iboende begrænsninger af et klassisk GC-MS-analyse.
Denne innovative tilgang kan anvendes direkte på rå biologisk materiale, og består af en kombination af eksisterende teknikker: oplysninger om opholdstider (ECL) og masse spektre af forskellige FA'er derivater (FAME, DMOX og picolinyl-ester).
Vi bruger følgende FA nomenklatur. i, en, og n angiver iso, anteiso methyl forgrenede og ligekædede fedtsyre, hhv. Umættede FA'er blev navngivet af C: d hvor C er antallet af carbonatomer i fedtsyren og d er antallet af dobbeltbindinger. Δ x angiver positionen af dobbeltbindingen, hvor dobbeltbindingen er placeret på den X. carbon-carbon-binding, talt fra carboxylsyre ende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bakteriekulturer
- Forbered en plæne af de bakterier (Bacillus cereus-stamme ATCC 14579) ved at sprede 100 pi af en overnatskultur af stammen inkuberet ved 30 ° C i LB (Luria-Bertani-medium), over overfladen på en plade af LB-agar-medium. Inkubér pladen natten over ved 30 ° C.
2. ECL: Ækvivalent Chain Længde
- Beregn ECL som følger:
med:
i, det aktuelle opløste stof;
n, carbonatomet nummer ligekædet mættet fedtsyre methylester eluering før solut I;
n + 1, carbon nummer ligekædet mættet fedtsyre methylester eluering efter solut I;
RTI, RTN, Rt (n + 1) retentionstiderne af FAME toppe beskrevet ovenfor.
BEMÆRK: Hent retentionstiderne af ligekædede mættede fedtsyrer methylestere ved injektion af en blanding af standarder (BAME).
med: 3. FAME Forberedelse og analyse
- For at opnå lipid fedtsyrer, høst bakterieceller ved at skrabe kolonier fra agarpladen og overføre 40 mg (frisk vægt, svarende til 10 9 levedygtige celler) af bakterier i en 10 ml glas med skruelåg og PTFE tætninger.
- Udfør transesterificering via esterbinding metode 14,15 beskrevet detaljeret nedenfor.
- Der tilsættes 5 ml 0,2 M KOH i methanol til de friske bakterieceller og inkuberes ved 37 ° C i 1 time. Denne reaktion består af alkalisk methanolyse, bryde esterbinding i lipid- og producerer fedtsyremethylestere.
- Der tilsættes 1 ml 1 M eddikesyre for at sænke pH til 7,0. PH kontrolleres med pH-teststrimler.
- Tilsæt 3 ml hexan for at ekstrahere FAME'er.
- Overfør supernatanten (organisk fase) i rene rør og koncentratet ved inddampning ved stuetemperatur under en kontinuerlig strøm af nitrogen til opnåelse af ca. 200 piekstrakt. Overfør prøven i en GC hætteglas med indsats.
- Injicer ekstrakterne i en gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS) system.
4. GC / MS-betingelser
- Sprøjt FAME prøver til et GC-MS instrument udstyret med en kapillarkolonne ZB-WAX (længde, 30 m diameter, 0,25 mm, filmtykkelse, 0,25 um).
- Indstil injektionsporten (i splitless mode) temperatur til 250 ° C. Brug helium som bæregas, med en lineær hastighed på 37 cm / sek. Hold ovntemperaturen ved 50 ° C i 1 min, stige til 190 ° C med en hastighed på 20 ° C / min, og stige yderligere til en sluttemperatur på 230 ° C ved en hastighed på 2 ° C / min.
- For MS, registrere massespektre ved elektron ionisering (El) ved 70 eV, og sæt erhvervelsen af den samlede ion strøm mellem 50 og 400 atommasseenheder (AMU) (2 scanninger / sek).
- Når det er påkrævet, injicere DMOX og picolinyl derivater under samme betingelse undtat temperaturen programmet ovnen som følger:
DMOX: 50 ° C (1 min), 20 ° C / min indtil 210 ° C og 2 ° C / min indtil 240 ° C (5 min);
Picolinyl: 6 ° C (1 min), 20 ° C / min indtil 220 ° C og 2 ° C / min indtil 250 ° C (20 min).
5. picolinyl Ester Fremstilling ud fra FAME 16
- Inddamp FAME ekstrakt fra afdeling 3 med en strøm af nitrogen (mindst 10 mg tørt materiale) og opløses i 1 ml tør dichlormethan.
- Der fremstilles en 1,0 M opløsning af kalium-ter-t-butoxid i tetrahydrofuran.
- Tilsæt FAME ekstrakt og 0,2 ml 3-pyridinmethanol til 0,1 ml opløsning fremstillet i trin 5.2.
- Opvarm opløsningen ved 40 ° C i 30 minutter i en lukket hætteglas.
- Efter afkøling til stuetemperatur, tilsæt renset deioniseret vand (2 ml, se Materialer tabel) og hexan (4 ml). Bland med en vortex, tillade fase at separere, og indsamle den organiske fase.
- Dry det ved at tilføje vandfrit natriumsulfat, indtil den organiske fase er fuldstændig klar. Overfør det til en rent rør. Derefter inddampes til 200 pi. Overfør prøven i en GC hætteglas med indsats.
6. DMOX Forberedelse fra FAME 17
- Inddamp FAME ekstrakt fra afdeling 3 med en strøm af nitrogen (mindst 10 mg tørt materiale).
- Til FAME tørstof, tilsættes 250 mg 2-amino-2-methyl-1-propanol. Skyl beholderen med nitrogen, tilføje en prop, og læg den i en varmeblok natten over ved 190 ° C.
- Efter afkøling til stuetemperatur, tilsættes 3 ml dichlormethan til røret, og 5 ml renset demineraliseret vand (se Materialer tabel).
- Ryst for faseadskillelse og derefter fjerne den vandige fase.
- Den organiske fase vaskes med 5 ml vand. Ryst for faseadskillelse og derefter fjerne den vandige fase.
- Tør ved tilsætning vandfrit natriumsulfat, indtil den organiske fase er fuldstændig klar ogoverføre det til et rent rør. Der inddampes under en strøm af nitrogen, indtil det når et volumen på 200 pi. Overfør prøven i en GC hætteglas med indsats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Strategien med FA identifikation fra bakterieceller er præsenteret i figur 1. Hvert trin giver supplerende spektral information eller oplysninger om kromatografisk fastholdelse. Trin 1 består af foreløbig FA identifikation ved hjælp af en standard løsning. Trin 2 giver mulighed for fortolkning af FAME EI spektre og deres ECL, for at forsøgsvis identifikation af produkterne. Trin 3 identificerer den nøjagtige forgrening placering i forgrenet-FA'er. Endelig trin 4 identificerer den nøjagtige position af dobbeltbindinger i umættede FA'er.
FAME og ECL
Den BAME blandingen lov os at identificere en række ligekædede mættede fedtsyrer (n12 på N17) og nogle methyl forgrenede fedtsyrer (I15, a15, I16, I17). Meget få FA'er specifik for B. cereus, blev imidlertid påvist i vores stikprøve, der begrunder den udvikpment af identifikation, der er beskrevet nedenfor.
Uanset kædelængde, forgrenet mættet FA'er (iso eller anteiso) af en homolog række (dvs. en række forbindelser med den samme almene formel) vise et konstant skift i ECL sammenlignet med den lige mættet FA har det samme antal af kulstof i deres carbon-kæde. Dette skift, kaldet fraktioneret kædelængde (FCL), giver mulighed for identifikation af FA'er i en homolog serie. For eksempel iso-FA'er (betegnet med præfikset "i") har en FCL værdi på -0,48, mens anteiso FA'er (betegnet med præfikset "a") har en FCL af -0,33. Det er derefter let at identificere en I14 og I13 med en ECL af 13,52 og 12,52 henholdsvis og et A13 og A15 med en ECL af 12,67 og 14,66 henholdsvis.
Tabel 1 viser de ECLs for hver af de FA'er påvist i vores prøve. Retentionstider forudsigeed for iso og anteiso serie sammen med MS-spektre opnået med FAME'er, tilladt os at identificere alle de forgrenede-FA fra vores prøve. En sådan identifikation på dette trin var foreløbig, men senere bekræftet af EI spektre opnået fra picolinyl FA'er derivater.
FAME'er med ECLs som ikke svarer til iso eller anteiso skift er umættet, ligekædet eller forgrenet FA'er, som indikeret ved massen af deres molekylære ion. Umættede FA'er viser en positiv forskydning i ECL sammenlignet med den tilsvarende mættede FA. Spectra fra DMOX derivater, kombineret med spektre fra picolinyl derivat for forgrenet FA'er, give mulighed for at identificere dobbeltbindingen position.
Sådanne derivatisering metoder er passende for FA identifikation, når eluering ordre bevares, som vist for de tre afledte blandinger (dvs. FAME, DMOX og picolinyl) i figur2 for flere 16: 1 FA'er. Denne fremgangsmåde muliggør indsamling af supplerende spektral information af én top med 3 derivatisering metoder, der kan kombineres til at identificere FA struktur. Der blev ikke observeret forskelle i elueringsrækkefølge mellem de 3-derivater, skønt retentionstider og ovntemperaturer var forskellige.
Picolinyl estere af iso og anteiso methyl forgrenet mættet fedtsyre
Opnået ved EI spektre bekræfte tilstedeværelsen af methyl forgrenede FA'er. Faktisk er de molekylære ioner har m / z svarende til mættede FA'er. Vi observerede en ion serie med et mellemrum på 14 masseenheder (AMU) svarende til et tab af en methylengruppe, undtagen i området ved forgreningspunkt hvor mangler ion svarende til det substituerede carbonatom. Vi derefter observere en afstand på 28 amu mellem de to ioner, der svarer til fragmenter skabt før ogefter den forgrenede carbon. Figur 3 viser spektret for I16 med de diagnostiske ioner (304 og 332), der viser forgrening placering.
DMOX af ligekædede umættede fedtsyrer
Figur 2 viser fem forskellige toppe er forbundet med 16: 1-fedtsyre. De første to toppe har ECL værdier <16. Vi konkluderer, at deres struktur sikkert er forgrenet. Identifikationen af disse forbindelser kræver fortolkning af masse spektre produceret af DMOX og picolinyl esterderivater. Tre toppe besidder ECL> 16 match monoumættet ligekædede fedtsyrer. DMOX afledte massespektre viser diagnostiske ioner identificerer positionen af dobbeltbindingen af disse forbindelser. I figur 4 kan vi se et mellemrum på 12 amu ion mellem 196 og 208 indikerer tilstedeværelse af dobbeltbindingen med kulstof 8 n16: 1 Δ
DMOX og picolinyl massespektre af methyl forgrenet monounsatured fedtsyrer
Figur 6 viser spektre af DMOX og picolinyl esterderivater, der anvendes til at bestemme strukturen af I16: 1 Δ 9 FA. Positionen afforgrening angives med et mellemrum på 28 amu for begge derivater. En forskel på 12 amu for DMOX og 26 for picolinyl ester identificerer dobbeltbindingen position, som vist i figur 6.
Identifikation af fedtsyrer og diagnostiske ioner
Tabel 1 viser de forskellige fedtsyrer identificeret, med de tilsvarende diagnostiske ioner, i Bacillus cereus ATCC 14579 dyrket ved 30 ° C. Disse diagnostiske ioner identificere positionerne af methyl forgrening og dobbeltbindinger på carbonkæden for DMOX og picolinyl esterderivater, som giver supplerende strukturelle information. De to tilgange er virkelig komplementære, som diagnostiske ioner er nogle gange lettere at observere med DMOX derivater, og andre gange lettere at observere med picolinyl derivater.
src = "/ files / ftp_upload / 54.960 / 54960fig1.jpg" />
Figur 1: Strategi for identifikation af fedtsyrer i Bacillus cereus.
vises De forskellige trin genererer oplysninger om opholdstider (ECL), på masse spektre af FAME, af DMOX og af picolinyl-ester. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Sammenligning af kromatografiske profiler for forskellige 16: 1 fedtsyrer opdaget i Bacillus cereus.
(A) FAME derivater (molekylær ion ekstraheret ved m / z 268); (B) DMOX derivater (molekylær ion ekstraheret ved m / z 307); (C) picolinyl derivater (molekylær ion ekstraheret ved m / z 345).Iles / ftp_upload / 54.960 / 54960fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: I16 picolinyl derivat massespektrum genereret af elektron ionisering.
Ioner ved m / z 151 og m / z 164 indikere tilstedeværelsen en picolinyl derivat af fedtsyre. Den molekylære ion ved m / z 347, identificeres som en isomer af palmitinsyre. Tilstedeværelsen af et mellemrum på 28 amu mellem ionen ved m / z 304 og m / z 332 er indikativ for I16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: n16: 1 Δ 8 DMOX derivat massespektrum genereret af elektronionisering.
Ionen ved m / z 126 indikerer en DMOX derivat, m / z 307 er den molekylære ion af 16: 1 DMOX og tilstedeværelsen af et mellemrum på 12 amu mellem ionerne ved m / z 196 og m / z 208 identificerer placeringen af dobbeltbinding på carbon 8. klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: n16: 1 Δ 5 DMOX derivat massespektrum genereret af elektron ionisering.
Ion ved m / z 126 er indikativ for en DMOX derivat og m / z 307 er den molekylære ion af 16: 1 DMOX. Den intense m / z 153 ion er karakteristisk for en dobbeltbinding placeret på carbon 5. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: DMOX (øverst) og picolinyl (nederst) sammenligning af I16: 1Δ 9 spektre.
I begge tilfælde forskellen på 28 amu indikerer positionen af methyl forgrening. Den dobbeltbinding placering kan udledes af et hul på 12 amu og 26 amu for DMOX og picolinyl derivater hhv. Klik her for at se en større version af dette tal.
| formodede forbindelser | Molekylion (m / z) FAME; DMOX; picolinyl | RT | ECL | bekræftet identifikation | Diagnostiske ioner DMOX | Diagnostiske ioner picolinyl |
| I12 | 214, 253; 291 | 7,93 | ingen reference | I12 | [276 (15); 262 (0); 248 (15)] mb | |
| n12 | 214, 253; 291 | 8,21 | 12.00 | n12 | [276 (10); 262 (20); 248 (20)] mb | |
| I13 | 228; 267; 305 | 8,53 | 12.5 | I13 | [290 (15); 276 (0); 262 (48)] mb | |
| A13 | 228; 267; 305 | 8,64 | 12,67 | A13 | [276 (48); 262 (0); 248 (65)] mb | |
| I14 | 242, 281; 319 | 9.24 | 13,52 | I14 | [304 (20); 276 (45) 290 (0)] mb | |
| N14 | 242, 281; 319 | 9.60 | 14.00 | N14 | [304 (7); 290 (17); 276 (17)] mb | |
| I15 | 256, 295; 333 | 10.06 | 14,51 | I15 | [318 (20); 314 (0); 290 (50)] mb | |
| a15 | 256, 295; 333 | 10.19 | 14,66 | a15 | [304 (30); 290 (st); 276 (62)] mb | |
| N15 | 256, 295; 333 | 10,49 | 15.00 | N15 | [318 (5); 304 (13); 290 (18)] mb | |
| I16 | 270; 309; 347 | 11.04 | 15.5 | I16 | [332 (18); 318 (st); 304 (42)] mb | |
| methyl forgrenet 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.19 | 15,64 | I16: 1Δ 5 | [152 (2); 153 (10)] db [292 (3); 278 (st); 264 (2)] mb | |
| methyl forgrenet 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.40 | 15,83 | I16: 1 Δ 9 | [210 (3); 222 (3)] db [292 (12); 278 (st); 264 (40)] mb | |
| N16 | 270; 309; 347 | 11,59 | 16.00 | N16 | [332 (5); 318 (15); 304 (15)] mb | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.78 | 16.14 | N16: 1 Δ 5 | [152 (2); 153 (10)] db | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.94 | 16,24 | N16: 1 Δ 8 | [196 (5); 208 (3)] db | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 12.00 | 16,31 | N16: 1Δ 9 | [210 (3); 222 (3)] Db | |
| 16: 2 | 266; 305; 343 | 12.18 | 16,44 | N16: 2 Δ 5, Δ 9 | [152 (2); 153 (12)] db [208 (1); 220 (2)] db | |
| I17 | 284, 323; 361 | 12.25 | 16,5 | I17 | [346 (20); 332 (st); 318 (35)] mb | |
| methyl forgrenet 17: 1 | 282, 321; 359 | 12.43 | 16.64 | I17: 1Δ 5 | [152 (2); 153 (10)] db | [344 (10); 316 (5)] mb |
| A17 | 284, 323; 361 | 12.47 | 16,66 | A17 | [332 (30); 318 (0); 304 (52)] mb | |
| methyl forgrenet 17: 1 | 282, 321; 359 | 12,57 | 16,74 | I17: 1Δ 8 | [196 (2); 208 (2)] db | [344 (10); 316 (5)] mb |
| methyl forgrenet 17: 1 | 282, 321; 359 | 12,64 | 16,79 | I17: 1Δ 9 | [210 (3); 222 (3)] db | |
| methyl forgrenet 17: 1 | 282, 321; 359 | 12,70 | 16,84 | I17: 1Δ 10 | [224 (1); 236 (1)] db | |
| methyl forgrenet 17: 1 | 282, 321; 359 | 12,84 | 16,94 | A17: 1Δ 9 | [210 (3); 222 (4)] db | [330 (10); 316 (0); (90)] mb |
Tabel 1: Identifikation af fedtsyrer fra Bacillus cereus ATCC 14579.
Retentionstider svarende kædelængde (ECL) værdier, og molekylære ioner til methylesterolier (fames) er vist, sammen med molekylære ioner og diagnostiske ioner for DMOX og picolinyl derivater.
[] Mb diagnostisk ionpar indikerer et tab på 28 amu, svarende til fragment før og efter carbon forgrening.
[] Db diagnostisk ionpar indikerer et tab på 12 amu svarende til spaltning af en dobbeltbinding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fas chromatogramprofiler vist i tabel 1, svarer til B. cereus ATCC 14579 dyrket på en agarplade overflade. Lignende profiler blev opnået, når bakterien blev dyrket i beluftet væske medier ved den samme temperatur 8. I tilfælde af bakterier dyrket i flydende medier, er den bakterielle biomasse opsamlet ved centrifugering af vækstmediet og kan vaskes i overensstemmelse med tidligere beskrevne protokoller afhængigt af vækstbetingelser 8,19. Identifikationen af de forskellige FA'er produceret af B. cereus tilladt fine ændringer i den del af FA'er skal detekteres i stammer muteret på nogle gener, der er nødvendige for vækst ved lav temperatur 7,9.
Normalt er ECL beregnes ved hjælp logaritmiske værdier af den justerede retentionstid bestemmes ved en fast temperatur (ved hjælp af en ovn med isotermisk temperatur kontrol) 20. Her, på grund af anvendelsen af en ikke-isotermisk ovn til permit en optimeret adskillelse af FAME af interesse, den beregningsmetode blev der tidligere er beskrevet for lineære fastholdelse indeks 3,21.
Formålet med dette arbejde var ikke at sammenligne de beregnede ECL værdier med de beskrevet i litteraturen, men at forudsige FA struktur, inden for samme kromatogram profil, på grundlag af disse retentionsdata og spektre information. Ja, for mættede FA'er, en given forgrening (iso eller anteiso) altid forårsager samme skift i ECL, sammenlignet med den tilsvarende ligekædede FA. Desuden ECL beregnet i nærværende undersøgelse matches med værdier målt af Stransky 22 på en søjle af tilsvarende polaritet. Denne sammenfald med tidligere rapporterede værdier indikerer, at ECL værdier er derfor meget nyttigt for en hurtig identifikation af toppene fra FA'er chromatogramprofiler af B. cereus dyrket i andre forhold, eller andre stammer (f.eks., Mutanter) af B. cereus.
Picolinyl derivater give flere karakteristiske ioner indikerer det forgrenings placering end ioner genereret af DMOX derivater, mens positionen af dobbeltbindingen er mere nemt tilknyttes med DMOX derivater. Den foreliggende undersøgelse viser nytten af at kombinere information fra begge derivater til at identificere methyl forgrenede umættede FA'er fra B. cereus, der hidtil er blevet dårligt beskrevet i litteraturen.
jove_content "> kan Den foreslåede tilgang være afsluttet inden for 2 dage. Til sammenligning til NMR spektroskopi, bør hver FA renses, repræsenterer flere ugers arbejde og en stor mængde biologisk materiale. Men den tilgang ikke differentiere geometri ( cis, trans) af dobbeltbindinger. Når hver FA er identificeret, kan de rutinemæssigt kvantificeres ved deres berømmelse derivater, fx at sammenligne bakteriestammer og mutanter eller at undersøge virkningen af vækstbetingelser. i vores hænder, så lidt som 8 mg af friske bakterieceller var tilstrækkelige til kvantificering af FA'er, hvilket gør fremgangsmåden anvendes på vanskeligt at dyrke bakterier. kvantificeringsgrænsen for hver af de identificerede FA'er er 1 ng / pl opløsning injiceret i GC / MS.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfattere er taknemmelige for Thomas Mison for hans tekniske support, og Rachel Kopec for revision af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
References
- Christie, W. W., Han, X. Lipid Analysis 4th Edition. , Oily press. (2010).
- HÜbschmann, H. -J. Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition. , Wiley-vch. (2015).
- Sasser, M. Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids. MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).
- Spitzer, V. Structure analysis of fatty acids by gas chromatography - Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives - A review. Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).
- Harvey, D. J. Advances in lipid methodology. Volume 1. Christie, W. W. , Oily press. Dundee. 19-80 (1992).
- Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebretière, M. -H., Broussolle, V., Brillard, J. Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation. Front Microbiol. 6, (2015).
- Brillard, J., et al. Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).
- de Sarrau, B., et al. Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties. Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).
- Diomandé, S. E., et al. Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth. Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).
- Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P. Applications and Systematics of Bacillus and Relatives. Berkeley, R. C. W. , Blackwell Science Publ. 1-7 (2002).
- Kämpfer, P. Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species. System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).
- Kaneda, T. Fatty-acids of genus bacillus - example of branched-chain preference. Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).
- Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).
- Sasser, M., et al. Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters. J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).
- Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities. Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).
- Destaillats, F., Angers, P. One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids. J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).
- Fay, L., Richli, U. Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization. J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).
- Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids. Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).
- de Sarrau, B., et al. Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions. Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).
- Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters. Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).
- van Den Dool, H., Kratz, P. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).
- Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids. J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).
