Abstract
As espécies de Bacillus contêm cadeia ramificada e ácidos graxos insaturados (FAS), com diversas posições do ramo de metilo (ISO ou anteiso) e da ligação dupla. Alterações na composição da FA desempenha um papel crucial na adaptação de bactérias ao seu ambiente. Estas modificações implicar uma mudança na proporção de iso contra anteiso ramificada CC, e na proporção de CC insaturado em relação ao FAS saturado, com ligações duplas em posições específicas criadas. Identificação precisa do perfil FA é necessário compreender os mecanismos de adaptação de espécies de Bacillus.
Muitas das FAs de Bacillus não estão comercialmente disponíveis. A estratégia aqui proposto identifica CC através da combinação de informação sobre o tempo de retenção (por cálculo do comprimento de cadeia equivalente (ECL)) com o espectro de massa de três tipos de derivados FA: ésteres metílicos de ácido gordo (FAMEs), 4,4-dimetil-oxazolina derivados (DMOX), eéster de 3-pyridylcarbinyl (picolinilo). Este método pode identificar os CC sem a necessidade de purificar o CC desconhecido.
Comparando os perfis cromatográficos de FAME preparado a partir de Bacillus cereus com uma mistura comercial de padrões permite a identificação de cadeia linear-CC, o cálculo da ECL, e saturada hipóteses sobre a identidade da outra FAs. FAMEs saturado ramificado de CC, iso ou anteiso, exibir uma mudança negativa constante no ECL, em comparação ao FAS lineares saturados com o mesmo número de carbonos. FAMEs do FAS insaturado pode ser detectada pela massa dos seus iões moleculares, e conduzir a uma mudança positiva na LCE em relação ao FAS saturados correspondentes.
A posição de ramificação de AF e a posição da ligação dupla CC insaturado pode ser identificado por espectros de massa de ionização de electrões de derivados de picolinilo e DMOX, respectivamente. Esta abordagem identifica todo o ramo saturado desconhecidoed FAs, insaturados de cadeia linear FAs e AF ramificados insaturados a partir do extrato de B. cereus.
Introduction
cromatografia de ácido gordo metil éster (FAME) gasosa (GC) é um método essencial para a caracterização de lípidos. Ele separa rapidamente e quantifica os vários ácidos gordos (FAS) de uma amostra após um curto passo de extracção. Os derivados de ésteres de metilo são altamente voláteis, estável e inerte no sentido da coluna cromatográfica, evitando desse modo os picos de decantação. A sua identificação é bastante simples quando a amostra é constituída por FAs bem conhecidas porque os perfis cromatográficos são publicados nem em relação aos padrões. Além disso, a injecção repetida de padrões de calibração para a quantificação de diferentes FAs não é necessário, devido à sua resposta quase constante para a detecção de ionização de chama (FID) 1.
Além FID, espectrometria de massa de detecção (MS) fornece um conjunto complementar de informações para confirmar FAMEs. No entanto, quando EMAGs são cobrados através de ionização de elétrons (EI), os espectros resultantes nem sempre permitem the identificação de estrutura fina FA. Por exemplo, a posição de ramificação (isto é, um grupo metilo ramificado) é difícil prever porque os iões de diagnóstico são difíceis de detectar uma característica e a alteração na abundância de iões alvo é dependente da máquina, evitando a utilização de espectros de massa bibliotecas 2. Outro desafio está em identificar a posição ligação dupla porque EI provoca a migração ligação dupla. Assim, isómeros FA com diferentes posições de ligação dupla não pode ser diferenciados pelo seu espectro de massa. Felizmente, outras ferramentas têm sido desenvolvidos para a identificação FA. Por exemplo, a presença e a posição de ramificação ou de ligações duplas em FAs pode ser conjecturado calculando o comprimento de cadeia equivalente (ECL) 3.
Outros métodos de derivatização resultar em diferentes espectros de massa, dependente da localização de uma ligação dupla ou um grupo metilo ramificado. 4,4-dimetil derivados oxazolina (DMOX) 4 permitem easY identificação da posição das ligações duplas de ácidos gordos monoinsaturados. 3-pyridylcarbinyl éster (éster picolinil) derivados de permitir uma identificação inequívoca da localização de metilo ramificado CC 5. Combinando retenção cromatográfica (ECL) e espectro de massa (DMOX e picolinil) informação permite a identificação da maioria dos CC sem a necessidade de utilizar métodos de complexos de purificação, tal como exigido para a ressonância magnética nuclear (RMN) do espectro, o método incontestável para a caracterização estrutural 1 .
As bactérias do gênero Bacillus, que incluem alguns patógenos humanos e animais, são capazes de colonizar muito diversos nichos e são, portanto, amplamente distribuído no ambiente 6. Entre o género Bacillus, a composição de FA é influenciada pela nicho ecológico das espécies com modulações nos padrões de FA para se adaptar a uma vasta gama de mudanças ambientais (por exemplo, meio de crescimento, temperatura,pH, etc.) 7-9. Devido à relativa homogeneidade do padrão de FA em várias espécies do género Bacillus durante o crescimento em condições padronizadas, a determinação da composição de FA é um dos critérios essenciais utilizados para definir as espécies de Bacillus. Um atributo exclusivo do gênero Bacillus é a abundância de FAs de cadeia ramificada contendo 12-17 carbonos 10-12 com a relação entre a ISO e Anteiso isômeros sendo um factor determinante da adaptação às condições ambientais. As espécies de Bacillus também adaptar-se a variações ambientais, alterando a proporção de ácidos gordos insaturados. Em algumas espécies, tais como Bacillus cereus, duas dessaturases ácidos graxos criar ligações duplas em diferentes posições da cadeia de alquilo 13 com diferentes papéis na adaptação 9. O exemplo do género Bacillus ilustra a importância de identificar precisamente a posição da ligação dupla e FA ramificação. coletarvamente, a identificação de padrões de Bacillus FA tem várias aplicações úteis. Aqui, nós propomos uma nova abordagem GC-MS para Bacillus FA identificação padrão que supera as limitações inerentes de uma análise de GC-MS clássica.
Esta abordagem inovadora pode ser utilizado directamente no material biológico em bruto, e é composto de uma combinação de técnicas existentes: informações sobre os tempos de retenção (ECL) e espectros de massa de derivados de diferentes FAs (FAME, DMOX e éster-picolinil).
Nós usamos a seguinte FA nomenclatura. I, A, e n indicam iso, Anteiso metil ramificada, e ácido gordo de cadeia linear, respectivamente. CC insaturadas foram nomeados por C: d em que C é o número de átomos de carbono no ácido gordo e d é o número de ligações duplas. Δ x indica a posição da ligação dupla, em que a ligação dupla está localizada na ligação carbono-carbono Xth, contando a partir da extremidade de ácido carboxílico.
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Protocol
1. As culturas bacterianas
- Prepara-se uma grama de bactérias (Bacillus cereus ATCC 14579) estirpe espalhando 100 jil de uma cultura de uma noite da estirpe incubada a 30 ° C em meio LB (meio de Luria-Bertani), sobre a superfície de uma placa de meio LB com agar. Incubar a placa durante a noite a 30 ° C.
2. ECL: Comprimento Cadeia Equivalent
- Calcular ECL como se segue:
com:
i, o soluto de interesse;
n, o número de carbono do éster de metilo de ácido gordo de cadeia linear saturado eluindo antes soluto I;
N + 1, o número de carbono do éster de metilo de ácido gordo saturado de cadeia linear eluindo depois de soluto I;
Rti, Rtn, Rt (n + 1) os tempos de retenção dos picos de FAME descritos acima.
NOTA: obter os tempos de retenção dos ésteres de ácidos gordos saturados de cadeia reta metilo por injecção de uma mistura de padrões (BAME).
com: 3. FAME Preparação e Análise
- De forma a obter ácidos gordos de lípidos, células bacterianas colheita por raspagem das colónias das placas de agar e transferir 40 mg (peso fresco, equivalente a 10 células viáveis 9) de bactérias dentro de um tubo de vidro de 10 ml com tampas de rosca e vedantes de PTFE.
- Execute transesterificação via o éster método de ligação 14,15 detalhado abaixo.
- Adicionar 5 ml de 0,2 M de KOH em metanol às células bacterianas frescas e incubar a 37 ° C durante 1 h. Esta reacção consiste em metanólise alcalina, quebrar a ligação éster no lípido e a produção de ésteres metílicos de ácidos gordos.
- Adicionar 1 ml de ácido acético a 1 M para baixar o pH para 7,0. Verificar o pH com tiras de teste de pH.
- Adicionar 3 ml de hexano para extrair FAMEs.
- Transferir o sobrenadante (fase orgânica) para tubos limpos e concentra-se por evaporação à temperatura ambiente, sob um fluxo contínuo de azoto para se obter cerca de 200 ulde extrato. Transferir a amostra para um frasco de GC com inserção.
- Injetar extratos em uma espectrometria de cromatografia de massa de gás do sistema (GC-MS).
4. GC / Condições MS
- Injectar as amostras FAME para um instrumento de GC-MS equipado com uma coluna capilar ZB-WAX (comprimento, 30 m; diâmetro, 0,25 mm, espessura do filme, 0,25 um).
- Definir a porta de injecção (no modo de splitless) temperatura a 250 ° C. Use hélio como um gás de transporte, com uma velocidade linear de 37 cm / seg. Mantenha a temperatura do forno a 50 ° C durante 1 min, aumentar para 190 ° C a uma velocidade de 20 ° C / min, e aumentar ainda mais a uma temperatura final de 230 ° C a uma velocidade de 2 ° C / min.
- Para a MS, gravar os espectros de massa por ionização de electrão (El) a 70 eV, e definir a aquisição da corrente iónica total entre 50 e 400 unidades de massa atómica (amu) (2 leituras / seg).
- Quando necessário, injetar derivados DMOX e picolinil sob a mesma condição except o programa de temperatura do forno como se segue:
DMOX: 50 ° C (1 min), 20 ° C / min até 210 ° C e 2 ° C / min até 240 ° C (5 min);
Picolinilo: 6 ° C (1 min), 20 ° C / min até 220 ° C e 2 ° C / min até 250 ° C (20 min).
5. Preparação de éster picolinilo 16 FAME
- Evapora-se o extracto de FAME da secção 3 com um fluxo de azoto (pelo menos 10 mg de material seco) e dissolver em 1 ml de diclorometano seco.
- Prepara-se uma solução 1,0 M de ter-butóxido de potássio t em tetra-hidrofurano.
- Adicione o extrato de FAME e 0,2 ml de 3 piridinametanol a 0,1 ml de solução efectuadas no passo 5.2.
- Aquece-se a solução a 40 ° C durante 30 minutos num frasco fechado.
- Após arrefecimento até à temperatura ambiente, adicionar água purificada desionizada (2 ml, ver Tabela Materiais) e hexano (4 ml). Misturar com um vórtice, permitir fase para separar e recolher a fase orgânica.
- Dry-lo por adição de sulfato de sódio anidro, até a fase orgânica é perfeitamente claro. Transferi-lo para um tubo limpo. Em seguida, evapora-se a 200 ul. Transferir a amostra para um frasco de GC com inserção.
6. Preparação de FAME DMOX 17
- Evapora-se o extracto de FAME da secção 3 com um fluxo de azoto (material seco de pelo menos 10 mg).
- Ao extracto seco FAME, adicionar 250 mg de 2-amino-2-metil-1-propanol. Lavar o reactor com azoto, adicionar uma rolha, e colocá-lo em um bloco de aquecimento durante a noite a 190 ° C.
- Após arrefecimento até à temperatura ambiente, adicionar 3 ml de diclorometano para o tubo, e 5 ml de água purificada desionizada (Ver Tabela Materiais).
- Agitar por separação de fases e em seguida, remover a fase aquosa.
- Lava-se a fase orgânica com 5 ml de água. Agitar por separação de fases e em seguida, remover a fase aquosa.
- Seco por adição de sulfato de sódio anidro, até a fase orgânica é perfeitamente clara etransferi-lo para um tubo limpo. Evapora-se sob uma corrente de azoto até atingir um volume de 200 ul. Transferir a amostra para um frasco de GC com inserção.
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Representative Results
A estratégia de identificação FA a partir de células bacterianas é apresentado na Figura 1. Cada etapa fornece informações espectrais complementar ou informações sobre retenção cromatográfica. Passo 1 consiste de identificação preliminar FA usando uma solução padrão. Passo 2 permite a interpretação de espectros EI FAME e sua ECL, de forma a identificar os produtos tentativamente. Passo 3 identifica a localização exata de ramificação em cadeia ramificada-FAs. Finalmente, o passo 4 identifica a posição precisa de ligações duplas em FAs insaturado.
FAME e ECL
A mistura BAME nos permitiu identificar uma série de ácidos graxos saturados de cadeia linear (n12 a n17) e alguns metil ramificada ácidos graxos (i15, a15, i16, i17). No entanto, muito poucos específica FAs de B. cereus foram detectadas em nossa amostra, justificando o desenvolvimento do método de identificação descrito abaixo.
CC independentemente do comprimento da cadeia, saturado ramificado (iso ou anteiso) de uma série homóloga (ou seja, uma série de compostos com a mesma fórmula geral) exibir um desvio constante em ECL em comparação com a FA saturados de cadeia linear tendo o mesmo número de carbono na sua -cadeia de carbono. Este deslocamento, chamado comprimento de cadeia fraccionada (FCL), permite a identificação das FAs numa série homóloga. Por exemplo, o iso-CC (denotado com o prefixo "i") tem um valor de FCL -0,48, enquanto anteiso CC (assinalados com o prefixo "a") tem um FCL de -0,33. É então fácil de identificar um i14 i13 e com um ECL de 13,52 e 12,52, respectivamente, e um A13 e A15 com um ECL de 12,67 e 14,66, respectivamente.
A Tabela 1 apresenta os ECLS para cada uma das FAs detectado em nossa amostra. Os tempos de retenção prevered para iso e anteiso série, juntamente com MS espectros obtidos com EMAGs, permitiu-nos identificar toda a cadeia ramificada-FA da nossa amostra. Essa identificação nesta etapa foi hesitante, mas mais tarde confirmada por espectros de EI obtido a partir picolinil derivados SAF.
FAMEs com ECLs não correspondentes à iso ou anteiso deslocamentos são insaturados, de cadeia linear ou ramificada, CC, como indicado pela massa do seu ião molecular. CC insaturadas mostram uma mudança positiva na ECL, em comparação com o correspondente AG saturados. Os espectros de derivados DMOX, combinados com os espectros de derivado de picolinilo para FAs ramificada, permitem a identificação da posição da ligação dupla.
Tais métodos de derivatização são adequadas para a identificação apenas quando FA ordem de eluição é retida, como se mostra para as três misturas derivadas (ou seja, FAME, DMOX e picolinil) na Figura2 para vários 16: 1 FAs. Esta abordagem permite a recolha da informação espectral complementar de um pico 3 usando métodos de derivatização que podem ser combinados para identificar estrutura FA. Não foram observadas diferenças na ordem de eluição entre os derivados de 3, embora os tempos de retenção e as temperaturas do forno foram diferentes.
ésteres picolinil de iso e anteiso ácido graxo metil-cadeia ramificada saturada
O espectro obtido pela EI confirmar a presença de metilo FAS-cadeia ramificada. Com efeito, os iões moleculares têm a m / z correspondente à FAS saturados. Observou-se uma série de iões com uma diferença de 14 unidades de massa (amu) correspondendo a uma perda de um grupo metileno, excepto na região do ponto de ramificação onde o ião correspondente ao átomo de carbono substituído está ausente. Nós, então, observar uma diferença de 28 amu entre os dois íons correspondentes aos fragmentos criado antes eapós o carbono ramificada. A Figura 3 mostra o espectro de I16 com os iões de diagnóstico (304 e 332) que mostra a localização de ramificação.
DMOX de ácidos gordos insaturados de cadeia linear
A Figura 2 apresenta cinco picos diferentes associados com a 16: 1 de ácido gordo. Os dois primeiros picos têm valores ECL <16. Conclui-se que a sua estrutura é certamente ramificada. A identificação destes compostos requer a interpretação de espectros de massa produzidos por DMOX e derivados de éster de picolinilo. Três picos possuindo ECL> 16 jogo ácidos graxos monoinsaturados de cadeia linear. DMOX espectros de massa de derivados mostram iões de diagnóstico para identificar a posição da dupla ligação destes compostos. Na Figura 4 podemos ver uma lacuna de 12 amu iónica entre 196 e 208, indicando a presença da ligação dupla com o carbono 8 do n16: 1 Δ
DMOX massa e espectros de picolinilo metil-cadeia ramificada monounsatured ácidos gordos
A Figura 6 apresenta os espectros de DMOX e derivados de éster de picolinilo, utilizados para determinar a estrutura de I16: 1 Δ 9 FA. A posição doramificação é indicado por um intervalo de 28 amu para ambos os derivados. Uma diferença de 12 u para DMOX e 26 de éster de picolinilo identifica a posição da ligação dupla, como se mostra na Figura 6.
Identificação dos ácidos gordos e os iões de diagnóstico
A Tabela 1 mostra os vários ácidos gordos identificados, com os iões de diagnóstico correspondente, em Bacillus cereus ATCC 14579 cultivadas a 30 ° C. Estes iões de identificar as posições da ramificação de metilo e ligações duplas na cadeia de carbono para os derivados de éster e DMOX picolinilo, que fornecem informação estrutural complementar. As duas abordagens são realmente complementares, como íons de diagnóstico são, por vezes mais fácil de observar com derivativos DMOX, e em outras vezes mais fácil de observar com derivativos picolinil.
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Figura 1: Estratégia para a identificação de ácidos gordos em Bacillus cereus.
As etapas sucessivas gerando informações sobre tempos de retenção (ECL), no espectro de massa de FAME, do DMOX e de picolinil-éster são mostrados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Comparação dos perfis cromatográficos diferentes para 16: 1 ácidos gordos detectados em Bacillus cereus.
(A) derivados de FAME (ião molecular extraído a m / z 268); (B) derivados DMOX (ião molecular extraído a m / z 307); (C) derivados de picolinil (ião molecular extraído a m / z 345).iles / ftp_upload / 54960 / 54960fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Espectro de massa de derivado de picolinilo i16 gerado pela ionização de electrões.
Os iões em m / z 151 e m / z 164 indica a presença de um derivado de ácido gordo de picolinilo. O ião molecular para m / z 347 é identificado como um isómero de ácido palmítico. A presença de um intervalo de 28 amu entre o ião a m / z 304 e m / z 332 é indicativa de i16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: N16: 1 Δ 8 DMOX derivado de espectro de massa gerados por electrõesionização.
O ião a m / z 126 indica um derivado DMOX, m / z 307 é o ião molecular de 16: 1 DMOX e a presença de uma diferença de 12 u entre os iões a m / z 196 e m / z 208 identifica a localização de dupla ligação de carbono 8. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: N16: 1 Δ 5 DMOX espectro de massa por ionização derivado gerado electrões.
Ião a m / z 126 é indicativa de um derivado DMOX e m / z 307 é o ião molecular de 16: 1 DMOX. O m intensa / z 153 ion é característica de uma ligação dupla localizada no carbono 5. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: DMOX (topo) e picolinil (inferior) comparação de I16: 1Δ 9 espectros.
Em ambos os casos, o intervalo de 28 amu indica a posição da ramificação metilo. A localização ligação dupla pode ser obtido por um intervalo de 12 amu e 26 amu para derivativos DMOX e picolinil, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| compostos putativos | ião Molecular (m / z) FAME; DMOX; picolinil | RT | ECL | identificação confirmada | iões de diagnóstico DMOX | iões de diagnóstico picolinil |
| i12 | 214; 253; 291 | 7,93 | nenhuma referência | i12 | [276 (15); 262 (0); 248 (15)] mb | |
| n12 | 214; 253; 291 | 8,21 | 12.00 | n12 | [276 (10); 262 (20); 248 (20)] MB | |
| i13 | 228; 267; 305 | 8,53 | 12,5 | i13 | [290 (15); 276 (0); 262 (48)] mb | |
| a13 | 228; 267; 305 | 8,64 | 12,67 | a13 | [276 (48); 262 (0); 248 (65)] MB | |
| i14 | 242; 281; 319 | 9,24 | 13,52 | i14 | [304 (20); 276 (45) 290 (0)] mb | |
| n14 | 242; 281; 319 | 9,60 | 14.00 | n14 | [304 (7); 290 (17); 276 (17)] MB | |
| i15 | 256; 295; 333 | 10,06 | 14.51 | i15 | [318 (20); 314 (0); 290 (50)] MB | |
| a15 | 256; 295; 333 | 10,19 | 14.66 | a15 | [304 (30); 290 (TR); 276 (62)] MB | |
| n15 | 256; 295; 333 | 10,49 | 15.00 | n15 | [318 (5); 304 (13); 290 (18)] mb | |
| i16 | 270; 309; 347 | 11,04 | 15,5 | i16 | [332 (18); 318 (TR); 304 (42)] MB | |
| metilo ramificado 16: 1 | 268; 307; 345 | 11,19 | 15,64 | i16: 1Δ 5 | [152 (2); 153 (10)] db [292 (3); 278 (TR); 264 (2)] MB | |
| metilo ramificado 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.40 | 15,83 | I16: 1 9 Δ | [210 (3); 222 (3)] db [292 (12); 278 (TR); 264 (40)] MB | |
| n16 | 270; 309; 347 | 11,59 | 16.00 | n16 | [332 (5); 318 (15); 304 (15)] mb | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11,78 | 16,14 | N16: 1 5 Δ | [152 (2); 153 (10)] dB | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11,94 | 16,24 | N16: 1 8 Δ | [196 (5); 208 (3)] dB | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 12.00 | 16,31 | n16: 1Δ 9 | [210 (3); 222 (3)] Db | |
| 16: 2 | 266; 305; 343 | 12,18 | 16,44 | N16: 2 Δ 5, 9 Δ | [152 (2); 153 (12)] db [208 (1); 220 (2)] dB | |
| i17 | 284; 323; 361 | 12.25 | 16,5 | i17 | [346 (20); 332 (TR); 318 (35)] MB | |
| metilo ramificado 17: 1 | 282; 321; 359 | 12,43 | 16,64 | i17: 1Δ 5 | [152 (2); 153 (10)] dB | [344 (10); 316 (5)] MB |
| a17 | 284; 323; 361 | 12,47 | 16,66 | a17 | [332 (30); 318 (0); 304 (52)] MB | |
| metilo ramificado 17: 1 | 282; 321; 359 | 12,57 | 16,74 | i17: 1Δ 8 | [196 (2); 208 (2)] dB | [344 (10); 316 (5)] MB |
| metilo ramificado 17: 1 | 282; 321; 359 | 12,64 | 16,79 | i17: 1Δ 9 | [210 (3); 222 (3)] dB | |
| metilo ramificado 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.70 | 16,84 | i17: 1Δ 10 | [224 (1); 236 (1)] dB | |
| metilo ramificado 17: 1 | 282; 321; 359 | 12,84 | 16,94 | A17: 1Δ 9 | [210 (3); 222 (4)] dB | [330 (10); 316 (0); (90)] MB |
Tabela 1: Identificação de ácidos gordos a partir de Bacillus cereus ATCC 14579.
Os tempos de retenção, valores equivalentes comprimento da cadeia (ECL), e iões moleculares para os ésteres metílicos dos ácidos gordos (FAMEs) são apresentados, em conjunto com os iões moleculares e iões de diagnóstico para DMOX e derivados de picolinilo.
[] MB par ião de diagnóstico que indica uma perda de 28 amu correspondendo ao fragmento antes e depois de ramificação de carbono.
[] DB par ião de diagnóstico que indica uma perda de 12 amu correspondendo à clivagem de uma ligação dupla.
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Discussion
Os perfis de cromatogramas FAs mostrados na Tabela 1 correspondem a B. cereus ATCC 14579 cresceram em uma superfície da placa de agar. Perfis semelhantes foram obtidos quando a bactéria foi cultivada em meio líquido gaseificado à mesma temperatura 8. No caso de bactérias cultivadas em meio líquido, a biomassa bacteriana é recolhido por centrifugação do meio de crescimento e podem ser lavados de acordo com protocolos anteriormente descritos, dependendo das condições de crescimento 8,19. A identificação dos diferentes FAs produzidos por B. cereus permitidas mudanças finas na proporção de FAS a ser detectados em estirpes mutantes em alguns genes necessários para o crescimento em baixa temperatura de 7,9.
Normalmente, ECL é calculada usando valores de log do tempo de retenção ajustado determinada a uma temperatura fixa (usando um forno com controlo de temperatura isotérmica) 20. Aqui, por causa da utilização de um forno não-isotérmico de permit uma separação otimizada do FAME de interesse, o método de cálculo utilizado foi previamente descrito para índices de retenção linear 3,21.
O objectivo deste trabalho não foi comparar os valores de ECL calculados com os descritos na literatura, mas a prever a estrutura FA, dentro do mesmo perfil cromatográfico, com base nestes dados de retenção e espectros de informações. Com efeito, para FAs saturados, uma dada ramificação (ISO ou anteiso) provoca sempre a mesma mudança de ECL, em comparação com o equivalente de cadeia linear FA. Além disso, a ECL calculado no presente estudo combinado com valores medidos pelos Stransky 22 sobre uma coluna de polaridade equivalente. Esta concordância com os valores previamente relatados indica que os valores ECL são, portanto, muito útil para uma rápida identificação dos picos de perfis FAs cromatograma de B. cereus cultivadas em outras condições, ou de outras estirpes (por exemplo., Mutantes) de B. cereus.
derivados picolinilo fornecer mais iões característicos indicativos da localização de ramificação do que os iões gerados pelo derivados DMOX, enquanto que a posição da dupla ligação é mais facilmente afectadas com os derivados DMOX. O presente estudo mostra a utilidade de combinar informações de ambos os derivados para identificar o metil-insaturados de cadeia ramificada FAs a partir de B. cereus, que até agora têm sido pouco descrita na literatura.
jove_content "> A abordagem proposta pode ser completada dentro de 2 dias. A título de comparação, para a espectroscopia de RMN, cada FA deve ser purificado, o que representa várias semanas de trabalho e uma grande quantidade de material biológico. No entanto, a abordagem não diferenciar a geometria ( cis, trans) de ligações duplas. Uma vez que cada FA é identificado, eles podem ser rotineiramente quantificada por seus derivados fama, por exemplo, para comparar cepas bacterianas e mutantes ou para estudar o impacto das condições de crescimento. Em nossas mãos, tão pouco quanto 8 mg de células bacterianas frescas foram suficientes para a quantificação de CC, o que torna o método aplicável para difícil crescer as bactérias. o limite de quantificação para cada uma das FAs identificado é de 1 ng / mL de solução injectada no GC / MS.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Os autores são gratos a Thomas Mison por seu apoio técnico, e Rachel Kopec para a revisão do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
References
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