Abstract
Las especies de Bacillus contienen ácidos grasos insaturados (FAS) de cadena y ramificados con diversas posiciones de la rama de metilo (iso o anteiso) y del doble enlace. Los cambios en la composición de la FA juegan un papel crucial en la adaptación de las bacterias a su entorno. Estas modificaciones implican un cambio en la relación de iso frente anteiso ramificada AF, y en la proporción de insaturados AF en relación con las AF saturado, con dobles enlaces creados en posiciones específicas. Identificación precisa del perfil de AG es necesario entender los mecanismos de adaptación de la especie Bacillus.
Muchos de los conjuntos combustibles de Bacillus no están disponibles comercialmente. La estrategia propuesta en el presente documento identifica conjuntos combustibles mediante la combinación de la información sobre el tiempo de retención (mediante el cálculo de la longitud de cadena equivalente (ECL)) con los espectros de masas de los tres tipos de derivados FA: ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs), 4,4-dimetil oxazolina derivados (DMOX), yéster 3-pyridylcarbinyl (picolinilo). Este método puede identificar los conjuntos combustibles sin la necesidad de purificar el desconocido AF.
La comparación de los perfiles cromatográficos de FAME preparado a partir de Bacillus cereus con una mezcla comercial de estándares permite la identificación de cadena lineal saturado Fas, el cálculo de la ECL, y las hipótesis sobre la identidad de la otra AF. FAMEs de ramificado, saturado Fas, iso o anteiso, muestre un cambio negativo constante en la ECL, en comparación con AF saturados lineales con el mismo número de carbonos. FAMEs de FAs insaturados pueden ser detectados por la masa de sus iones moleculares, y dan como resultado un cambio positivo en la ECL en comparación con los conjuntos combustibles saturados correspondientes.
La posición de ramificación de conjuntos combustibles y la posición doble enlace insaturado de conjuntos combustibles pueden ser identificados por los espectros de masas de ionización de electrones de derivados picolinilo y DMOX, respectivamente. Este enfoque identifica toda la rama saturado desconocidaed AF, insaturados de cadena lineal AF y AF ramificados insaturados del extracto de B. cereus.
Introduction
cromatografía Fatty ácido metil éster (FAME) de gases (GC) es un método esencial para la caracterización de los lípidos. Se separa rápidamente y cuantifica los diversos ácidos grasos (FAS) de una muestra después de una etapa de extracción corto. Los derivados de ésteres metílicos son muy volátiles, estable e inerte hacia la columna cromatográfica, evitando así los picos con cola. Su identificación es bastante sencillo cuando la muestra sea de conjuntos combustibles conocidos porque los perfiles cromatográficos se publican o se pueden comparar con los estándares tampoco. Además, no se requiere la inyección repetida de patrones de calibración para la cuantificación de varios conjuntos combustibles, dada su respuesta casi constante a la detección de ionización de llama (FID) 1.
Además de la FID, la espectrometría de masas (MS) de detección proporciona un conjunto de información complementaria para confirmar FAME. Sin embargo, cuando se pagan FAME usando ionización electrónica (EI), los espectros resultantes no siempre permiten THe identificación de estructura fina FA. Por ejemplo, la posición de ramificación (es decir, un grupo metilo ramificado) es difícil de predecir debido a que los iones de diagnóstico son difíciles de detectar 1 y el cambio característico en la abundancia de iones objetivo es dependiente de la máquina, evitando el uso de bibliotecas de espectros de masa 2. Otro reto consiste en identificar la posición de doble enlace, porque IE provoca la migración del doble enlace. Por lo tanto, los isómeros FA con diferentes posiciones de doble enlace no pueden ser diferenciadas por sus espectros de masas. Afortunadamente, otros se han desarrollado herramientas para la identificación FA. Por ejemplo, la presencia y la posición de ramificación o de dobles enlaces en las AF pueden conjeturaron mediante el cálculo de la longitud de cadena equivalente (ECL) 3.
Otros métodos de derivatización resultan en diferentes espectros de masa, dependiente de la localización de un doble enlace o un grupo metilo ramificado. 4,4-dimetil derivados de oxazolina (DMOX) 4 permiten a EASy la identificación de la posición de los dobles enlaces de ácidos grasos monoinsaturados. 3-pyridylcarbinyl éster (éster picolinilo) derivados permiten la identificación inequívoca de la ubicación de metilo ramificado AF 5. La combinación de la retención cromatográfica (ECL) y espectros de masas (DMOX y picolinilo) información permite la identificación de la mayoría de las AF sin la necesidad de utilizar métodos complejos de purificación, como se requiere para la resonancia magnética nuclear espectro (NMR), el método incontestable para la caracterización estructural 1 .
Las bacterias del género Bacillus, que incluyen algunos agentes patógenos humanos y animales, son capaces de colonizar muy diversos nichos y por lo tanto están ampliamente distribuidos en el medio ambiente 6. Entre el género Bacillus, composición FA está influenciada por el nicho ecológico de las especies con las modulaciones en los patrones de FA para adaptarse a una amplia gama de cambios ambientales (por ejemplo, medio de crecimiento, temperatura,pH, etc.) 7-9. Debido a la homogeneidad relativa de la pauta FA través de las especies del género Bacillus durante el crecimiento en condiciones estandarizadas, determinación de la composición FA es uno de los criterios esenciales utilizados para definir las especies de Bacillus. Un atributo único del género Bacillus es la abundancia de las AF de cadena ramificada que contienen 12-17 átomos de carbono 10-12 con la relación entre la ISO y anteiso isómeros son un determinante clave de la adaptación a las condiciones ambientales. Especies de Bacillus también se adaptan a las fluctuaciones ambientales mediante la alteración de la proporción de ácidos grasos insaturados. En algunas especies, tales como Bacillus cereus, dos desaturasas de ácidos grasos crean enlaces dobles en diferentes posiciones de la cadena de alquilo 13 con diferentes roles en la adaptación 9. El ejemplo del género Bacillus ilustra la importancia de identificar con precisión la posición de doble enlace y FA ramificación. Recogervamente, la identificación de patrones de Bacillus FA tiene varias aplicaciones útiles. En este documento, se propone un nuevo enfoque de GC-MS para la identificación de patrones de Bacillus FA que supera las limitaciones inherentes de un análisis clásico GC-MS.
Este enfoque innovador puede ser utilizado directamente en crudo material biológico, y consiste en una combinación de técnicas existentes: información sobre los tiempos de retención (ECL) y los espectros de masas de los diferentes derivados de Fas (FAME, DMOX y picolinilo-éster).
Usamos la siguiente nomenclatura FA. i, a, y n indican iso, anteiso metilo ramificado, y el ácido graso de cadena lineal, respectivamente. FAs insaturados fueron nombrados por C: d donde C es el número de átomos de carbono en el ácido graso y d es el número de dobles enlaces. Δ x indica la posición del doble enlace, donde se encuentra el doble enlace en el enlace carbono-carbono de orden x, contando desde el extremo ácido carboxílico.
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Protocol
1. Los cultivos bacterianos
- Preparar un césped de las bacterias (Bacillus cereus cepa ATCC 14579) mediante la difusión de 100 l de un cultivo nocturno de la cepa se incubó a 30 ° C en LB (medio Luria-Bertani), sobre la superficie de una placa de medio de agar LB. Se incuba la placa durante la noche a 30 ° C.
2. ECL: Longitud Equivalente Cadena
- Calcular ECL como sigue:
con:
i, el soluto de interés;
n, el número de carbonos del éster metílico de ácido graso saturado de cadena lineal de elución antes de soluto I;
n + 1, el número de carbonos del éster metílico de ácido graso saturado de cadena lineal, eluyendo después de soluto I;
Rti, Rtn, Rt (n + 1) los tiempos de retención de los picos de FAME descritos anteriormente.
NOTA: Obtener los tiempos de retención de los ésteres de ácidos grasos saturados de cadena recta de metilo mediante la inyección de una mezcla de estándares (BAME).
con: 3. Preparación y análisis FAME
- Con el fin de obtener los ácidos grasos de lípidos, células bacterianas cosecha raspando colonias de la placa de agar y la transferencia de 40 mg (peso en fresco, el equivalente a 10 9 células viables) de las bacterias en un tubo de vidrio de 10 ml con tapones de rosca y juntas de PTFE.
- Realizar transesterificación mediante el método de enlace de éster de 14,15 detalla a continuación.
- Añadir 5 ml de 0,2 M de KOH en metanol a las células bacterianas fresco y se incuba a 37 ° C durante 1 hr. Esta reacción consiste en metanólisis alcalina, rompiendo el enlace éster en el lípido y la producción de ésteres metílicos de ácidos grasos.
- Añadir 1 ml de ácido acético 1 M para bajar el pH a 7,0. Comprobar el pH con tiras de prueba de pH.
- Añadir 3 ml de hexano para extraer FAMEs.
- Transferir el sobrenadante (fase orgánica) en tubos limpios y se concentra por evaporación a temperatura ambiente bajo un flujo continuo de nitrógeno para obtener aproximadamente 200 lde extracto. Transferir la muestra en un vial GC con parte.
- Inyectar extractos en una espectrometría de masa de cromatografía de gas del sistema (GC-MS).
4. Condiciones GC / MS
- Inyectar muestras FAME en un instrumento de GC-MS equipado con una columna capilar ZB-WAX (longitud, 30 m; diámetro, 0,25 mm; espesor de la película, 0,25 m).
- Ajuste el puerto de inyección (en el modo sin división) la temperatura a 250 ° C. Utilice el helio como gas portador, con una velocidad lineal de 37 cm / seg. Mantenga la temperatura del horno a 50 ° C durante 1 min, aumentar a 190 ° C a una velocidad de 20 ° C / min, y aumentar aún más a una temperatura final de 230 ° C a una velocidad de 2 ° C / min.
- Para la MS, registrar los espectros de masas de ionización por electrones (IE) a 70 eV, y establecer la adquisición de la corriente de iones total de entre 50 y 400 unidades de masa atómica (UMA) (2 scans / seg).
- Cuando sea necesario, inyectar derivados DMOX y picolinilo bajo la misma condición except el horno programa de temperatura como sigue:
DMOX: 50 ° C (1 min), 20 ° C / min hasta 210 ° C y 2 ° C / min hasta 240 ° C (5 min);
Picolinilo: 6 ° C (1 min), 20 ° C / min hasta 220 ° C y 2 ° C / min hasta 250 ° C (20 min).
5. picolinilo Ester Preparación a partir de 16 FAME
- Evaporar el extracto de FAME de la sección 3 con un flujo de nitrógeno (al menos 10 mg de material seco) y se disuelve en 1 ml de diclorometano seco.
- Preparar una solución 1,0 M de ter t-butóxido potásico en tetrahidrofurano.
- Agregar el extracto de FAME y 0,2 ml de 3 piridinametanol a 0,1 ml de solución hechas en el paso 5.2.
- Se calienta la solución a 40 ° C durante 30 min en un vial cerrado.
- Después de enfriar a temperatura ambiente, añadir agua desionizada purificada (2 ml, véase Materiales Tabla) y hexano (4 ml). Mezclar con un vórtice, permiten fase para separar y recoger la fase orgánica.
- Dry mediante la adición de sulfato de sodio anhidro hasta que la fase orgánica es perfectamente claro. Transferirlo a un tubo limpio. Entonces se evapora hasta 200 l. Transferir la muestra en un vial GC con parte.
6. DMOX Preparación a partir de 17 FAME
- Evaporar el extracto de FAME de la sección 3 con un flujo de nitrógeno (material seco de al menos 10 mg).
- Para el extracto seco FAME, añadir 250 mg de 2-amino-2-metil-1-propanol. Enjuague el recipiente con nitrógeno, añadir un tapón, y lo coloca en un bloque de calentamiento durante la noche a 190 ° C.
- Después de enfriar a temperatura ambiente, añadir 3 ml de diclorometano al tubo, y 5 ml agua purificada desionizada (Ver Tabla de Materiales).
- Agitar durante la separación de fases y extraer la fase acuosa.
- Se lava la fase orgánica con 5 ml de agua. Agitar durante la separación de fases y extraer la fase acuosa.
- En seco mediante la adición de sulfato de sodio anhidro hasta que la fase orgánica es perfectamente clara ytransferirlo a un tubo limpio. Se evapora bajo una corriente de nitrógeno hasta alcanzar un volumen de 200 l. Transferir la muestra en un vial GC con parte.
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Representative Results
La estrategia de identificación FA a partir de células bacterianas se presenta en la Figura 1. Cada paso proporciona información espectral complementaria o información acerca de la retención cromatográfica. Paso 1 consiste en la identificación preliminar FA utilizando una solución estándar. Paso 2 permite la interpretación de FAME EI espectros y su ECL, con el fin de identificar provisionalmente los productos. Paso 3 identifica la ubicación exacta de ramificación de cadena ramificada-AF. Por último, paso 4 identifica la posición precisa de dobles enlaces en conjuntos combustibles insaturado.
FAME y ECL
La mezcla BAME nos permitió identificar una serie de ácidos grasos saturados de cadena lineal (n12 a n17) y algunos metílicos de ácidos grasos (i15, A15, i16, i17) ramificado. Sin embargo, se detectaron muy pocos específica AF a B. cereus en nuestra muestra, lo que justifica el desarropo del método de identificación descrito a continuación.
AF independientemente de la longitud de la cadena, ramificados saturados (iso o anteiso) de una serie homóloga (es decir, una serie de compuestos con la misma fórmula general) muestran un cambio constante en ECL en comparación con el FA saturada lineal que tiene el mismo número de carbono en su -cadena de carbono. Este cambio, llamada longitud de la cadena fraccional (FCL), permite la identificación de conjuntos combustibles en una serie homóloga. Por ejemplo, iso-AF (indicada con el prefijo "i") tienen un valor de -0.48 FCL, mientras anteiso FAS (marcados con el prefijo "a") tienen un FCL de -0,33. Es entonces fácil para identificar un i14 y i13 con un ECL de 13,52 y 12,52, respectivamente, y un a13 y a15 con un ECL de 12,67 y 14,66, respectivamente.
Tabla 1 muestra los ECLS para cada uno de los conjuntos combustibles detectan en la muestra. Los tiempos de retención predicened para iso y anteiso serie, junto con MS espectros obtenidos con FAME, nos permitió identificar la totalidad de la cadena ramificada-FA de nuestra muestra. Dicha identificación en este paso era provisional, pero más tarde se confirmó por los espectros de la IE obtenido a partir de derivados FAs picolinilo.
FAMEs con LCE no correspondientes a la iso o anteiso cambios son insaturados, de cadena lineal o ramificada Fas, tal como se indica por la masa de su ion molecular. FAs insaturados muestran un cambio positivo en ECL en comparación con el correspondiente FA saturada. Spectra de derivados DMOX, combinados con los espectros de derivado picolinilo las AF ramificado, permite la identificación de la posición de doble enlace.
Tales métodos de derivatización son apropiados para la identificación del Rey Sólo cuando el orden de elución se mantiene, como se muestra para las tres mezclas de derivados (es decir, la fama, y DMOX picolinilo) en la figura2 para varios 16: 1 AF. Este enfoque permite la recogida de información espectral complementaria de un pico de 3 formas distintas de derivación que pueden combinarse para identificar la estructura de la FA. No se observaron diferencias en orden de elución entre los derivados de 3, aunque los tiempos de retención y las temperaturas del horno eran diferentes.
ésteres de picolinilo iso y anteiso de metilo de ácidos grasos saturados de cadena ramificada
Los espectros obtenidos por EI confirmar la presencia de conjuntos combustibles de cadena ramificada metilo. En efecto, los iones moleculares tienen la m / z correspondiente a FAS saturadas. Se observó una serie de iones con una diferencia de 14 unidades de masa (UMA) que corresponden a una pérdida de un grupo metileno, excepto en la región del punto de ramificación en el que el ion correspondiente al átomo de carbono sustituido falta. a continuación, se observa una diferencia de 28 amu entre los dos iones correspondientes a fragmentos creado antes ydespués de que el carbono ramificada. La Figura 3 muestra el espectro de i16 con los iones de diagnóstico (304 y 332) que muestra la ubicación de ramificación.
DMOX de ácidos grasos insaturados de cadena lineal
La figura 2 presenta cinco picos diferentes asociados con el 16: 1 de ácido graso. Los dos primeros picos tienen valores <16 ECL. Llegamos a la conclusión de que su estructura es, sin duda ramificado. La identificación de estos compuestos requiere la interpretación de espectros de masas obtenidos con DMOX y derivados de éster picolinilo. Tres picos que poseen ECL> 16 partido monoinsaturados ácidos grasos de cadena lineal. DMOX espectros de masas de derivados muestran iones de diagnóstico que identifican la posición del doble enlace de estos compuestos. En la Figura 4 se puede ver una diferencia de 12 amu ion entre 196 y 208 que indica la presencia del doble enlace con el carbono 8 de la n16: 1 Δ
DMOX y masa picolinilo espectros de metilo de cadena ramificada monounsatured ácidos grasos
La Figura 6 presenta los espectros de DMOX y derivados de éster picolinilo, usados para determinar la estructura de i16: 1 Δ 9 FA. La posición de lade ramificación se indica por una diferencia de 28 amu para ambos derivados. A diferencia de 12 amu por DMOX y 26 para el éster picolinilo identifica la posición doble enlace, como se muestra en la Figura 6.
La identificación de los ácidos grasos y iones de diagnóstico
La Tabla 1 muestra los diversos ácidos grasos identificados, con los iones de diagnóstico correspondientes, de Bacillus cereus ATCC 14579 cultivadas a 30 ° C. Estos iones de diagnóstico identificar las posiciones de la ramificación de metilo y dobles enlaces en la cadena de carbono para los derivados de éster y DMOX picolinilo, que proporcionan información estructural complementario. Los dos enfoques son realmente complementarios, como iones de diagnóstico son a veces más fáciles de observar con derivados DMOX, y en otros momentos más fácil de observar con derivados de picolinilo.
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Figura 1: Estrategia para la identificación de ácidos grasos en Bacillus cereus.
Se muestran los pasos sucesivos que generan información sobre los tiempos de retención (ECL), en el espectro de masas de la fama, de DMOX, y de picolinilo-éster. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Comparación de los perfiles cromatográficos para diferentes 16: ácidos grasos 1 detectados en Bacillus cereus.
(A) Los derivados de FAME (ion molecular extraído a m / z 268); (B) derivados DMOX (ion molecular extraído a m / z 307); Derivados de picolinilo (C) (ion molecular extraído a m / z 345).iles / ftp_upload / 54960 / 54960fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: picolinilo i16 espectro de masas derivado generado por ionización de electrones.
Los iones a m / z 151 y m / z 164 indican la presencia de un derivado de ácido graso picolinilo. El ion molecular a m / z 347 se identifica como un isómero de ácido palmítico. La presencia de un espacio de 28 amu entre el ion a m / z 304 y m / z 332 es indicativo de i16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: n16: 1 Δ 8 DMOX espectro de masas derivado generada por electronesionización.
El ión a m / z 126 indica un derivado DMOX, m / z 307 es el ion molecular de 16: 1 DMOX y la presencia de una diferencia de 12 amu entre los iones en m / z 196 y m / z 208 identifica la ubicación del doble enlace en el carbono 8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: n16: 1 Δ 5 DMOX espectro de masas derivado generado por ionización de electrones.
Ion a m / z 126 es indicativo de un derivado de DMOX y m / z 307 es el ion molecular de 16: 1 DMOX. La intensa m / z 153 ion es característica de un doble enlace situado en el carbono 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: DMOX (arriba) y picolinilo (abajo) la comparación de i16: 1Δ 9 espectros.
En ambos casos la diferencia de 28 amu indican la posición de la ramificación de metilo. La ubicación doble enlace se puede derivar por un espacio de 12 amu y 26 amu para los derivados DMOX y picolinilo, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| compuestos putativos | ion molecular (m / z) FAME; DMOX; picolinilo | RT | ECL | identificación confirmada | iones de diagnóstico DMOX | iones de diagnóstico picolinilo |
| i12 | 214; 253; 291 | 7.93 | ninguna referencia | i12 | [276 (15); 262 (0); 248 (15)] mb | |
| n12 | 214; 253; 291 | 8.21 | 12.00 | n12 | [276 (10); 262 (20); 248 (20)] mb | |
| i13 | 228; 267; 305 | 8.53 | 12.5 | i13 | [290 (15); 276 (0); 262 (48)] mb | |
| a13 | 228; 267; 305 | 8.64 | 12.67 | a13 | [276 (48); 262 (0); 248 (65)] mb | |
| i14 | 242; 281; 319 | 9.24 | 13.52 | i14 | [304 (20); 276 (45) 290 (0)] mb | |
| n14 | 242; 281; 319 | 9.60 | 14.00 | n14 | [304 (7); 290 (17); 276 (17)] mb | |
| i15 | 256; 295; 333 | 10.06 | 14.51 | i15 | [318 (20); 314 (0); 290 (50)] mb | |
| a15 | 256; 295; 333 | 10.19 | 14.66 | a15 | [304 (30); 290 (tr); 276 (62)] mb | |
| n15 | 256; 295; 333 | 10.49 | 15.00 | n15 | [318 (5); 304 (13); 290 (18)] mb | |
| i16 | 270; 309; 347 | 11.04 | 15.5 | i16 | [332 (18); 318 (tr); 304 (42)] mb | |
| metilo ramificado 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.19 | 15.64 | i16: 5 1Δ | [152 (2); 153 (10)] db [292 (3); 278 (tr); 264 (2)] mb | |
| metilo ramificado 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.40 | 15.83 | i16: 1 Δ 9 | [210 (3); 222 (3)] db [292 (12); 278 (tr); 264 (40)] mb | |
| n16 | 270; 309; 347 | 11.59 | 16.00 | n16 | [332 (5); 318 (15); 304 (15)] mb | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.78 | 16.14 | n16: 1 Δ 5 | [152 (2); 153 (10)] db | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.94 | 16.24 | n16: 1 Δ 8 | [196 (5); 208 (3)] db | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 12.00 | 16.31 | n16: 9 1Δ | [210 (3); 222 (3)] Db | |
| 16: 2 | 266; 305; 343 | 12.18 | 16.44 | n16: 2 Δ 5, Δ 9 | [152 (2); 153 (12)] db [208 (1); 220 (2)] db | |
| i17 | 284; 323; 361 | 12.25 | 16.5 | i17 | [346 (20); 332 (tr); 318 (35)] mb | |
| metilo ramificado 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.43 | 16.64 | i17: 5 1Δ | [152 (2); 153 (10)] db | [344 (10); 316 (5)] mb |
| a17 | 284; 323; 361 | 12.47 | 16.66 | a17 | [332 (30); 318 (0); 304 (52)] mb | |
| metilo ramificado 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.57 | 16.74 | i17: 8 1Δ | [196 (2); 208 (2)] db | [344 (10); 316 (5)] mb |
| metilo ramificado 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.64 | 16.79 | i17: 9 1Δ | [210 (3); 222 (3)] db | |
| metilo ramificado 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.70 | 16.84 | i17: 10 1Δ | [224 (1); 236 (1)] db | |
| metilo ramificado 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.84 | 16.94 | A17: 9 1Δ | [210 (3); 222 (4)] db | [330 (10); 316 (0); (90)] mb |
Tabla 1: Identificación de los ácidos grasos a partir de Bacillus cereus ATCC 14579.
Los tiempos de retención, los valores equivalentes longitud de la cadena (ECL), e iones moleculares de los ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) se muestran, junto con los iones moleculares e iones de diagnóstico para DMOX y derivados picolinilo.
[] Mb par de iones de diagnóstico que indica una pérdida de 28 amu correspondiente al fragmento de antes y después de la ramificación de carbono.
[] Db par de iones de diagnóstico que indica una pérdida de 12 amu correspondiente a la escisión de un doble enlace.
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Discussion
Los perfiles cromatográficos FAs mostrados en la Tabla 1 corresponden a B. cereus ATCC 14579 crecido en una superficie de la placa de agar. Se obtuvieron perfiles similares cuando la bacteria se cultivó en medio líquido aireado a la misma temperatura 8. En el caso de bacterias cultivadas en medio líquido, la biomasa bacteriana se recoge por centrifugación del medio de crecimiento y se puede lavar de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente dependiendo de las condiciones de crecimiento 8,19. La identificación de los diversos conjuntos combustibles producidos por B. cereus permite cambios precisos en la proporción de la FAS para ser detectados en cepas mutadas en algunos genes necesarios para el crecimiento a baja temperatura 7,9.
Por lo general, ECL se calcula utilizando valores de registro del tiempo de retención ajustado determinado a una temperatura fija (usando un horno con control de temperatura isotérmica) 20. Aquí, debido a la utilización de un horno no isotérmico a permit una separación optimizada de la fama de interés, el método de cálculo utilizado fue el descrito anteriormente para los índices de retención lineal 3,21.
El objetivo de este trabajo fue no para comparar los valores calculados ECL con los descritos en la literatura, pero para predecir la estructura FA, dentro del mismo perfil cromatograma, en base a estos datos de retención e información espectros. De hecho, para las AF saturados, un dado de ramificación (iso o anteiso) siempre hace que el mismo cambio en la ECL, en comparación con el equivalente de cadena lineal FA. Además, la ECL calcula en el presente estudio emparejado con valores medidos por Stransky 22 en una columna de polaridad equivalente. Esta concurrencia con los valores previamente reportados indica que los valores de ECL son por lo tanto muy útil para una rápida identificación de los picos de perfiles de FAs cromatograma de B. cereus cultivadas en otras condiciones, o de otras cepas (por ejemplo., Mutantes) de B. cereus.
derivados picolinilo proporcionan más iones característicos indicativos de la ubicación de ramificación que los iones generados por derivados DMOX, mientras que la posición del doble enlace se asigna más fácilmente con los derivados de DMOX. El presente estudio muestra la utilidad de la combinación de la información de ambos derivados para identificar el metilo de cadena ramificada insaturado AF de B. cereus, que hasta ahora han sido mal descrito en la literatura.
jove_content "> El enfoque propuesto se puede completar dentro de 2 días. A modo de comparación, por espectroscopia de RMN, cada FA debe ser purificado, que representa varias semanas de trabajo y una gran cantidad de material biológico. Sin embargo, el enfoque no diferencia la geometría ( cis, trans) de enlaces dobles. Una vez que se identifica cada AF, que se pueden cuantificar de forma rutinaria por sus derivados FAME, por ejemplo, para comparar las cepas bacterianas y mutantes o para estudiar el impacto de las condiciones de crecimiento. En nuestras manos, tan poco como 8 mg de células bacterianas frescas eran suficientes para la cuantificación de conjuntos combustibles, lo que hace el método aplicable a difíciles de cultivar las bacterias. el límite de cuantificación para cada uno de los conjuntos combustibles identificado es 1 ng / l de solución inyectada en el GC / MS.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Thomas Mison por su apoyo técnico, y para Rachel Kopec para la revisión del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
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