Abstract
Die Bacillus - Arten enthalten Kette und ungesättigte Fettsäuren (FAs) mit unterschiedlichen Positionen der Methylverzweigung verzweigten (iso oder anteiso) und der Doppelbindung. Änderungen in FA Zusammensetzung, die eine entscheidende Rolle bei der Anpassung der Bakterien an ihre Umgebung zu spielen. Diese Modifikationen beinhalten eine Änderung in dem Verhältnis von iso gegen anteiso FAs verzweigt, und der Anteil an ungesättigten FAs relativ zu gesättigten FAs mit Doppelbindungen an spezifischen Positionen erstellt. Genaue Identifizierung des FA Profil ist notwendig , um die Anpassungsmechanismen von Bacillus - Spezies zu verstehen.
Viele der FAs von Bacillus sind nicht im Handel erhältlich. Die vorgeschlagene Strategie identifiziert hierin FAs von Informationen über die Retentionszeit (Berechnung der äquivalenten Kettenlänge (ECL)) mit den Massenspektren von drei Arten von FA-Derivaten kombiniert: Fettsäuremethylester (FAME), 4,4-Dimethyl-oxazolin Derivate (DMOX) und3-pyridylcarbinyl Ester (Picolinyl). Diese Methode kann die FAs ohne die Notwendigkeit erkennen, das Unbekannte FAs zu reinigen.
Vergleichen chromatographischen Profile von FAME hergestellt aus Bacillus cereus mit einem handelsüblichen Gemisch von Standards ermöglicht die Identifizierung von geradkettigen gesättigten FAs, die Berechnung der ECL, und Hypothesen über die Identität des anderen FAs. im Vergleich zu linearen gesättigten FAs mit der gleichen Anzahl von Kohlenstoffatomen FAMEs verzweigter gesättigter FAs, iso oder anteiso, in der ECL, eine konstante negative Verschiebung anzuzeigen. FAMEs ungesättigter FAs kann durch die Masse ihrer Molekülionen, und führen zu einer positiven Verschiebung der ECL im Vergleich zu den entsprechenden gesättigten FAs detektiert werden.
Die Verzweigungsposition von Fas und die Doppelbindung Position von ungesättigten FAs kann durch die elektronen Ionisations-Massenspektren von Picolinyl und DMOX Derivate bzw. identifiziert werden. Dieser Ansatz identifiziert die unbekannten gesättigten Zweiged FAs, ungesättigte geradkettige FAs und ungesättigte verzweigte FAs aus dem cereus Extrakt B..
Introduction
Fettsäuremethylester (FAME), Gaschromatographie (GC) ist ein wesentliches Verfahren zur Lipid Charakterisierung. Sie trennt sich rasch und quantifiziert die verschiedenen Fettsäuren (FAs) einer Probe nach einer kurzen Extraktionsschritt. Derivate von Methylester sind sehr volatil, stabil und inert gegenüber der chromatographischen Säule, wodurch vermieden wird Tailing Spitzen. Ihre Identifizierung ist ziemlich einfach, wenn die Probe von bekannten FAs besteht, weil die chromatographischen Profile entweder veröffentlicht oder im Vergleich zu Standards. Darüber hinaus ist die wiederholte Injektion von Kalibrierungsstandards zur Quantifizierung verschiedener FAs nicht erforderlich, da die fast konstante Reaktion auf Flammenionisationsdetektion (FID) 1.
Neben FID stellt Massenspektrometrie (MS) Detektion einer komplementären Reihe von Informationen zu FAME bestätigen. Wenn jedoch FAMEs berechnet werden unter Verwendung Elektronenionisation (EI), die resultierenden Spektren erlauben nicht immer für the Identifizierung von FA Feinstruktur. Beispielsweise Verzweigungsposition (dh eine verzweigte Methylgruppe) ist schwer vorherzusagen , da die diagnostische Ionen schwer 1 und die charakteristische Änderung Ionenabundanz in Ziel zu erfassen ist maschinenabhängig, was die Verwendung von Massenspektren Bibliotheken 2 verhindert wird . Eine weitere Herausforderung liegt in der Doppelbindung Position zu identifizieren, weil EI-Doppelbindung Migration verursacht. So FA Isomere mit Doppelbindung Positionen unterschiedlicher nicht durch ihre Massenspektren unterschieden werden. Glücklicherweise andere Werkzeuge wurden für FA Identifikation entwickelt. Zum Beispiel kann die Anwesenheit und die Position oder der Doppelbindungen in FAs Verzweigungs kann durch Berechnen der äquivalenten Kettenlänge (ECL) 3 gemutmaßt werden.
Andere Derivatisierung Verfahren führen zu unterschiedlichen Massenspektren, abhängig von der Position einer Doppelbindung oder einer verzweigten Methylgruppe ist. 4,4-Dimethyl oxazolinderivaten (DMOX) 4 ermöglichen easy Identifizierung der Position der einfach ungesättigten Fettsäure-Doppelbindungen. 3-pyridylcarbinyl ester (Picolinyl ester) Derivate zur eindeutigen Identifizierung der Lage von Methyl ermöglichen verzweigten FAs 5. Kombination von chromatographischen Retention (ECL) und Massenspektren (DMOX und Picolinyl) Information erlaubt die Identifizierung der meisten FAs ohne die Notwendigkeit , komplexe Reinigungsverfahren zu verwenden, wie 1 für die Kernspinresonanz (NMR) -Spektrum, das unhinterfragbares Methode zur strukturellen Charakterisierung erforderlich .
Bakterien der Gattung Bacillus, die einige menschliche und tierische Pathogene umfassen, können sehr unterschiedliche Nischen zu kolonisieren und werden daher in der Umwelt weit 6 verteilt. Unter der Gattung Bacillus, der Zusammensetzung FA durch die ökologische Nische der Spezies mit Modulationen in FA Muster beeinflusst zu einem breiten Spektrum von Umgebungsänderungen (zB Wachstumsmedium, Temperatur, anzupassenpH, etc.) 7-9. Aufgrund der relativen Homogenität des FA Muster über Spezies der Gattung Bacillus während des Wachstums in standardisierten Bedingungen, Bestimmung der FA Zusammensetzung ist eines der wesentlichen Kriterien verwendet , um die Bacillus - Arten definieren. Ein einzigartiges Merkmal der Gattung Bacillus ist die Fülle an verzweigtkettigen FAs enthält 12-17 Kohlenstoffe 10-12 mit dem Verhältnis zwischen iso und anteiso Isomere ein wichtiger Faktor für die Anpassung an Umweltbedingungen zu sein. Bacillus species anzupassen auch gegenüber Umweltschwankungen , indem der Anteil an ungesättigten Fettsäuren zu verändern. In einigen Arten, wie Bacillus cereus, zwei Fettsäure-Desaturasen schaffen Doppelbindungen in unterschiedlichen Positionen der Alkylkette 13 mit unterschiedlichen Rollen in Anpassung 9. Das Beispiel des Bacillus genus veranschaulicht die Bedeutung der eben die Doppelbindung Position zu identifizieren und FA Verzweigung. Sammelnhungsweise, hat Identifizierung von Bacillus FA Muster mehrere nützliche Anwendungen. Hier schlagen wir eine neue GC-MS - Ansatz für Bacillus FA Mustererkennung, die die inhärenten Grenzen eines klassischen GC-MS - Analyse überwindet.
Dieser innovative Ansatz kann direkt auf rohen biologischen Material verwendet werden, und besteht aus einer Kombination von bestehenden Techniken: Informationen über die Retentionszeiten (ECL) und Massenspektren verschiedener FAs Derivate (FAME, DMOX und Picolinyl-Ester).
Wir verwenden die folgende FA-Nomenklatur. i, a und n iso anzuzeigen, verzweigten anteiso Methyl und geradkettige Fettsäure, respectively. Ungesättigte FAs wurden durch C genannt: d, wobei C die Zahl der Kohlenstoffatome in der Fettsäure ist und d die Anzahl der Doppelbindungen ist. Δ x gibt die Position der Doppelbindung, wobei die Doppelbindung auf der x - ten Kohlenstoff-Kohlenstoff - Bindung befindet, von der Carbonsäure Ende zählen.
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Protocol
1. Bakterienkulturen
- Bereiten Sie einen Rasen der Bakterien (Bacillus cereus Stamm ATCC 14579) durch Spreizen 100 ul einer Übernachtkultur des bei 30 ° C inkubiert Stamm in LB (Luria-Bertani - Medium), über die Oberfläche einer Platte von LB - Agar - Medium. Die Platte über Nacht bei 30 ° C.
2. ECL: Entspricht Kettenlänge
- Berechnen ECL wie folgt:
mit:
i, der gelöste Stoff von Interesse;
n die Kohlenstoffzahl der geradkettigen gesättigten Fettsäuremethylester vor solute Eluieren I;
n + 1, die Kohlenstoffzahl der geradkettigen gesättigten Fettsäuremethylester nach solute Eluieren I;
RTI, Rtn, Rt (n + 1) die Retentionszeiten der FAME-Spitzen oben beschrieben.
HINWEIS: Erhalten der Retentionszeiten von geradkettigen gesättigten Fettsäuren Methylester durch Injektion einer Mischung von Standards (BEIN ICH).
mit: 3. FAME Herstellung und Analyse
- Um Lipid Fettsäuren, Ernte Bakterienzellen zu erhalten , indem Kolonien von der Agar - Platte und übertragen 40 mg (Frischgewicht, das entspricht 10 9 lebenden Zellen) von Bakterien in einem 10 ml Glasröhrchen mit Schraubverschluss und PTFE - Dichtungen Schaben.
- Führen Sie die Umesterung über die Esterbindung Methode 14,15 unten detailliert beschrieben.
- 5 ml 0,2 M KOH in Methanol zu den frischen Bakterienzellen und Inkubieren bei 37 ° C für 1 Stunde. Diese Reaktion besteht aus alkalischer Methanolyse, die Esterbindung in der Lipid Brechen und Fettsäuremethylester zu erzeugen.
- 1 ml 1 M Essigsäure den pH-Wert auf 7,0 zu senken. Überprüfen Sie den pH-Wert mit pH-Teststreifen.
- 3 ml Hexan FAMEs zu extrahieren.
- Übertragen Überstand (organische Phase) in saubere Röhrchen und konzentriert durch Abdampfen bei Raumtemperatur unter einem kontinuierlichen Stickstoffstrom etwa 200 & mgr; l zu erhalten,Extrakt. Übertragen Sie die Probe in ein GC-Fläschchen mit Einsatz.
- Injizieren Extrakte in eine Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) System.
4. GC / MS-Bedingungen
- Injizieren FAME Proben in ein GC-MS-Gerät ausgestattet mit einer Kapillarsäule ZB-WAX (Länge, 30 m, Durchmesser 0,25 mm; Filmdicke, 0,25 & mgr; m).
- Stellen Sie die Einspritzöffnung (in splitless Modus) Temperatur auf 250 ° C. Verwenden Helium als Trägergas mit einer linearen Geschwindigkeit von 37 cm / sec. Halten der Ofentemperatur bei 50 ° C für 1 min, erhöht auf 190 ° C mit einer Geschwindigkeit von 20 ° C / min, und weitere Steigerung auf eine Endtemperatur von 230 ° C mit einer Rate von 2 ° C / min.
- Für die MS, notieren Sie die Massenspektren von Elektronen-Ionisation (EI) bei 70 eV, und stellen Sie den Erwerb des gesamten Ionenstrom zwischen 50 und 400 atomaren Masseneinheiten (amu) (2 Scans / s).
- Wenn es erforderlich ist, injizieren excep DMOX und Picolinyl Derivate unter den gleichen Bedingungent die Temperaturprogramm Ofen wie folgt:
DMOX: 50 ° C (1 min), 20 ° C / min bis 210 ° C und 2 ° C / min bis 240 ° C (5 min);
Picolinyl: 6 ° C (1 min), 20 ° C / min bis 220 ° C und 2 ° C / min bis 250 ° C (20 min).
5. Picolinyl Ester Herstellung von FAME 16
- Man dampft das FAME Auszug aus Kapitel 3 mit einem Stickstoffstrom (mindestens 10 mg trockenes Material) und in 1 ml trockenem Dichlormethan aufzulösen.
- Bereiten einer 1,0 M Lösung von Kalium - ter t-butylat in Tetrahydrofuran.
- Fügen Sie den FAME-Extrakt und 0,2 ml 3-pyridinemethanol bis 0,1 ml Lösung hergestellt in Schritt 5.2.
- Die Lösung wird bei 40 ° C für 30 min in einem geschlossenen Glasfläschchen.
- Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur abgekühlt, gereinigt VE - Wasser (2 ml, siehe Materialien Tabelle) und Hexan (4 ml). Mischen Sie mit einem Wirbel, erlauben Phase zu trennen und sammeln die organische Phase ab.
- DRy durch wasserfreiem Natriumsulfat, bis die organische Phase Zugabe ist vollkommen klar. Bringen Sie es in ein sauberes Röhrchen. Dann verdampfen zu 200 ul. Übertragen Sie die Probe in ein GC-Fläschchen mit Einsatz.
6. DMOX Herstellung von FAME 17
- Man dampft das FAME Auszug aus Kapitel 3 mit einem Stickstoffstrom (mindestens 10 mg trockenes Material).
- Zum Trockenextrakt FAME, fügen 250 mg 2-Amino-2-Methyl-1-Propanol. Spülen Sie das Gefäß mit Stickstoff, fügen Sie einen Stopper, und legen Sie sie in einem Heizblock über Nacht bei 190 ° C.
- Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 3 ml Dichlormethan zu dem Rohr und 5 ml gereinigtes deionisiertes Wasser (siehe Materialien Table).
- Schütteln Sie für die Phasentrennung und entfernen Sie dann die wässrige Phase.
- Die organische Phase wird mit 5 ml Wasser. Schütteln Sie für die Phasentrennung und entfernen Sie dann die wässrige Phase.
- Trocknen mit wasserfreiem Natriumsulfat, bis die organische Phase Zugabe ist vollkommen klar undübertragen sie in ein sauberes Röhrchen. Man dampft unter einem Stickstoffstrom, bis ein Volumen von 200 & mgr; l zu erreichen. Übertragen Sie die Probe in ein GC-Fläschchen mit Einsatz.
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Representative Results
Die Strategie der FA Identifizierung von Bakterienzellen ist in 1 dargestellt. Jeder Schritt liefert ergänzende spektrale Information oder Informationen über chromatographische Retention. Schritt 1 besteht aus vorläufigen FA Identifizierung einer Standardlösung verwenden. Schritt 2 ermöglicht die Auslegung von FAME EI-Spektren und ihre ECL, um die Produkte zu vorläufig zu identifizieren. Schritt 3 identifiziert die genaue Abzweigstelle in verzweigtkettigen-FAs. Schließlich identifiziert 4 Schritt die genaue Position von Doppelbindungen in ungesättigten FAs.
FAME und ECL
Die BAME Mischung erlaubte uns, eine Reihe von geradkettigen, gesättigten Fettsäuren (n12 bei n17) zu identifizieren und einige Methyl-verzweigten Fettsäure (i15, a15, i16, i17). Aber nur sehr wenige FAs spezifisch für B. cereus wurden in unserer Probe nachgewiesen, die develo rechtfertigenpment des Identifizierungsverfahren beschrieben.
Unabhängig von der Kettenlänge, verzweigten gesättigten FAs (iso oder anteiso) einer homologen Reihe (dh eine Reihe von Verbindungen mit der gleichen allgemeinen Formel) zeigen eine konstante Verschiebung in ECL Vergleich zu den geraden gesättigten FA in die gleiche Anzahl von Kohlenstoffatomen , ihre Kohlenstoff-Kette. Diese Verschiebung, die so genannte fraktionierte Kettenlänge (FCL), ermöglicht die Identifizierung von Fas in einer homologen Reihe. Beispielsweise iso-FAs (mit dem Präfix bezeichnet "i") einen FCL-Wert von -0,48, während anteiso FAs (bezeichnet mit dem Prefix "a") eine FCL von -0,33 aufweisen. Es ist dann einfach, eine i14 und i13 mit einer ECL von 13.52 und 12.52 sind, und eine a13 und a15 mit einer ECL von 12,67 und 14,66 bzw. zu identifizieren.
Tabelle 1 zeigt die ECLs für jede der FAs erfasst in unserer Stichprobe. Die Retentionszeiten vorhersagened für iso und anteiso Serie, zusammen mit MS-Spektren mit FAME erhalten, konnten wir alle die verzweigtkettigen-FA unserer Probe zu identifizieren. Eine solche Identifizierung bei diesem Schritt war provisorisch, aber später von EI-Spektren von Picolinyl FAs Derivaten erhalten bestätigt.
FAMEs mit ECLs nicht auf die iso oder anteiso Verschiebungen entsprechen, sind ungesättigte, gerad- oder verzweigtkettiges FAs verzweigt, wie durch die Masse ihrer Molekülion angegeben. Ungesättigte FAs eine positive Verschiebung in der ECL zeigen als an den entsprechenden gesättigten FA verglichen. Spektren von DMOX Derivaten mit Spektren von Picolinyl Derivat für verzweigte FAs kombiniert, für die Identifizierung von Doppelbindungsposition ermöglichen.
Eine solche Derivatisierung Methoden sind für FA Identifizierung nur verwendet, wenn die Elution beibehalten wird , um, wie es für die drei Derivat Mischungen (dh FAME, DMOX und Picolinyl) in Abbildung gezeigt2 für mehrere 16: 1 FAs. Dieser Ansatz ermöglicht die Sammlung von komplementären Spektralinformationen von einem Peak unter Verwendung von 3 Derivatisierungsmethoden die kombiniert werden können FA Struktur zu identifizieren. Keine Unterschiede in der Elutionsreihenfolgen wurden zwischen den drei Derivate beobachtet, obwohl die Retentionszeiten und Ofentemperaturen waren unterschiedlich.
Picolinyl Ester von iso und anteiso methyl verzweigtkettige gesättigte Fettsäure
Die Spektren, die durch EI bestätigen das Vorhandensein von Methyl-verzweigten FAs. Tatsächlich haben die molekularen Ionen, die m / z gesättigte FAs entspricht. Wir beobachteten eine Ionen Reihe mit einem Spalt von 14 Masseneinheiten (amu) zu einem Verlust einer Methylengruppe entspricht, außer im Bereich der Verzweigungsstelle, wo die Ionen zu dem substituierten Kohlenstoffatom entspricht, fehlt. Wir beobachten, dann eine Lücke von 28 amu zwischen den beiden Ionen erzeugt Fragmente entsprechend vor undnach dem verzweigten Kohlenstoff. Figur 3 zeigt das Spektrum der i16 mit den diagnostischen Ionen (304 und 332), die die Abzweigstelle.
DMOX von geradkettigen ungesättigten Fettsäuren
Figur 2 zeigt fünf verschiedene Peaks , die mit der 16: 1 - Fettsäure. Die ersten beiden Spitzen haben ECL Werte 16 <. Wir schließen, dass ihre Struktur sicherlich verzweigt ist. Die Identifizierung dieser Verbindungen erfordert die Interpretation der Massenspektren von DMOX und Picolinyl Esterderivate hergestellt. Drei Spitzen besitzen ECL> 16 Spiel einfach ungesättigte geradkettige Fettsäuren. DMOX Derivat zeigen Massenspektren Diagnose-Ionen, die Position der Doppelbindung dieser Verbindungen zu identifizieren. In 4 können wir einen Abstand von 12 amu ion zwischen 196 und 208 , die das Vorhandensein der Doppelbindung mit Kohlenstoff 8 des n16 siehe: 1 Δ
DMOX und Picolinyl Massenspektren von Methyl verzweigtkettigen einfach ungesättigten Fettsäuren
Abbildung 6 zeigt Spektren von DMOX und Picolinyl Esterderivate, verwendet , um die Struktur von i16 zu bestimmen: 1 Δ 9 FA. Die Position derVerzweigung wird durch eine Lücke von 28 amu für beide Derivate angegeben. Ein Abstand von 12 amu für DMOX und 26 für Picolinyl Ester identifiziert die Doppelbindungsposition, wie in 6 gezeigt.
Die Identifizierung der Fettsäuren und diagnostischen Ionen
Tabelle 1 zeigt die verschiedenen Fettsäuren identifiziert, mit den entsprechenden diagnostischen Ionen, in Bacillus cereus ATCC 14579 bei 30 ° C gezüchtet. Diese diagnostischen Ionen identifizieren die Positionen der Methylverzweigungen und Doppelbindungen in der Kohlenstoffkette für die DMOX und Picolinyl Esterderivate, die komplementären Strukturinformationen bereitzustellen. Die beiden Ansätze sind wirklich komplementär, als diagnostische Ionen manchmal leichter, mit DMOX Derivate zu beobachten und zu anderen Zeiten leichter Picolinyl Derivaten zu beobachten.
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Abbildung 1: Strategie zur Identifizierung von Fettsäuren in Bacillus cereus.
Die aufeinanderfolgenden Schritte Informationen über die Retentionszeiten (ECL), auf Massenspektren von FAME, von DMOX zu erzeugen und von Picolinyl-Ester dargestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Vergleich der chromatographischen Profile für verschiedene 16: 1 Fettsäuren in Bacillus cereus nachgewiesen.
(A) FAME Derivate (Molekülion bei m extrahiert / z 268); (B) DMOX Derivate (Molekülion bei m extrahiert / z 307); (C) Picolinyl Derivate (Molekülion extrahiert bei m / z 345).iles / ftp_upload / 54960 / 54960fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: i16 Picolinyl Derivat Massenspektrum von Elektronen Ionisation erzeugt.
Ionen bei m / z 151 und m / z 164 weisen auf das Vorhandensein einer Picolinyl Derivat von Fettsäure. Das Molekülion bei m / z 347 als ein Isomer von Palmitinsäure identifiziert. Das Vorhandensein eines Spalts von 28 amu zwischen dem Ion bei m / z 304 und m / z 332 ist indikativ für i16. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: n16: 1 Δ 8 DMOX Derivat Massenspektrum erzeugt durch ElektronenIonisierung.
Das Ion bei m / z 126 zeigt ein DMOX Derivat, m / z 307 ist das Molekülion von 16: 1 DMOX und das Vorhandensein einer Lücke von 12 amu zwischen den Ionen bei m / z 196 und m / z 208 identifiziert den Ort der Doppelbindung an Kohlenstoff 8. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: n16: 1 Δ 5 DMOX Derivat Massenspektrum von Elektronen Ionisation erzeugt.
Ion bei m / z 126 ist indikativ für eine DMOX Derivat und m / z 307 ist das Molekülion von 16: 1 DMOX. Die intensive m / z 153 ist Ionen charakteristisch für eine Doppelbindung an Kohlenstoff befindet 5. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: DMOX (oben) und Picolinyl (unten) Vergleich von i16: 1Δ 9 Spektren.
In beiden Fällen ist der Abstand von 28 amu zeigen die Position der Methylverzweigung. Die Doppelbindung Lage kann durch einen Zwischenraum von 12 amu und 26 amu für DMOX und Picolinyl Derivate bzw. abgeleitet werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Mutmaßliche Verbindungen | Molekülion (m / z) FAME; DMOX; Picolinyl | RT | ECL | bestätigt Identifizierung | Diagnostische Ionen DMOX | Diagnostische Ionen Picolinyl |
| i12 | 214; 253; 291 | 7,93 | kein Referenz | i12 | [276 (15); 262 (0); 248 (15)] mb | |
| n12 | 214; 253; 291 | 8.21 | 12.00 | n12 | [276 (10); 262 (20); 248 (20)] mb | |
| i13 | 228; 267; 305 | 8,53 | 12.5 | i13 | [290 (15); 276 (0); 262 (48)] mb | |
| a13 | 228; 267; 305 | 8,64 | 12,67 | a13 | [276 (48); 262 (0); 248 (65)] mb | |
| i14 | 242; 281; 319 | 9.24 | 13.52 | i14 | [304 (20); 276 (45) 290 (0)] mb | |
| n14 | 242; 281; 319 | 9.60 | 14.00 | n14 | [304 (7); 290 (17); 276 (17)] mb | |
| i15 | 256; 295; 333 | 10,06 | 14,51 | i15 | [318 (20); 314 (0); 290 (50)] mb | |
| a15 | 256; 295; 333 | 10.19 | 14,66 | a15 | [304 (30); 290 (tr); 276 (62)] mb | |
| n15 | 256; 295; 333 | 10,49 | 15.00 | n15 | [318 (5); 304 (13); 290 (18)] mb | |
| i16 | 270; 309; 347 | 11.04 | 15.5 | i16 | [332 (18); 318 (tr); 304 (42)] mb | |
| Methyl-verzweigten 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.19 | 15,64 | i16: 1Δ 5 | [152 (2); 153 (10)] db [292 (3); 278 (tr); 264 (2)] mb | |
| Methyl-verzweigten 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.40 | 15,83 | i16: 1 Δ 9 | [210 (3); 222 (3)] db [292 (12); 278 (tr); 264 (40)] mb | |
| n16 | 270; 309; 347 | 11,59 | 16.00 | n16 | [332 (5); 318 (15); 304 (15)] mb | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11,78 | 16,14 | n16: 1 Δ 5 | [152 (2); 153 (10)] db | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11,94 | 16.24 | n16: 1 Δ 8 | [196 (5); 208 (3)] db | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 12.00 | 16,31 | n16: 1Δ 9 | [210 (3); 222 (3)] Db | |
| 16: 2 | 266; 305; 343 | 12.18 | 16,44 | n16: 2 Δ 5, Δ 9 | [152 (2); 153 (12)] db [208 (1); 220 (2)] db | |
| i17 | 284; 323; 361 | 12.25 | 16.5 | i17 | [346 (20); 332 (tr); 318 (35)] mb | |
| Methyl-verzweigten 17: 1 | 282; 321; 359 | 12,43 | 16.64 | i17: 1Δ 5 | [152 (2); 153 (10)] db | [344 (10); 316 (5)] mb |
| a17 | 284; 323; 361 | 12.47 | 16,66 | a17 | [332 (30); 318 (0); 304 (52)] mb | |
| Methyl-verzweigten 17: 1 | 282; 321; 359 | 12,57 | 16.74 | i17: 1Δ 8 | [196 (2); 208 (2)] db | [344 (10); 316 (5)] mb |
| Methyl-verzweigten 17: 1 | 282; 321; 359 | 12,64 | 16.79 | i17: 1Δ 9 | [210 (3); 222 (3)] db | |
| Methyl-verzweigten 17: 1 | 282; 321; 359 | 12,70 | 16.84 | i17: 1Δ 10 | [224 (1); 236 (1)] db | |
| Methyl-verzweigten 17: 1 | 282; 321; 359 | 12,84 | 16.94 | a17: 1Δ 9 | [210 (3); 222 (4)] db | [330 (10); 316 (0); (90)] mb |
Tabelle 1: Identifizierung von Fettsäuren aus Bacillus cereus ATCC 14579.
Retentionszeiten äquivalent Kettenlänge (ECL) Werte und Molekülionen für die Fettsäuremethylester (FAME) gezeigt, zusammen mit Molekülionen und diagnostische Ionen für DMOX und Picolinyl Derivate.
[] Mb Paar diagnostische Ion einen Verlust von 28 amu entsprechend Fragment vor und nach der Kohlenstoff-Verzweigung angibt.
[] Db Diagnoseionenpaar einen Verlust von 12 amu, was zur Spaltung einer Doppelbindung entspricht.
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Discussion
Die FAs Chromatogrammprofile in Tabelle 1 dargestellten entsprechen B. cereus ATCC 14579 auf einer Agarplatte Oberfläche gewachsen. Ähnliche Profile wurden erhalten , wenn das Bakterium in belüfteten flüssigen Medien bei der gleichen Temperatur 8 gezüchtet wurde. Im Falle von in flüssigen Medien gezüchtet Bakterien, die bakterielle Biomasse durch Zentrifugation von dem Wachstumsmedium gesammelt und kann nach zuvor beschriebenen Protokollen gewaschen werden je nach Wachstumsbedingungen 8,19. Die Identifizierung der verschiedenen von B. cereus hergestellt FAs erlaubt feinen Änderungen in dem Anteil der FAs in Stämme auf einige Gene , die für das Wachstum bei niedriger Temperatur 7,9 mutiertes erkannt werden.
Üblicherweise ECL berechnet wird log - Werte der eingestellten Haltezeit bei einer festgelegten Temperatur bestimmt (unter Verwendung eines Ofens mit isothermen Temperaturregelung) 20. Hier wegen der Verwendung eines nicht-isothermen Ofen auf permit eine optimierte Trennung des FAME von Interesse wurde die Berechnungsmethode verwendet , dass 3,21 für lineare Retentionsindizes zuvor beschrieben.
Das Ziel dieser Arbeit war es nicht die berechneten ECL-Werte mit denen in der Literatur beschrieben zu vergleichen, aber die FA-Struktur, innerhalb des gleichen Chromatogramm Profil vorherzusagen, basierend auf diesen Retentionsdaten und Spektren Informationen. Denn für gesättigte FAs, eine gegebene Verzweigung (iso oder anteiso) verursacht immer die gleiche Verschiebung der ECL, im Vergleich zu den äquivalenten geradkettigen FA. Darüber hinaus wird in der vorliegenden Studie wurde die ECL mit Werten von Stransky 22 auf einer Säule von äquivalenten Polarität gemessen angepaßt berechnet. Diese Übereinstimmung mit zuvor berichteten Werten zeigt an, daß ECL - Werte für eine schnelle Identifizierung der Peaks von FAs Chromatogramm Profilen von B. cereus somit sehr nützlich sind , in anderen Bedingungen aufgezogen oder anderer Stämme (z. B. Mutanten) von B. cereus.
Picolinyl Derivate bieten mehr charakteristischen Ionen, welche die Abzweigstelle als Ionen durch DMOX Derivate erzeugt werden, während die Position der Doppelbindung ist leichter mit den DMOX Derivate zugeordnet. Die vorliegende Studie zeigt die Nützlichkeit Informationen aus beiden Derivate der Kombination der Methyl verzweigtkettigen ungesättigten FAs von B. cereus, die bisher identifiziert wurden in der Literatur kaum beschrieben worden.
jove_content "> Der vorgeschlagene Ansatz kann innerhalb von 2 Tagen abgeschlossen sein. Als Vergleich für die NMR-Spektroskopie, die jeweils FA gereinigt werden sollte, die mehrere Wochen Arbeit und eine große Menge an biologischem Material. Allerdings ist der Ansatz, um die Geometrie nicht unterscheiden ( cis, trans) der doppelten Grenzen. Sobald jeder FA identifiziert ist, kann sie routinemäßig durch ihre FAME Derivate, zB quantifiziert werden, Bakterienstämme und Mutanten oder zur Untersuchung der Auswirkungen der Wachstumsbedingungen zu vergleichen. In unseren Händen, so wenig wie 8 mg frischer Bakterienzellen wurden für die Quantifizierung von FAs ausreichend, die das Verfahren anwendbar auf schwierig macht Bakterien wachsen. die Bestimmungsgrenze für jedes der identifizierten FAs 1 ng / & mgr; l Lösung in der GC / MS injiziert.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Die Autoren sind dankbar, dass Thomas Mison für seine technische Unterstützung und Rachel Kopec für das Manuskript zu revidieren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
References
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