Abstract
Bacillus arter inneholder forgrenede og umettede fettsyrer (fettsyrer) med forskjellige stillinger av metylforgrening (iso anteiso eller) og av dobbeltbindingen. Endringer i FA sammensetning spille en avgjørende rolle i tilpasningen av bakterier til sitt miljø. Disse modifikasjoner medfører en endring i forholdet mellom iso anteiso versus forgrenede fettsyrer, og i andelen av umettede fettsyrer i forhold til mettede fettsyrer, med dobbeltbindinger som er opprettet ved spesifikke posisjoner. Nøyaktig identifikasjon av FA-profil er nødvendig å forstå tilpasningsmekanismene Bacillus arter.
Mange av fettsyrer fra Bacillus ikke er kommersielt tilgjengelige. Strategien foreslått heri identifiserer fettsyrer ved å kombinere informasjon om oppholdstiden (ved beregning av den tilsvarende kjedelengde (ECL)) med massespektra av tre typer FA av derivater: fettsyremetylestere (fames), 4,4-dimetyl-oksazolin- derivater (DMOX), og3-pyridylcarbinyl ester (pikolinylester-). Denne fremgangsmåte kan identifisere fettsyrer uten behov for å rense det ukjente fettsyrene.
Sammenligning av kromatografiske profiler av FAME fremstilt fra Bacillus cereus med en kommersiell blanding av standarder gir mulighet for identifisering av rettkjedede mettede fettsyrer, beregning av ECL, og hypoteser om identiteten til den andre fettsyrer. Slike fettsyremetylestere av forgrenete mettete fettsyrer, iso eller anteiso, viser en konstant negativ endring i ECL sammenlignet med lineære mettede fettsyrer med det samme antall karbonatomer. Slike fettsyremetylestere av umettede fettsyrer kan påvises ved massen av deres molekylære ioner, og resultere i en positiv forskyvning i ECL sammenlignet med de tilsvarende mettede fettsyrene.
Forgrenings stilling av fettsyrer og dobbeltbindingen stilling av umettede fettsyrer kan identifiseres ved elektron ioniseringsmassespektra av pikolinylester- og DMOX-derivater, henholdsvis. Denne tilnærmingen identifiserer alt det ukjente mettet grened fettsyrer, umettede rettkjedede fettsyrer og umettede forgrenede fettsyrer fra B. cereus ekstrakt.
Introduction
Fettsyremetylester (FAME) gasskromatografi (GC) er en viktig metode for lipid karakterisering. Den skiller seg raskt og kvantifiserer de forskjellige fettsyrer (FAS) av en prøve etter en kort ekstraksjonstrinn. Derivater av metylestere er svært flyktig, stabil og inert overfor den kromatografiske kolonne, og dermed unngå tailing topper. Deres identifikasjon er ganske grei når prøven består av kjente fettsyrer fordi de kromatografiske profilene er enten publisert eller i forhold til standarder. I tillegg er en gjentatt injeksjon av kalibreringsstandarder for kvantifisering av forskjellige fettsyrer ikke nødvendig, gitt deres nesten konstant respons på flammeioniseringsdeteksjon (FID) 1.
I tillegg til FID, gir massespektrometri (MS) deteksjon et komplementært sett med informasjon for å bekrefte Slike fettsyremetylestere. Men når Slike fettsyremetylestere belastes ved hjelp av elektron-ionisering (EI), de resulterende spektra ikke alltid tillater the identifisering av FA fin struktur. For eksempel, forgrening stilling (dvs. en forgrenet metylgruppe) er vanskelig å forutsi fordi de diagnostiske ioner er vanskelige å oppdage en og den karakteristiske forandring i mål-ion overflod er maskinavhengig, hindrer bruk av massespektrene biblioteker 2. En annen utfordring ligger i å identifisere dobbeltbindingen posisjon fordi EI fører dobbeltbinding migrasjon. Således kan FA isomerer med varierende dobbeltbinding-stillingene ikke kan differensieres ved deres massespektra. Heldigvis har andre verktøy er utviklet for FA identifikasjon. For eksempel kan tilstedeværelsen og posisjonen av forgrening eller dobbeltbindinger i fettsyrer bli antatt ved beregningen av tilsvarende kjedelengde (ECL) 3.
Andre derivatiseringsreaksjoner metoder resultere i ulike massespektra, avhengig av plasseringen av en dobbeltbinding eller en forgrenet metylgruppe. 4,4-dimetyl oksazolin derivater (DMOX) 4 gir mulighet for EASy identifikasjon av posisjonen til enumettet fettsyre-dobbeltbindinger. 3-pyridylcarbinyl ester (pikolinylester- esterderivater) åpner for entydig identifikasjon av plasseringen av metyl-forgrenede fettsyrer 5. Ved å kombinere kromatografisk retensjon (ECL) og massespektra (DMOX og pikolinylester-) informasjon muliggjør identifisering av de fleste fettsyrer, uten å måtte bruke kompliserte rensemetoder, som er nødvendig for kjernemagnetisk resonans (NMR) spektrum, det uncontestable fremgangsmåte for strukturell karakterisering 1 .
Bakterier av slekten Bacillus, som inkluderer noen humane og animalske patogener, er i stand til å kolonisere svært forskjellige nisjer og er derfor vidt distribuert i miljøet 6. Blant de Bacillus-slekten, blir FA sammensetning påvirkes av den økologiske nisje av artene med modulasjonene i FA-mønstre for å tilpasse seg til et bredt spekter av miljømessige endringer (for eksempel vekstmediet, temperatur,pH, etc.) 7-9. På grunn av den relative homogenitet i FA mønster på arter av slekten Bacillus i løpet av vekst i standardiserte forhold, bestemmelse av FA preparat er en av de grunnleggende kriterier som brukes for å definere Bacillus arter. En unik egenskap av Bacillus slekten er overflod av forgrenede fettsyrer som inneholder 12-17 karbonatomer 10-12 med forholdet mellom iso og anteiso isomerer være en viktig faktor for tilpasning til miljøforhold. Bacillus arter også tilpasse seg miljø svingninger ved å forandre andelen av umettede fettsyrer. I noen arter, for eksempel Bacillus cereus, to fettsyre desaturaser lage dobbeltbindinger i forskjellige posisjoner av alkylkjeden 13 med forskjellige roller i tilpasning 9. Eksempelet med Bacillus slekten illustrerer viktigheten av nøyaktig identifisering dobbeltbindingen stilling og FA forgrening. Samle innively, identifisering av Bacillus FA mønstre har flere nyttige programmer. Heri, foreslår vi en ny GC-MS metode for Bacillus FA mønster identifikasjon som overvinner de iboende begrensningene i en klassisk GC-MS analyse.
Denne innovative tilnærmingen kan brukes direkte på rå biologisk materiale, og består av en kombinasjon av eksisterende teknikker: informasjon om oppholdstider (ECL) og massespektra av ulike FAS derivater (FAME, DMOX og pikolinylester--ester).
Vi bruker følgende FA nomenklatur. i, en, og n angir iso, anteiso metyl forgrenet og rettkjedet fettsyre, henholdsvis. Umettede fettsyrer ble navngitt ved C: D hvor C er antallet karbonatomer i fettsyren og d er antallet dobbeltbindinger. Δ x angir posisjonen av dobbeltbindingen, hvor dobbeltbindingen er plassert på x.-karbon-karbonbinding, regnet fra karboksylsyren ende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bakteriekulturer
- Fremstille en plen av bakteriene (Bacillus cereus-stamme ATCC 14579) ved å spre 100 ul av en over natten kultur av stammen inkubert ved 30 ° C i LB (Luria-Bertani medium), på overflaten av en plate av LB-agar-medium. Platen inkuberes over natten ved 30 ° C.
2. ECL: Equivalent Chain Lengde
- Beregn ECL som følger:
med:
jeg, det oppløste av interesse;
n, karbon antall rettkjedet mettet fettsyre metylester eluering før oppløsningsmaterialet I;
n + 1, karbon antall rettkjedet mettet fettsyre metylester eluering etter oppløst stoff I;
RTI, RTN, Rt (n + 1) retensjonstidene av FAME topper beskrevet ovenfor.
MERK: Skaff retensjonstider av rettkjedede mettede fettsyrer metylestere ved injeksjon av en blanding av standarder (BAME).
med: 3. FAME Forberedelse og analyse
- For å oppnå lipid fettsyrer, høste bakterieceller ved skraping av koloniene fra agarplaten og overføres 40 mg (ferskvekt, tilsvarende 10 9 levedyktige celler) av bakterier inn i et 10 ml glassrør med skrulokk og PTFE-pakninger.
- Utfør transesterifiseringen via ester koblingen metoden 14,15 beskrevet nedenfor.
- Tilsett 5 ml 0,2 M KOH i metanol til den friske bakteriecellene og inkuber ved 37 ° C i 1 time. Denne reaksjon består av alkalisk metanolyse, bryte esterlink i lipid og produsere fettsyremetylestere.
- Tilsett 1 ml av 1 M eddiksyre for å senke pH til 7,0. Sjekk pH med pH teststrimler.
- Tilsett 3 ml heksan for å ekstrahere Slike fettsyremetylestere.
- Overfør supernatanten (organisk fase) til rene rør og konsentrer ved inndamping ved romtemperatur under en kontinuerlig strøm av nitrogen for å oppnå omtrent 200 ulekstrakt. Overfør prøven inn i en GC ampulle med innsatsen.
- Injiser ekstraktene til et gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS) system.
4. GC / MS betingelser
- Injiser FAME prøvene inn i et GC-MS-instrument utstyrt med en kapillar-kolonne ZB-WAX (lengde 30 m, diameter 0,25 mm, filmtykkelse, 0,25 mikrometer).
- Still injeksjonsporten (i splitless-modus) temperaturen til 250 ° C. Bruke helium som bæregass, med en lineær hastighet på 37 cm / sek. Hold temperaturen i ovnen ved 50 ° C i 1 min, øker til 190 ° C ved en hastighet på 20 ° C / min, og øker ytterligere til en slutt-temperatur på 230 ° C med en hastighet på 2 ° C / min.
- For MS, registrerer massespektra ved elektron ionisering (EI) på 70 eV, og sette oppkjøpet av den totale ion strømmen mellom 50 og 400 atommasseenhet (AMU) (2 skanninger / sek).
- Når det er nødvendig, injisere DMOX og pikolinylester- derivater under samme tilstand except den temperaturprogram ovn som følger:
DMOX: 50 ° C (1 min), 20 ° C / min til 210 ° C og 2 ° C / min til 240 ° C (5 min);
Pikolinylester-: 6 ° C (1 min), 20 ° C / min til 220 ° C og 2 ° C / min til 250 ° C (20 min).
5. pikolinylester- Ester klargjøring fra FAME 16
- Fordamp FAME ekstrakt fra del 3 med en strøm av nitrogen (minst 10 mg tørt materiale) og oppløses i 1 ml tørr diklormetan.
- Fremstille en 1,0 M løsning av kalium-ter t-butoksyd i tetrahydrofuran.
- Tilsett FAME ekstrakt og 0,2 ml 3-pyridinmetanol til 0,1 ml oppløsning laget i trinn 5.2.
- Oppvarm løsningen ved 40 ° C i 30 min i en lukket ampulle.
- Etter avkjøling til romtemperatur, tilsett renset deionisert vann (2 ml, se Materialer tabell) og heksan (4 ml). Bland med en vortex, tillate fase for å separere og samle inn den organiske fase.
- Dry det ved tilsetning av vannfritt natriumsulfat inntil den organiske fase er helt klart. Overføre den til et rent rør. Da fordamper til 200 mL. Overfør prøven inn i en GC ampulle med innsatsen.
6. DMOX Forberedelse fra FAME 17
- Fordamp FAME ekstrakt fra del 3 med en strøm av nitrogen (minst 10 mg tørt materiale).
- Til den FAME tørr ekstrakt, tilsett 250 mg av 2-amino-2-metyl-1-propanol. Skyll beholderen med nitrogen, legge til en propp, og legg den i en varmeblokk over natten ved 190 ° C.
- Etter avkjøling til romtemperatur, tilsett 3 ml diklormetan til røret, og 5 ml renset deionisert vann (se Materialer tabell).
- Rist for faseseparasjon og deretter fjerne vannfasen.
- Vask den organiske fase med 5 ml vann. Rist for faseseparasjon og deretter fjerne vannfasen.
- Tørr ved tilsetning av vannfritt natriumsulfat inntil den organiske fase er helt klart ogoverføre den til et rent rør. Fordampe under en strøm av nitrogen inntil nå et volum på 200 ul. Overfør prøven inn i en GC ampulle med innsatsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Strategien med FA identifikasjon fra bakterieceller er vist i figur 1. Hvert trinn gir utfyllende spektral informasjon eller informasjon om kromatografisk oppbevaring. Trinn 1 består av innledende FA-identifikasjon ved å bruke en standardløsning. Trinn 2 gjør det mulig for tolkingen av FAME EI-spektra og deres ECL, for å forsøksvis identifisere produktene. Trinn 3 identifiserer den nøyaktige forgrening beliggenhet i forgrenede-fettsyrene. Endelig trinn 4 identifiserer den nøyaktige posisjonen til dobbeltbindinger i umettede fettsyrene.
FAME og ECL
Den BAME blanding tillatt oss å identifisere en rekke rettkjede mettede fettsyrer (N12 n17) og noen metyl forgrenet fettsyre (I15, A15, I16, I17). Det ble imidlertid svært få fotballforbund bestemt til B. cereus detekteres i vårt utvalg, begrunner utvikledepment av identifikasjonsmetode som er beskrevet nedenfor.
Uavhengig av kjedelengde, forgrenede mettede fettsyrer (iso eller anteiso) av en homolog serie (dvs. en serie av forbindelser med den samme generelle formel) viser en konstant forskyvning i ECL sammenlignet med den rette mettet FA med det samme antall av karbon i sin carbon-kjede. Dette skiftet, kalt fraksjonert kjedelengde (FCL), gir mulighet for identifisering av fettsyrer i en homolog serie. For eksempel, iso-fettsyrer (merket med prefikset "i") har en FCL verdi på -0,48, mens anteiso fotballforbund (betegnet med prefikset "a") har en FCL av -0,33. Det er så lett å identifisere en I14 og I13 med en ECL av 13.52 og 12.52, henholdsvis, og en A13 og A15 med en ECL av 12.67 og 14.66 henholdsvis.
Tabell 1 viser ECLs for hver av FAS oppdaget i vårt utvalg. Tilbakeholdelsestider forutsied for iso og anteiso serien, sammen med MS spektra med Slike fettsyremetylestere, tillot oss å identifisere alle de forgrenede-FA fra vårt utvalg. En slik identifikasjon på dette trinnet var foreløpig, men senere bekreftet av EI spektra fra pikolinylester- FAS derivater.
Slike fettsyremetylestere med ECLs ikke svarer til den iso anteiso eller forskyvninger er umettet, rettkjedet eller forgrenet fettsyrer, som vist ved massen av deres molekylære ion. Umettede fettsyrer viser en positiv endring i ECL sammenlignet med tilsvarende mettede FA. Spektra fra DMOX derivater, kombinert med spektra fra pikolinylester- derivat for forgrenede fettsyrer, gir mulighet for identifisering av dobbeltbindingen stilling.
Slike derivatiseringsreaksjoner metoder som er aktuelle for FA identifikasjon når eluering bestillingen er beholdt, slik det er vist for de tre avledede blandinger (dvs. FAME, DMOX og pikolinylester-) i Figur2 for flere 16: 1 fas. Denne tilnærmingen muliggjør innsamling av komplementære spektral informasjon fra en topp ved bruk av 3 derivatiseringsreaksjoner metoder som kan kombineres for å identifisere FA struktur. Det ble ikke observert forskjeller i eluering rekkefølgen mellom de 3 derivater, selv om retensjonstider og ovn temperaturer var annerledes.
Pikolinylester- estere av iso og anteiso metyl forgrenet mettet fettsyre
Den oppnådde ved EI spektra bekrefter nærvær av metyl- forgrenede fettsyrer. Faktisk, de molekylære ioner har m / z tilsvarende mettede fettsyrene. Vi har observert et ion serie med et gap på 14 masseenheter (AMU) som tilsvarer et tap av en metylengruppe, bortsett fra i området ved grenpunktet hvor mangler ion svarende til det substituerte karbonatom. Vi observerer en avstand på 28 amu mellom de to ionene som tilsvarer fragmenter opprettet før ogetter forgrenet karbon. Figur 3 viser spekteret for I16 med de diagnostiske ioner (304 og 332) som viser forgrening sted.
DMOX av rett-kjedede umettede fettsyrer
Figur 2 viser fem forskjellige topper som er knyttet til 16: 1 fettsyre. De to første toppene har ECL verdier <16. Vi konkluderer med at deres struktur er absolutt forgrenet. Identifiseringen av disse forbindelser krever tolkning av massespektra produsert av DMOX og pikolinylester- esterderivater. Tre topper besitter ECL> 16 kamp enumettet rett fettsyrer. DMOX avledede massespektra viser diagnostiske ioner som identifiserer posisjonen av dobbeltbindingen av disse forbindelser. I figur 4 kan vi se et gap på 12 amu ion mellom 196 og 208 indikerer nærværet av dobbeltbinding med karbonet 8 av N16: 1 Δ
DMOX og pikolinylester- massespektra av metyl-forgrenet monounsatured fettsyrer
Figur 6 viser spektra av DMOX og pikolinylester--derivater, som brukes for å bestemme strukturen av I16: 1 Δ 9 FA. Stillingen avforgrening er angitt med et gap på 28 amu for begge derivater. Et gap på 12 amu for DMOX og 26 for pikolinylester- ester identifiserer dobbeltbindingen stilling, som vist i figur 6.
Identifikasjon av fettsyrene og diagnostiske ioner
Tabell 1 viser de ulike fettsyrene identifisert, med de tilsvarende diagnostiske ioner, i Bacillus cereus ATCC 14579 dyrket ved 30 ° C. Disse diagnostiske ioner identifisere posisjonene til metyl-forgrening og dobbeltbindinger på karbonkjeden for DMOX og pikolinylester- ester-derivater, som gir komplementære strukturell informasjon. De to tilnærmingene er virkelig utfyllende, som diagnostiske ioner er noen ganger lettere å observere med DMOX derivater, og andre ganger lettere å observere med pikolinylester- derivater.
src = "/ files / ftp_upload / 54960 / 54960fig1.jpg" />
Figur 1: Strategi for identifisering av fettsyrer i Bacillus cereus.
De påfølgende trinn genererer informasjon om oppholdstider (ECL), på massespektra av FAME, av DMOX, og av pikolinylester--ester vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Sammenligning av kromatografiske profiler for forskjellige 16: 1 fettsyrer som detekteres i Bacillus cereus.
(A) FAME derivater (molekylært ion ekstrahert ved m / z 268); (B) DMOX derivater (molekylært ion ekstrahert ved m / z 307); (C) pikolinylester- derivater (molekylært ion ekstrahert ved m / z 345).iles / ftp_upload / 54960 / 54960fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: I16 pikolinylester- derivat massespektrum som genereres av elektron ionisering.
Ioner ved m / z 151 og m / z 164 indikere nærværet en pikolinylester- derivat av fettsyre. Den molekylære ion ved m / z 347 er identifisert som en isomer av palmitinsyre. Tilstedeværelsen av et gap på 28 amu mellom ion ved m / z 304 og m / z 332 indikerer I16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: n16: 1 Δ 8 DMOX derivat massespektrum som genereres av elektronionisering.
Den ion ved m / z 126 angir en DMOX derivat, m / z 307 er det molekylære ion av 16: 1 DMOX og tilstedeværelsen av et gap på 12 amu mellom ioner ved m / z 196 og m / z 208 identifiserer plasseringen dobbeltbinding på karbon 8. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: n16: 1 Δ 5 DMOX derivat massespektrum som genereres av elektron ionisering.
Ion ved m / z 126 er indikativ for en DMOX derivat og m / z 307 er det molekylære ion av 16: 1 DMOX. Den intense m / z 153 ion er karakteristisk for en dobbeltbinding ligger på karbon 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: DMOX (øverst) og pikolinylester- (nederst) sammenligning av I16: 1Δ 9 spektra.
I begge tilfeller gap på 28 amu indikere posisjonen av metyl-forgrening. Dobbeltbindingen posisjon kan utledes ved en avstand på 12 amu og 26 amu for DMOX og pikolinylester--derivater, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| antatte forbindelser | Molecular ion (m / z) FAME; DMOX; pikolinylester- | RT | ECL | bekreftet identifikasjon | Diagnostiske ioner DMOX | Diagnostiske ioner pikolinylester- |
| i12 | 214, 253, 291 | 7.93 | ingen referanse | i12 | [276 (15), 262 (0); 248 (15)] mb | |
| n12 | 214, 253, 291 | 8.21 | 12.00 | n12 | [276 (10), 262 (20); 248 (20)] mb | |
| I13 | 228, 267, 305 | 8.53 | 12,5 | I13 | [290 (15), 276 (0); 262 (48)] mb | |
| a13 | 228, 267, 305 | 8,64 | 12.67 | a13 | [276 (48), 262 (0); 248 (65)] mb | |
| I14 | 242, 281, 319 | 9.24 | 13.52 | I14 | [304 (20); 276 (45) 290 (0)] mb | |
| N14 | 242, 281, 319 | 9,60 | 14.00 | N14 | [304 (7), 290 (17); 276 (17)] mb | |
| I15 | 256, 295, 333 | 10,06 | 14.51 | I15 | [318 (20), 314 (0); 290 (50)] mb | |
| a15 | 256, 295, 333 | 10.19 | 14.66 | a15 | [304 (30), 290 (st); 276 (62)] mb | |
| N15 | 256, 295, 333 | 10.49 | 15.00 | N15 | [318 (5), 304 (13); 290 (18)] mb | |
| I16 | 270; 309, 347 | 11.04 | 15.5 | I16 | [332 (18); 318 (st); 304 (42)] mb | |
| metyl forgrenet 16: 1 | 268; 307, 345 | 11.19 | 15.64 | I16: 1Δ 5 | [152 (2), 153 (10)] db [292 (3), 278 (st); 264 (2)] mb | |
| metyl forgrenet 16: 1 | 268; 307, 345 | 11.40 | 15.83 | I16: 1 Δ 9 | [210 (3), 222 (3)] db [292 (12), 278 (st); 264 (40)] mb | |
| N16 | 270; 309, 347 | 11.59 | 16.00 | N16 | [332 (5), 318 (15); 304 (15)] mb | |
| 16: 1 | 268; 307, 345 | 11.78 | 16.14 | n16: en Δ 5 | [152 (2), 153 (10)] db | |
| 16: 1 | 268; 307, 345 | 11.94 | 16.24 | n16: en Δ 8 | [196 (5), 208 (3)] db | |
| 16: 1 | 268; 307, 345 | 12.00 | 16,31 | n16: 1Δ 9 | [210 (3), 222 (3)] Db | |
| 16: 2 | 266; 305, 343 | 12.18 | 16.44 | n16: 2 Δ 5, Δ 9 | [152 (2), 153 (12)] db [208 (1), 220 (2)] db | |
| I17 | 284, 323, 361 | 12.25 | 16.5 | I17 | [346 (20), 332 (st); 318 (35)] mb | |
| methyl forgrenet 17: 1 | 282, 321, 359 | 12.43 | 16.64 | I17: 1Δ 5 | [152 (2), 153 (10)] db | [344 (10), 316 (5)] mb |
| A17 | 284, 323, 361 | 12.47 | 16.66 | A17 | [332 (30); 318 (0); 304 (52)] mb | |
| methyl forgrenet 17: 1 | 282, 321, 359 | 12.57 | 16.74 | I17: 1Δ 8 | [196 (2), 208 (2)] db | [344 (10), 316 (5)] mb |
| methyl forgrenet 17: 1 | 282, 321, 359 | 12.64 | 16.79 | I17: 1Δ 9 | [210 (3), 222 (3)] db | |
| methyl forgrenet 17: 1 | 282, 321, 359 | 12.70 | 16.84 | I17: 1Δ 10 | [224 (1), 236 (1)] db | |
| methyl forgrenet 17: 1 | 282, 321, 359 | 12,84 | 16.94 | A17: 1Δ 9 | [210 (3), 222 (4)] db | [330 (10), 316 (0); (90)] mb |
Tabell 1: Identifikasjon av fettsyrer fra Bacillus cereus ATCC 14579.
Retensjonstider, tilsvarende kjedelengde (ECL) verdier, og molekylære ioner for fettsyremetylestere (fames) er vist, sammen med molekylære ioner og diagnostiske ioner for DMOX og pikolinylester- derivater.
[] Mb diagnostisk ionepar som indikerer et tap av 28 amu tilsvarende fragment før og etter karbon forgrening.
[] Db diagnostisk ionepar som indikerer et tap av 12 amu svarende til spalting av en dobbeltbinding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fas-kromatogram profilene som er vist i tabell 1 samsvarer med B. cereus ATCC 14579 dyrket på en agarplate overflate. Lignende profiler ble oppnådd når bakterien ble dyrket i utluftet flytende medium ved den samme temperatur 8. I tilfellet med bakterier som var dyrket i flytende medier, er den bakterielle biomasse samlet opp ved sentrifugering av vekstmediet og kan vaskes i henhold til tidligere beskrevne protokoller avhengig av vekstbetingelsene 8,19. Identifiseringen av de forskjellige fettsyrer som er produsert av B. cereus tillates gode endring i andelen av fettsyrer som skal påvises i stammer muterte på noen gener som er nødvendige for vekst ved lav temperatur 7,9.
Vanligvis er ECL beregnes ved hjelp av log-verdier for det justerte retensjonstid bestemmes ved en fast temperatur (ved hjelp av en ovn med isotermisk temperaturkontroll) 20. Her, på grunn av bruken av en ikke-isotermisk ovn til permit en optimalisert separasjon av FAME av interesse, beregningsmetoden som ble benyttet var som tidligere beskrevet for lineære oppbevaring indekser 3,21.
Hensikten med dette arbeidet var ikke til å sammenligne de beregnede ECL-verdier med de som er beskrevet i litteraturen, men for å forutsi den FA struktur, i løpet av den samme kromatogrammet profil, på grunnlag av disse data og oppbevaring spektra informasjon. Faktisk, for mettede fettsyrer, en gitt forgrening (iso anteiso eller) alltid forårsaker samme skift i ECL sammenlignet med de tilsvarende rettkjedede FA. I tillegg ECL beregnet i denne studien sammenliknes med verdiene målt ved Stransky 22 på en kolonne med tilsvarende polaritet. Dette sammenfall med tidligere rapporterte verdier indikerer at ECL verdier er derfor svært nyttig for en rask identifisering av toppene fra FAS kromatogram profiler av B. cereus dyrket i andre forhold, eller av andre stammer (f.eks., Mutanter) av B. cereus.
Pikolinylester- derivater gi flere karakteristiske ioner som indikerer den forgrenede sted enn ionene som genereres ved DMOX derivater, mens posisjonen til dobbeltbindingen er lettere tilordnet med DMOX derivater. Den foreliggende undersøkelse viser nytten av å kombinere informasjon fra begge derivater for å identifisere metyl- forgrenede umettede fettsyrer fra B. cereus, som inntil nå har vært dårlig beskrevet i litteraturen.
jove_content "> Den foreslåtte tilnærmingen kan fullføres i løpet av 2 dager. Som en sammenligning for NMR-spektroskopi, bør hver FA bli renset, som representerer flere ukers arbeid og en stor mengde biologisk materiale. Imidlertid ikke tilnærmingen ikke differensiere geometrien ( cis, trans) av dobbelt grenser. Når hver enkelt FA er identifisert, kan de bli rutinemessig kvantifisert ved deres FAME derivater, for eksempel, for å sammenligne bakteriestammer og mutanter eller for å studere virkningen av vekstbetingelsene. i våre hender, så lite som 8 mg av friske bakterieceller var tilstrekkelig for kvantifisering av fettsyrer, noe som gjør metoden anvendelig for å vanskelig å dyrke bakterier. kvantifiseringen grense for hver av de identifiserte fettsyrer er 1 ng / ul av oppløsning injisert i GC / MS.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfattere er takknemlige til Thomas Mison for sin tekniske støtte, og til Rachel Kopec for å revidere manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
References
- Christie, W. W., Han, X. Lipid Analysis 4th Edition. , Oily press. (2010).
- HÜbschmann, H. -J. Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition. , Wiley-vch. (2015).
- Sasser, M. Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids. MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).
- Spitzer, V. Structure analysis of fatty acids by gas chromatography - Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives - A review. Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).
- Harvey, D. J. Advances in lipid methodology. Volume 1. Christie, W. W. , Oily press. Dundee. 19-80 (1992).
- Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebretière, M. -H., Broussolle, V., Brillard, J. Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation. Front Microbiol. 6, (2015).
- Brillard, J., et al. Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).
- de Sarrau, B., et al. Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties. Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).
- Diomandé, S. E., et al. Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth. Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).
- Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P. Applications and Systematics of Bacillus and Relatives. Berkeley, R. C. W. , Blackwell Science Publ. 1-7 (2002).
- Kämpfer, P. Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species. System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).
- Kaneda, T. Fatty-acids of genus bacillus - example of branched-chain preference. Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).
- Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).
- Sasser, M., et al. Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters. J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).
- Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities. Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).
- Destaillats, F., Angers, P. One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids. J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).
- Fay, L., Richli, U. Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization. J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).
- Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids. Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).
- de Sarrau, B., et al. Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions. Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).
- Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters. Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).
- van Den Dool, H., Kratz, P. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).
- Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids. J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).
