Abstract
Bacillus species bevatten vertakte keten en onverzadigde vetzuren (FA's) met verschillende posities van de methylvertakking (iso- of anteiso) en de dubbele binding. Veranderingen in FA samenstelling spelen een cruciale rol in de aanpassing van bacteriën aan hun omgeving. Deze veranderingen leiden tot een verandering in de verhouding van iso versus anteiso vertakte FA, en in de hoeveelheid onverzadigde FA opzichte van verzadigde FA's met dubbele bindingen gemaakt op specifieke posities. Nauwkeurige beschrijving van de FA profiel moet de aanpassingsmechanismen van Bacillus species begrijpen.
Veel van de FA van Bacillus zijn niet commercieel beschikbaar. De hierin voorgestelde strategie identificeert FA's door het combineren van informatie over de retentietijd (door berekening van de equivalente ketenlengte (ECL)) met de massa spectra van drie soorten FA derivaten: vetzuurmethylesters (FAME), 4,4-dimethyl oxazoline derivaten (DMOX), en3-pyridylcarbinyl ester (picolinyl). Deze methode kan de FA identificeren zonder de noodzaak om de onbekende FA zuiveren.
Vergelijking chromatografische profielen van FAME bereid uit Bacillus cereus met een commercieel mengsel van standaarden maakt de identificatie uit onvertakte verzadigde FA's, de berekening van de ECL en hypotheses over de identiteit van de andere FA. FAME vertakte verzadigde FA's, iso- of anteiso, vertonen een constante negatieve verschuiving in de ECL, vergeleken met lineaire verzadigde FA's met hetzelfde aantal koolstofatomen. FAME onverzadigde FA kan worden gedetecteerd door de massa van de moleculaire ionen en leiden tot een positieve verandering in de ECL vergeleken met de overeenkomstige verzadigde FA's.
De vertakking positie van FA en de dubbele binding positie van onverzadigde FA kan worden geïdentificeerd door het elektron ionisatie massaspectra van picolinyl en DMOX derivaten, respectievelijk. Deze benadering identificeert alle onbekende verzadigde taked FA, onverzadigde rechte keten FA en onverzadigde vertakte FA uit de B. cereus extract.
Introduction
Vetzure methylester (FAME) gaschromatografie (GC) is een belangrijke methode voor lipide karakterisering. Al snel scheidt en kwantificeert de verschillende vetzuren (FA) van een monster na een korte extractiestap. Derivaten van methylesters zijn zeer volatiel, stabiel en inert ten opzichte van de chromatografiekolom, waardoor pieken met staarten vermeden. Hun identificatie is vrij eenvoudig als het monster uit bekende FA omdat de chromatografische profielen ofwel gepubliceerd of in vergelijking met de normen. Bovendien wordt de herhaalde injectie van kalibratiestandaarden voor het kwantificeren van verschillende FA niet vereist, gezien hun nagenoeg constant reactie op vlamionisatiedetectie (FID) 1.
Naast FID, massaspectrometrie (MS) detectie levert een reeks aanvullende informatie FAME bevestigen. Echter, wanneer FAME's worden opgeladen met behulp van electron ionisatie (EI), de resulterende spectra niet altijd mogelijk voor the identificatie van FA fijne structuur. Bijvoorbeeld, vertakking positie (dat wil zeggen een vertakte methylgroep) is moeilijk te voorspellen, omdat de diagnostische ionen zijn moeilijk op te sporen 1 en Karakteristiek doelion overvloed machine-afhankelijk, die het gebruik van massaspectra bibliotheken 2. Een andere uitdaging ligt in het identificeren van de dubbele binding positie, omdat EI veroorzaakt dubbele binding migratie. Zo kan FA isomeren met verschillende dubbele binding posities niet worden onderscheiden door hun massa spectra. Gelukkig zijn andere instrumenten ontwikkeld voor FA identificatie. Zo kan de aanwezigheid en de positie van vertakking of dubbele bindingen in FA worden gegist door berekening van de equivalente ketenlengte (ECL) 3.
Derivatisering andere methoden resulteren in verschillende massaspectra, afhankelijk van de plaats van een dubbele binding of een vertakte methylgroep. 4,4-dimethyl oxazoline derivaten (DMOX) 4 zorgen voor EASy identificatie van de plaats van enkelvoudig onverzadigde vetzuren dubbele bindingen. 3-pyridylcarbinyl ester (picolinyl ester) derivaten zorgen voor de ondubbelzinnige identificatie van de locatie van methylvertakte FA 5. Combineren chromatografische (ECL) en massaspectra (DMOX en picolinyl) informatie kan bij de identificatie van de meeste FA zonder dat ingewikkelde zuiveringsmethoden gebruikt, zoals vereist voor kernspinresonantie (NMR) spectrum, het onbetwistbaar werkwijze voor structuurkarakterisering 1 .
Bacteriën van het genus Bacillus, die een aantal menselijke en dierlijke pathogenen omvatten, kunnen zeer divers niches koloniseren en worden daarom op grote schaal in het milieu 6. Onder het geslacht Bacillus, wordt FA vorm beïnvloed door de ecologische niche van de diersoorten die modulaties in FA patronen aan te passen aan uiteenlopende omgevingsveranderingen (bijvoorbeeld groeimedium, temperatuur,pH, etc.) 7-9. Vanwege de relatieve homogeniteit van de FA patroon over species van het genus Bacillus tijdens de groei in gestandaardiseerde omstandigheden bepaling FA samenstelling is één van de belangrijkste criteria voor de Bacillus species definiëren. Een unieke eigenschap van de Bacillus genus is de overvloed van vertakte FA's met 12-17 koolstoffen 10-12 met de verhouding tussen iso en anteiso isomeren als een belangrijke determinant van de aanpassing aan de milieu-omstandigheden. Bacillus species tevens aan aan omgevingschommelingen door het veranderen van de hoeveelheid onverzadigde vetzuren. In sommige species, zoals Bacillus cereus, twee vetzuurdesaturasen maken dubbele bindingen in verschillende posities van de alkylketen 13 verschillende rollen in aanpassing 9. Het voorbeeld van de Bacillus genus illustreert het belang van de dubbele binding positie nauwkeurig identificeren en FA vertakking. Verzamelensluitend, de identificatie van Bacillus FA patronen heeft verschillende nuttige toepassingen. Hierin stellen we een nieuwe GC-MS benadering voor Bacillus FA patroonidentificatie dat de inherente beperkingen van een klassieke GC-MS analyse overwint.
Deze innovatieve benadering kan direct worden gebruikt op ruw biologisch materiaal, en bestaat uit een combinatie van bestaande technieken: gegevens over retentietijden (ECL) en massaspectra van verschillende FA derivaten (FAME, DMOX en picolinyl-ester).
We gebruiken de volgende FA nomenclatuur. i, een en n geven iso, anteiso methylgroep vertakt en onvertakt vetzuur, respectievelijk. Onverzadigde FA werden genoemd door C: d waarin C het aantal koolstofatomen in het vetzuur en d is het aantal dubbele bindingen. Δ x de positie van de dubbele binding, waarbij de dubbele binding zich op de xe koolstof-koolstofbinding, vanaf de carbonzuureindgroep.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bacteriële Culturen
- Bereid een grasveld van de bacterie (Bacillus cereus-stam ATCC 14579) door het verspreiden van een 100 pl overnachtkweek van de stam geïncubeerd bij 30 ° C in LB (Luria-Bertani medium), over het oppervlak van een plaat van LB-agarmedium. Incubeer de plaat overnacht bij 30 ° C.
2. ECL: Equivalent Chain Lengte
- Bereken ECL als volgt:
met:
i, de opgeloste stof van belang;
n het aantal koolstofatomen van de rechte keten verzadigd vetzuur methylester geëlueerd voordat opgeloste I;
n + 1, het aantal koolstofatomen van de rechte keten verzadigd vetzuur methylester elueren na opgeloste I;
Rti, Rtn, Rt (n + 1) de retentietijd FAME toppen boven beschreven.
OPMERKING: Haal de retentietijd rechte keten verzadigde vetzuren methylesters door injectie van een mengsel van standaarden (BEEN MIJ).
met: 3. FAME Voorbereiding en Analyse
- Om lipide vetzuren, oogst bacteriële cellen te verkrijgen door het afschrapen van kolonies van de agar plaat en de overdracht van 40 mg (vers gewicht, gelijk aan 10 9 levensvatbare cellen) van bacteriën in een 10 ml glazen buis met schroefdop en PTFE afdichtingen.
- Voer transveresteringsreactie via de ester koppeling methode 14,15 hieronder beschreven.
- Voeg 5 ml 0,2 M KOH in methanol aan de verse bacteriële cellen en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Deze reactie omvat alkalische methanolyse, het breken van de esterbinding in het lipide en het produceren van vetzuurmethylesters.
- Voeg 1 ml van 1 M azijnzuur om de pH te verlagen tot 7,0. Controleer de pH met een pH-teststrips.
- Voeg 3 ml hexaan te extraheren FAME.
- Transfer supernatant (organische fase) naar schone buizen en geconcentreerd door verdampen bij kamertemperatuur onder een continue stikstofstroom tot ongeveer 200 pi vindenextract. Breng het monster in een GC flacon met insert.
- Injecteren extracten in een gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) systeem.
4. GC / MS Voorwaarden
- Injecteer FAME monsters in een GC-MS instrument uitgerust met een capillaire kolom ZB-WAX (lengte 30 m, diameter 0,25 mm, filmdikte 0,25 pm).
- Stel de injectiepoort (in splitless modus) temperatuur tot 250 ° C. Gebruik helium als draaggas, met een lineaire snelheid van 37 cm / sec. Houd de oventemperatuur bij 50 ° C gedurende 1 min, toenemen tot 190 ° C met een snelheid van 20 ° C / min, en verder toenemen tot een eindtemperatuur van 230 ° C met een snelheid van 2 ° C / min.
- Voor de MS, noteer de massa spectra door electron ionisatie (EI) bij 70 eV, en stel de overname van de totale ionenstroom tussen de 50 en 400 atomaire massa eenheden (ame) (2 scans / sec).
- Wanneer dat nodig is, te injecteren DMOX en picolinyl derivaten onder dezelfde omstandigheden, behalvet de oven temperatuurprogramma als volgt:
DMOX: 50 ° C (1 min), 20 ° C / min tot 210 ° C en 2 ° C / min tot 240 ° C (5 min);
Picolinyl: 6 ° C (1 min), 20 ° C / min tot 220 ° C en 2 ° C / min tot 250 ° C (20 min).
5. picolinyl Ester Bereiden uit FAME 16
- Damp het FAME extract uit deel 3 met een stikstofstroom (ten minste 10 mg droog materiaal) en los op in 1 ml droge dichloormethaan.
- Bereid een 1,0 M oplossing van kalium-ter-t-butoxide in tetrahydrofuran.
- Voeg de FAME extract en 0,2 ml 3-pyridinemethanol tot 0,1 ml oplossing bereid in stap 5.2.
- Verwarm de oplossing bij 40 ° C gedurende 30 min in een afgesloten buisje.
- Na afkoelen tot kamertemperatuur, voeg gezuiverd gedeïoniseerd water (2 ml, zie Materialen tabel) en hexaan (4 ml). Meng met een vortex, laat fase te scheiden, en het verzamelen van de organische fase.
- Dry door toevoeging van watervrij natriumsulfaat totdat de organische fase is volkomen duidelijk. Deze hoeveelheid in een schone buis. verdampen dan naar 200 ui. Breng het monster in een GC flacon met insert.
6. DMOX Bereiden uit FAME 17
- Damp het FAME extract uit deel 3 met een stikstofstroom (ten minste 10 mg droog materiaal).
- De FAME droge extract, voeg 250 mg 2-amino-2-methyl-1-propanol. Spoel het vat met stikstof, voeg een stopper, en plaats deze in een verwarmings-blok 's nachts bij 190 ° C.
- Na afkoelen tot kamertemperatuur, voeg 3 ml dichloormethaan aan de buis en 5 ml gezuiverd gedeïoniseerd water (zie tabel Materials).
- Schud voor fasescheiding en verwijder de waterige fase.
- Was de organische fase met 5 ml water. Schud voor fasescheiding en verwijder de waterige fase.
- Drogen toevoeging watervrij natriumsulfaat totdat de organische fase volkomen helder endeze hoeveelheid in een schone buis. Verdamp onder een stikstofstroom, totdat de volume van 200 pl. Breng het monster in een GC flacon met insert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De strategie van FA identificatie van bacteriële cellen is weergegeven in figuur 1. Elke stap geeft aanvullende spectrale informatie of informatie over chromatografische. Stap 1 bestaat uit voorlopige FA-identificatie door een standaardoplossing. Stap 2 zorgt voor de interpretatie van FAME EI spectra en de ECL, teneinde de producten voorlopig identificatie. Stap 3 identificeert de exacte vertakking locatie in vertakte-FA's. Tot slot, stap 4 identificeert de precieze positie van dubbele bindingen in onverzadigde FA.
FAME en ECL
Het BAME mengsel verkregen we een reeks rechte keten verzadigde vetzuren (N12 N17) opsporen en methyl vertakte vetzuur (i15, a15, i16, i17). Echter, zeer weinig FA's die specifiek zijn voor B. cereus werden gedetecteerd in onze steekproef, op grond waarvan de ontwikpment van de identificatiemethode hieronder beschreven.
Ongeacht de ketenlengte, vertakte verzadigde FA (iso- of anteiso) van een homologe serie (dwz een aantal verbindingen met dezelfde algemene formule) vertonen een constante verschuiving van ECL opzichte van de rechte verzadigde FA met hetzelfde aantal koolstofatomen in hun koolstofketen. Deze verschuiving, genaamd fractionele ketenlengte (FCL), maakt de identificatie van FA in een homologe reeks. Bijvoorbeeld, iso-FA's (aangeduid met het voorvoegsel "i") een FCL waarde van -0,48, terwijl anteiso FA (aangeduid met het voorvoegsel "a") een FCL van -0,33. Het is dan gemakkelijk om een i14 en i13 identificeren met een ECL van 13,52 en 12,52, respectievelijk, en een a13 en a15 met ECL van 12,67 en 14,66, respectievelijk.
Tabel 1 toont de ECLS voor elke FA gedetecteerd in de steekproef. Retentietijden voorspellened voor iso en anteiso series, tezamen met MS spectra verkregen met FAME, konden we alle vertakte keten-FA identificeren onze steekproef. Deze identificatie bij deze stap was aarzelend, maar later bevestigd door EI spectra verkregen uit picolinyl FA derivaten.
FAME met ECLS niet overeenstemt met de ISO anteiso verschuivingen onverzadigde, rechte of vertakte keten FA's, zoals aangegeven door de massa van het molecuulion. Onverzadigde FA een positieve verschuiving ECL vergeleken met de overeenkomstige verzadigde FA. Spectra van DMOX derivaten, gecombineerd met spectra van picolinyl derivaat voor vertakt FA, zorgen voor de identificatie van dubbele binding positie.
Dergelijke werkwijzen derivatisering geschikt zijn voor FA identificatie wanneer elutievolgorde behouden, zoals voor de drie mengsels derivaat (bijv FAME, DMOX en picolinyl) in figuur2 enkele 16: 1 FA. Deze aanpak maakt het verzamelen van aanvullende spectrale informatie van één piek middels 3 derivatisering methoden die kunnen worden gecombineerd om FA structuur identificeren. Geen verschillen in elutievolgorde waargenomen tussen de 3 derivaten, hoewel retentietijden en oventemperaturen anders waren.
Picolinyl esters van iso- en anteiso methyl vertakte verzadigde vetzuur
De spectra verkregen EI bevestigen de aanwezigheid van methyl vertakte FA. Inderdaad, de moleculaire ionen de m / z gevonden volgens verzadigde FA's. Wij namen een ion serie met een tussenruimte van 14 massa-eenheden (amu) overeenkomt met een verlies van een methyleengroep behalve in het gebied van het vertakkingspunt waarbij het ion overeenkomt met het gesubstitueerde koolstofatoom ontbreekt. We zien dan een gat van 28 amu tussen de twee ionen die overeenkomen met fragmenten vóór gemaakt enna de vertakte koolstofketen. Figuur 3 toont het spectrum van i16 met de diagnostische ionen (304 en 332) met de vertakking locatie.
DMOX uit onvertakte onverzadigde vetzuren
Figuur 2 toont vijf die horen bij de 16: 1-vetzuur. De eerste twee pieken ECL waarden <16. We concluderen dat hun structuur zeker is vertakt. De identificatie van deze verbindingen vereist de interpretatie van de massa spectra geproduceerd door DMOX en picolinyl esterderivaten. Drie pieken bezit ECL> 16 match enkelvoudig onverzadigde rechte keten vetzuren. DMOX derivaat massaspectra tonen diagnostische ionen identificeren van de positie van de dubbele binding van deze verbindingen. 1 Δ: in figuur 4 kunnen we een gat van 12 amu ion tussen 196 en 208 die de aanwezigheid van een dubbele binding koolstof 8 van de n16 bekijken
DMOX en picolinyl massa spectra van methyl vertakte monounsatured vetzuren
Figuur 6 toont spectra van DMOX en picolinyl esterderivaten, gebruikt om de structuur van i16 bepalen: 1 Δ 9 FA. De positie van devertakking wordt aangegeven door een spleet van 28 amu beide derivaten. Een ruimte van 12 amu en 26 voor DMOX voor picolinyl ester geeft een dubbele binding positie, zie figuur 6.
Identificatie van de vetzuren en diagnostische ionen
Tabel 1 toont de verschillende vetzuren bepaald en de overeenkomstige diagnostische ionen, in Bacillus cereus ATCC 14579 gekweekt bij 30 ° C. Deze diagnostische ionen identificeren van de positie van de vertakking methyl- en dubbele bindingen op de koolstofketen van de DMOX en picolinyl esterderivaten, die aanvullende structurele informatie. Beide benaderingen zijn echt complementair, als diagnostische ionen soms gemakkelijker te betrachten DMOX derivaten en soms gemakkelijker te betrachten picolinyl derivaten.
src = "/ files / ftp_upload / 54960 / 54960fig1.jpg" />
Figuur 1: Strategie voor de identificatie van vetzuren in Bacillus cereus.
De opeenvolgende stappen het genereren van informatie over retentietijden (ECL), op de massa spectra van FAME, van DMOX, en picolinyl-ester worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vergelijking van chromatografische profielen voor verschillende 16: 1 vetzuren waargenomen in Bacillus cereus.
(A) FAME derivaten (molecuulion geëxtraheerd bij m / z 268); (B) DMOX derivaten (molecuulion geëxtraheerd bij m / z 307); (C) picolinyl derivaten (molecuulion geëxtraheerd bij m / z 345).iles / ftp_upload / 54960 / 54960fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: i16 picolinyl afgeleide massaspectrum gegenereerd door elektronen ionisatie.
Ionen bij m / z 151 en m / z 164 de aanwezigheid picolinyl een derivaat vetzuur. Het moleculair ion bij m / z 347 wordt geïdentificeerd als een isomeer van palmitinezuur. De aanwezigheid van een opening van 28 amu tussen het ion bij m / z 304 en m / z 332 is indicatief voor I16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: N16: 1 Δ 8 DMOX afgeleide massaspectrum gegenereerd door elektronenionisatie.
Het ion bij m / z 126 duidt een DMOX derivaat, m / z 307 is het moleculaire ion van 16: 1 DMOX en de aanwezigheid van een gat van 12 amu tussen de ionen bij m / z 196 en m / z 208 identificeert de locatie van de dubbele binding op koolstof 8. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: N16: 1 Δ 5 DMOX afgeleide massaspectrum gegenereerd door elektronen ionisatie.
Ion bij m / z 126 wijst op een DMOX derivaat en m / z 307 moleculair ion van 16: 1 DMOX. De intense m / z 153 ion is kenmerkend voor een dubbele binding zich op koolstof 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: DMOX (boven) en picolinyl (onder) vergelijkt i16: 1Δ 9 spectra.
In beide gevallen is de spleet van 28 amu geven de positie van de methyl- vertakking. De dubbele binding locatie kan worden verkregen door een gat van 12 amu en 26 amu voor DMOX en picolinyl derivaten, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| vermeende verbindingen | Molecuulion (m / z) FAME; DMOX; picolinyl | RT | ECL | bevestigd identificatie | Diagnostische ionen DMOX | Diagnostische ionen picolinyl |
| I12 | 214; 253; 291 | 7.93 | geen verwijzing | I12 | [276 (15), 262 (0); 248 (15)] mb | |
| n12 | 214; 253; 291 | 8.21 | 12.00 | n12 | [276 (10), 262 (20); 248 (20)] mb | |
| i13 | 228; 267; 305 | 8.53 | 12.5 | i13 | [290 (15), 276 (0); 262 (48)] mb | |
| a13 | 228; 267; 305 | 8.64 | 12.67 | a13 | [276 (48), 262 (0); 248 (65)] mb | |
| i14 | 242; 281; 319 | 9.24 | 13.52 | i14 | [304 (20); 276 (45) 290 (0)] mb | |
| n14 | 242; 281; 319 | 9.60 | 14.00 | n14 | [304 (7), 290 (17); 276 (17)] mb | |
| i15 | 256; 295; 333 | 10.06 | 14.51 | i15 | [318 (20), 314 (0); 290 (50)] mb | |
| a15 | 256; 295; 333 | 10.19 | 14.66 | a15 | [304 (30), 290 (tr); 276 (62)] mb | |
| N15 | 256; 295; 333 | 10.49 | 15.00 | N15 | [318 (5), 304 (13); 290 (18)] mb | |
| I16 | 270; 309; 347 | 11.04 | 15.5 | I16 | [332 (18), 318 (tr); 304 (42)] mb | |
| methylvertakte 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.19 | 15.64 | i16: 1Δ 5 | [152 (2), 153 (10)] db [292 (3), 278 (tr); 264 (2)] mb | |
| methylvertakte 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.40 | 15.83 | i16: 1 Δ 9 | [210 (3), 222 (3)] db [292 (12), 278 (tr); 264 (40)] mb | |
| n16 | 270; 309; 347 | 11.59 | 16.00 | n16 | [332 (5), 318 (15); 304 (15)] mb | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.78 | 16.14 | n16: 1 Δ 5 | [152 (2), 153 (10)] db | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.94 | 16.24 | n16: 1 8 Δ | [196 (5), 208 (3)] db | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 12.00 | 16.31 | n16: 1Δ 9 | [210 (3), 222 (3)] Db | |
| 16: 2 | 266; 305; 343 | 12.18 | 16.44 | n16: 2 Δ 5, 9 Δ | [152 (2), 153 (12)] db [208 (1), 220 (2)] db | |
| i17 | 284; 323; 361 | 12.25 | 16.5 | i17 | [346 (20), 332 (tr); 318 (35)] mb | |
| methylvertakte 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.43 | 16.64 | i17: 1Δ 5 | [152 (2), 153 (10)] db | [344 (10), 316 (5)] mb |
| a17 | 284; 323; 361 | 12.47 | 16.66 | a17 | [332 (30), 318 (0); 304 (52)] mb | |
| methylvertakte 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.57 | 16.74 | i17: 1Δ 8 | [196 (2), 208 (2)] db | [344 (10), 316 (5)] mb |
| methylvertakte 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.64 | 16.79 | i17: 1Δ 9 | [210 (3), 222 (3)] db | |
| methylvertakte 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.70 | 16.84 | i17: 1Δ 10 | [224 (1), 236 (1)] db | |
| methylvertakte 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.84 | 16.94 | A17: 1Δ 9 | [210 (3); 222 (4)] db | [330 (10), 316 (0); (90)] mb |
Tabel 1: Identificatie van vetzuren uit Bacillus cereus ATCC 14.579.
Retentietijden equivalente ketenlengte (ECL) waarden en moleculaire ionen vetzuurmethylesters (FAME) getoond, samen met moleculaire ionen en diagnostische ionen DMOX en picolinyl derivaten.
[] Mb diagnostische ionenpaar wijst op een verlies van 28 amu overeenkomend met fragment voor en na koolstof vertakking.
[] Db diagnostische ionenpaar wijst op een verlies van 12 amu correspondeert met de splitsing van een dubbele binding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De FA chromatogramprofielen getoond in Tabel 1 komen overeen met B. cereus ATCC 14579 gekweekt op een agarplaat oppervlak. Soortgelijke profielen werden verkregen wanneer de bacterie in beluchte vloeibare medium werd gekweekt bij dezelfde temperatuur 8. Voor bacteriën gekweekt in vloeibare media, is de bacteriële biomassa door centrifugeren van het kweekmedium en kan worden gewassen volgens de eerder beschreven protocollen afhankelijk van de groeiomstandigheden 8,19. De identificatie van de verschillende FA's door B. cereus toegestaan fijne veranderingen in de verhouding van de FA's te detecteren in stammen gemuteerde op sommige genen noodzakelijk voor de groei bij lage temperatuur 7,9.
Gewoonlijk wordt ECL berekend met log-waarden van het aangepast retentietijd bepaald bij een vaste temperatuur (met een isotherme oven met temperatuurregeling) 20. Hier, door het gebruik van een niet-isotherme oven pErmit een optimale scheiding van de FAME van belang, de berekeningsmethode gebruikt werd dat eerder beschreven voor lineaire retentie indices 3,21.
Het doel van dit werk was de berekende ECL waarden die in de literatuur niet te vergelijken, maar de FA structuur voorspellen binnen hetzelfde chromatogram profiel, op basis van deze spectra retentiegegevens en informatie. Inderdaad, voor verzadigde FA's, gegeven een vertakking (iso- of anteiso) veroorzaakt altijd dezelfde verschuiving in ECL, in vergelijking met de equivalente rechte keten FA. Bovendien, de ECL berekend in dit onderzoek gekoppeld aan meetwaarden van Stransky 22 op een kolom van gelijkwaardige polariteit. Deze samenloop met de eerder gerapporteerde waarden geeft aan dat ECL waarden zijn dus zeer nuttig voor een snelle identificatie van de pieken van de FA chromatogram profielen van B. cereus geteeld in andere omstandigheden, of andere stammen (bijv., Mutanten) van B. cereus.
Picolinyl afgeleide producten kenmerkender ionen indicatief voor de vertakking locatie dan ionen gegenereerd door DMOX derivaten, terwijl de positie van de dubbele binding gemakkelijker wordt toegewezen aan de DMOX derivaten. Deze studie toont het nut van het combineren van informatie van beide derivaten met de methyl- vertakte onverzadigde FA van B. cereus, die tot nu toe zijn slecht in de literatuur beschreven identificeren.
jove_content "> kan de voorgestelde aanpak binnen 2 dagen. Ter vergelijking, voor NMR-spectroscopie, moet elke FA worden gezuiverd, die enkele weken werk en een grote hoeveelheid biologisch materiaal. Echter, de benadering niet de geometrie differentiëren ( cis, trans) dubbele bindingen. Eenmaal per FA is geïdentificeerd, kunnen ze routinematig worden gekwantificeerd door de FAME derivaten, bijvoorbeeld bacteriële stammen en mutanten te vergelijken of om het effect van groeiomstandigheden bestuderen. In onze handen, slechts 8 mg verse bacteriële cellen voldoende waren voor de kwantificering van FA, waarbij de werkwijze toepassing op moeilijk te kweken bacteriën maakt. de bepalingsgrens voor elk van de geïdentificeerde FA is 1 ng / pl oplossing geïnjecteerd in de GC / MS.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Auteurs zijn dankbaar voor Thomas Mison voor zijn technische ondersteuning, en Rachel Kopec voor de herziening van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
References
- Christie, W. W., Han, X. Lipid Analysis 4th Edition. , Oily press. (2010).
- HÜbschmann, H. -J. Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition. , Wiley-vch. (2015).
- Sasser, M. Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids. MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).
- Spitzer, V. Structure analysis of fatty acids by gas chromatography - Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives - A review. Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).
- Harvey, D. J. Advances in lipid methodology. Volume 1. Christie, W. W. , Oily press. Dundee. 19-80 (1992).
- Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebretière, M. -H., Broussolle, V., Brillard, J. Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation. Front Microbiol. 6, (2015).
- Brillard, J., et al. Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).
- de Sarrau, B., et al. Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties. Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).
- Diomandé, S. E., et al. Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth. Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).
- Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P. Applications and Systematics of Bacillus and Relatives. Berkeley, R. C. W. , Blackwell Science Publ. 1-7 (2002).
- Kämpfer, P. Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species. System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).
- Kaneda, T. Fatty-acids of genus bacillus - example of branched-chain preference. Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).
- Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).
- Sasser, M., et al. Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters. J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).
- Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities. Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).
- Destaillats, F., Angers, P. One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids. J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).
- Fay, L., Richli, U. Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization. J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).
- Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids. Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).
- de Sarrau, B., et al. Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions. Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).
- Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters. Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).
- van Den Dool, H., Kratz, P. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).
- Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids. J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).
