Abstract
Le specie Bacillus contengono ramificata catena e acidi grassi insaturi (FAS) con diverse posizioni del ramo di metile (ISO o anteiso) e del doppio legame. Cambiamenti nella composizione FA giocano un ruolo cruciale nell'adattamento dei batteri al loro ambiente. Queste modifiche comportano una variazione del rapporto di iso rispetto anteiso ramificato AF, e nella proporzione di insaturo FAs rispetto al satura AF, con doppi legami creati in posizioni specifiche. Identificazione precisa del profilo di FA è necessario comprendere i meccanismi di adattamento di specie Bacillus.
Molte delle federazioni da Bacillus non sono disponibili in commercio. La strategia proposta nel presente documento identifica FAs combinando le informazioni sul tempo di ritenzione (calcolo della lunghezza della catena equivalente (ECL)), con gli spettri di massa di tre tipi di derivati FA: gli esteri metilici degli acidi grassi (FAME), 4,4-dimetil ossazolinici derivati (DMOX), e3-pyridylcarbinyl estere (picolinyl). Questo metodo può identificare FAS senza la necessità di purificare l'ignoto AF.
Confrontando i profili cromatografici di FAME preparato da Bacillus cereus con una miscela commerciale di standard consente l'identificazione di catena lineare saturo AF, il calcolo della ECL, e ipotesi sull'identità dell'altro AF. FAMEs di ramificata saturi Federcalcio, iso o anteiso, visualizzare un cambiamento negativo costante nella ECL, rispetto alla FAS lineari saturi con lo stesso numero di atomi di carbonio. FAMEs di insaturo AF possono essere rilevati dalla massa dei loro ioni molecolari, e determinano uno spostamento positivo nella ECL rispetto ai corrispondenti federazioni saturi.
La posizione ramificazione del FAS e la posizione del doppio legame insaturi FAs possono essere identificati dagli spettri di massa a ionizzazione di elettroni picolinyl e DMOX derivati, rispettivamente. Questo approccio identifica tutto il ramo saturo sconosciutaEd FAs, insaturi a catena lineare FAs e AF ramificati insaturi dall'estratto cereus B..
Introduction
Acidi grassi gascromatografia estere metilico (FAME) (GC) è un metodo essenziale per la caratterizzazione dei lipidi. Si separa rapidamente e quantifica i vari acidi grassi (FAS) di un campione dopo una breve fase di estrazione. Derivati di esteri metilici sono altamente volatili, stabile ed inerte verso la colonna cromatografica, evitando così i picchi di decantazione. La loro identificazione è piuttosto semplice quando il campione è costituito da FAs ben noti in quanto i profili cromatografici o sono pubblicati o rispetto agli standard. Inoltre, l'iniezione ripetuta di standard di calibrazione per la quantificazione di vari FAs non è necessario, data la loro pressoché costante risposta al rilevamento a ionizzazione di fiamma (FID) 1.
Oltre a FID, spettrometria di massa (MS) di rilevamento fornisce una serie complementare di informazioni per confermare FAMEs. Tuttavia, quando FAMEs pagano usando ionizzazione elettronica (EI), gli spettri risultanti non sempre consentono °e l'identificazione di FA struttura fine. Per esempio, la posizione ramificazione (cioè, un gruppo metile ramificato) è difficile da prevedere perché gli ioni diagnostici sono difficili da rilevare 1 e il cambiamento caratteristico in abbondanza ione bersaglio dipende dalla macchina, evitando l'uso di librerie di spettri di massa 2. Un'altra sfida consiste nell'individuare la posizione di doppio legame, perché EI provoca la migrazione doppio legame. Così, isomeri FA con diverse posizioni doppio legame non possono essere differenziati per la loro spettri di massa. Fortunatamente, altri strumenti sono stati sviluppati per l'identificazione FA. Per esempio, la presenza e la posizione di ramificazione o di doppi legami in FAs ipotizzabile calcolando la lunghezza della catena equivalente (ECL) 3.
Altri metodi di derivatizzazione comportano diversi spettri di massa, dipende dalla posizione di un doppio legame o un gruppo metile ramificato. 4,4-dimetil derivati ossazolinici (DMOX) 4 permettono di easIdentificazione y della posizione di doppi legami di acidi grassi monoinsaturi. 3-pyridylcarbinyl estere (picolinyl estere) i derivati permettono l'identificazione univoca della posizione di metile ramificata FAs 5. Combinando ritenzione cromatografica (ECL) e spettrometria di massa (DMOX e picolinyl) informazioni consente l'identificazione della maggior parte delle federazioni senza la necessità di utilizzare complessi metodi di purificazione, come richiesto per la risonanza magnetica nucleare (NMR), il metodo incontestabile per la caratterizzazione strutturale 1 .
I batteri del genere Bacillus, che include alcuni agenti patogeni umani ed animali, sono in grado di colonizzare estremamente diverse nicchie e sono quindi ampiamente distribuiti nell'ambiente 6. Tra genere Bacillus, composizione FA è influenzata dalla nicchia ecologica della specie con modulazioni nei modelli FA di adattarsi ad un'ampia gamma di cambiamenti ambientali (ad esempio, il terreno di coltura, la temperatura,pH, ecc) 7-9. A causa della relativa omogeneità del modello FA attraverso specie del genere Bacillus durante la crescita in condizioni standardizzate, determinazione della composizione FA è uno dei criteri essenziali usati per definire le specie Bacillus. Un attributo unico del genere Bacillus è l'abbondanza del FAS a catena ramificata contenenti 12-17 atomi di carbonio 10-12 con il rapporto tra ISO e anteiso isomeri di essere un fattore determinante di adattamento alle condizioni ambientali. Specie Bacillus adattano anche alle fluttuazioni ambientali alterando la percentuale di acidi grassi insaturi. In alcune specie, come il Bacillus cereus, due desaturasi di acidi grassi creano doppi legami in diverse posizioni della catena alchilica 13 con diversi ruoli in adattamento 9. L'esempio del genere Bacillus illustra l'importanza di individuare con precisione la posizione doppio legame e FA ramificazione. Collezionarevamente, l'identificazione di modelli di Bacillus FA ha diverse applicazioni utili. Qui, proponiamo un nuovo approccio GC-MS per l'identificazione modello Bacillus FA che supera i limiti intrinseci di una classica analisi GC-MS.
Questo approccio innovativo può essere utilizzato direttamente sul materiale biologico grezzo, e consiste in una combinazione di tecniche esistenti: informazioni sui tempi di ritenzione (ECL) e spettri di massa dei diversi derivati AF (FAME, DMOX e picolinyl-estere).
Usiamo la seguente nomenclatura FA. i, a, e n indicano iso, anteiso metil ramificata, e acidi grassi a catena lineare, rispettivamente. FAs insaturi sono stati nominati da C: d dove C è il numero di atomi di carbonio dell'acido grasso e d è il numero di doppi legami. Δ x indica la posizione del doppio legame, in cui il doppio legame è situato il legame carbonio-carbonio xth, contando dal terminale acido carbossilico.
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Protocol
1. colture batteriche
- Preparare un prato di batteri (Bacillus cereus ceppo ATCC 14579) diffondendo 100 ml di una coltura durante la notte del ceppo incubato a 30 ° C in LB (Luria-Bertani medio), sulla superficie di una piastra di terreno LB agar. Incubare la piastra per una notte a 30 ° C.
2. ECL: lunghezza della catena Equivalente
- Calcolare ECL come segue:
con:
i, il soluto di interesse;
n, il numero di carbonio del rettilineo catena di acido grasso saturo estere metilico eluendo prima soluto I;
n + 1, il numero di carbonio del rettilineo estere metilico catena satura di acido grasso eluendo dopo soluto I;
Rti, Rtn, Rt (n + 1) i tempi di ritenzione dei picchi FAME sopra descritti.
NOTA: ottenere i tempi di ritenzione di esteri acidi grassi saturi a catena metilici rettilinei mediante iniezione di una miscela di standard (BAME).
con: 3. FAME preparazione e l'analisi
- Per ottenere acidi grassi lipidi, cellule batteriche raccolta raschiando colonie dalla piastra di agar e trasferire 40 mg (peso fresco, equivalente a 10 9 cellule vitali) di batteri in una provetta di vetro da 10 ml con tappo a vite e guarnizioni PTFE.
- Eseguire transesterificazione tramite il metodo di collegamento estere 14,15 descritto di seguito.
- Aggiungere 5 ml di 0,2 M KOH in metanolo alle cellule batteriche fresche e incubare a 37 ° C per 1 ora. Questa reazione è costituito metanolisi alcalina, interrompendo il collegamento di estere nel lipidico e produrre esteri metilici degli acidi grassi.
- Aggiungere 1 ml di 1 M di acido acetico per abbassare il pH a 7,0. Controllare il pH con le strisce reattive pH.
- Aggiungere 3 ml di esano per estrarre FAMEs.
- Trasferire il surnatante (fase organica) in provette pulite e concentrato mediante evaporazione a temperatura ambiente sotto un flusso continuo di azoto per ottenere circa 200 microlitridi estratto. Trasferire il campione in una fiala GC con inserto.
- Iniettare estratti in una spettrometria di massa cromatografia gas sistema (GC-MS).
4. GC / MS Condizioni
- Iniettare campioni FAME in uno strumento GC-MS equipaggiato con una colonna capillare ZB-WAX (lunghezza 30 m, diametro, 0,25 mm, spessore del film, 0,25 micron).
- Impostare la porta di iniezione (in modalità splitless) temperatura a 250 ° C. Utilizzare l'elio come gas di trasporto, con una velocità lineare di 37 cm / sec. Mantenere la temperatura del forno a 50 ° C per 1 min, aumentare a 190 ° C ad una velocità di 20 ° C / min, e aumentare ulteriormente ad una temperatura finale di 230 ° C ad una velocità di 2 ° C / min.
- Ai MS, registrare gli spettri di massa per ionizzazione elettronica (EI) a 70 eV, e impostare l'acquisizione della corrente ionica totale tra 50 e 400 unità atomiche di massa (amu) (2 scans / sec).
- Quando necessario, iniettare DMOX e picolinyl derivati sotto la stessa condizione eccet forno programma di temperatura come segue:
DMOX: 50 ° C (1 minuto), 20 ° C / min fino 210 ° C e 2 ° C / min fino a 240 ° C (5 min);
Picolinyl: 6 ° C (1 minuto), 20 ° C / min fino a 220 ° C e 2 ° C / min fino a 250 ° C (20 min).
5. Picolinyl Ester Preparazione a partire da 16 FAME
- Evaporare l'estratto FAME dalla Sezione 3 con un flusso di azoto (almeno 10 mg materiale secco) e sciogliere in 1 ml di diclorometano anidro.
- Preparare una soluzione di ter di potassio terz.butossido in tetraidrofurano 1.0 M.
- Aggiungere l'estratto FAME e 0,2 ml di 3-pyridinemethanol a 0,1 ml di soluzione fatte nella fase 5.2.
- Riscaldare la soluzione a 40 ° C per 30 min in una fiala chiusa.
- Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, aggiungere acqua deionizzata purificata (2 ml, vedi Materiali Tavolo) ed esano (4 ml). Mescolare con un vortice, permettono di fase per separare e raccogliere la fase organica.
- Dry aggiungendo solfato di sodio anidro fino alla fase organica è perfettamente chiaro. Trasferire in una provetta pulita. Poi evaporare a 200 l. Trasferire il campione in una fiala GC con inserto.
6. DMOX Preparazione a partire da 17 FAME
- Evaporare l'estratto FAME dalla Sezione 3 con un flusso di azoto (materiale secco, di almeno 10 mg).
- Per l'estratto secco FAME, aggiungere 250 mg di 2-ammino-2-metil-1-propanolo. Lavare il recipiente con azoto, aggiungere un tappo, e metterlo in un blocco di riscaldamento durante la notte a 190 ° C.
- Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, aggiungere 3 ml diclorometano nel tubo, e 5 ml di acqua deionizzata purificata (vedi Materiali Tabella).
- Agitare per separazione di fase e quindi rimuovere la fase acquosa.
- Lavare la fase organica con acqua 5 ml. Agitare per separazione di fase e quindi rimuovere la fase acquosa.
- Lavaggio aggiungendo solfato di sodio anidro fino alla fase organica è perfettamente limpida etrasferirlo in una provetta pulita. Evaporare sotto corrente di azoto fino a raggiungere un volume di 200 microlitri. Trasferire il campione in una fiala GC con inserto.
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Representative Results
La strategia di identificazione FA da cellule batteriche è presentato in Figura 1. Ogni passo fornisce informazioni spettrali complementari o informazioni su di ritenzione cromatografica. Fase 1 consiste preliminare identificazione FA utilizzando una soluzione standard. Step 2 permette l'interpretazione di FAME EI spettri e la loro ECL, al fine di tentare di identificare i prodotti. Fase 3 identifica la posizione esatta ramificazione nella catena ramificata-FAS. Infine, il punto 4 identifica la posizione precisa dei doppi legami insaturi FAS.
FAME e ECL
La miscela BAME ci ha permesso di individuare una serie di acidi grassi saturi a catena lineare (N12 a N17) e un po 'di metile degli acidi grassi ramificati (i15, a15, I16, I17). Tuttavia, molto pochi specifica FAs di B. cereus sono stati rilevati nel nostro campione, che giustifica la svipment del metodo di identificazione descritto di seguito.
FAs Indipendentemente lunghezza di catena ramificata saturi (iso o anteiso) di una serie omologa (cioè una serie di composti con la stessa formula generale) mostrano uno spostamento costante ECL rispetto alla retta saturo FA avente lo stesso numero di carbonio nella loro carbonio-catena. Questo spostamento, chiamato lunghezza della catena frazionata (FCL), permette l'identificazione di AF in una serie omologa. Per esempio, iso-FAS (indicato con il prefisso "i") hanno un valore di -0.48 FCL, mentre anteiso FAS (denotato con il prefisso "a") hanno un FCL di -0.33. È quindi facile identificare un i14 e i13 con ECL rispettivamente 13,52 e 12,52, e un a13 e a15 con ECL rispettivamente 12,67 e 14,66,.
La tabella 1 mostra i ECL per ciascuna delle federazioni rilevati nel nostro campione. I tempi di ritenzione prediconoEd per iso e anteiso serie, insieme a MS spettri ottenuti con FAMEs, ci ha permesso di identificare tutti i catena ramificata-FA dal nostro campione. Tale identificazione in questa fase era esitante, ma poi confermato da EI spettri ottenuti da picolinyl derivati FAS.
FAMEs con ECL non corrispondenti al iso o anteiso turni sono insaturi, a catena lineare o ramificata AF, come indicato dalla massa di loro ione molecolare. FAs insaturi mostrano uno spostamento positivo in ECL rispetto al corrispondente FA saturo. Spectra da derivati DMOX, in combinazione con gli spettri da picolinyl derivato per ramificata FAs, permettere di identificare la posizione doppio legame.
Tali metodi di derivatizzazione sono appropriati per l'identificazione FA solo quando l'ordine di eluizione viene mantenuto, come indicato per le tre miscele derivati (ad esempio, FAME, DMOX e picolinyl) in Figura2 per parecchi 16: 1 AF. Questo approccio permette la raccolta di informazioni spettrali complementare di un picco con 3 metodi di derivatizzazione che possono essere combinati per identificare la struttura FA. Non sono state osservate differenze in ordine di eluizione tra le 3 derivati, anche se i tempi di ritenzione e temperature del forno erano diverse.
esteri Picolinyl di iso e anteiso metilico di acidi grassi saturi a catena ramificata
Gli spettri ottenuti da EI confermare la presenza del metilici FAs catena ramificata. Infatti, gli ioni molecolari hanno la m / z corrispondente AF saturi. Abbiamo osservato una serie di ioni con una distanza di 14 unità di massa (amu) corrispondenti ad una perdita di un gruppo metilenico tranne nella regione di diramazione in cui lo ione corrispondente all'atomo di carbonio sostituito è mancante. Abbiamo poi osserva un gap di 28 amu tra i due ioni corrispondenti a frammenti creati prima edopo il carbonio ramificata. La figura 3 mostra lo spettro di i16 con ioni diagnostici (304 e 332) che mostra la posizione ramificazione.
DMOX di acidi grassi insaturi a catena lineare
Figura 2 presenta cinque diversi picchi associati al 16: 1 di acido grasso. I primi due picchi hanno valori ECL <16. Concludiamo che la loro struttura è certamente ramificata. L'identificazione di questi composti richiede l'interpretazione di spettri di massa prodotte da DMOX e derivati esterei picolinyl. Tre cime che possiedono ECL> 16 partita monoinsaturi acidi grassi a catena lineare. DMOX derivati spettri di massa mostrano ioni diagnostici identificano la posizione del doppio legame di questi composti. In figura 4 si può vedere un gap di 12 ione amu tra 196 e 208 che indica la presenza del doppio legame carbonio con 8 del N16: 1 Δ 18. Quando la posizione doppio legame è prima di carbonio 7, gli ioni diagnostici differiscono. Ad esempio, Zhang 18 e Fay 17 osservato che per un FA con insaturo doppio legame carbonio 5, lo ione figlia derivato dalla scissione al doppio legame, m / z 152, è accompagnato da un intenso figlia dispari a m / z 153. In Figura 5, la presenza di intense m / z 153 frammenti e dello ione molecolare m / z 307, identifica questo composto come n16: 1 Δ 5.
DMOX e la massa picolinyl spettri di metile a catena ramificata monoinsaturi acidi grassi
Figura 6 presenta spettri di DMOX e derivati picolinyl estere, utilizzati per determinare la struttura di I16: 1 Δ 9 FA. La posizione delramificazione è indicato da un gap di 28 amu per entrambi derivati. Un gap di 12 amu per DMOX e 26 per picolinyl estere identifica la posizione del doppio legame, come mostrato in Figura 6.
Identificazione degli acidi grassi e ioni diagnostici
Tabella 1 mostra i vari acidi grassi identificati, con i corrispondenti ioni diagnostici, in Bacillus cereus ATCC 14579 coltivate a 30 ° C. Questi ioni diagnostici identificano le posizioni della ramificazione di metile e doppi legami nella catena di carbonio per le DMOX e picolinyl derivati esterei, che forniscono informazioni strutturali complementari. I due approcci sono veramente complementari, come ioni diagnostici sono a volte più facili da osservare con derivati DMOX, e altre volte più facile da osservare con i derivati picolinyl.
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Figura 1: strategia per l'identificazione degli acidi grassi in Bacillus cereus.
Vengono visualizzati i passi successivi che generano informazioni sui tempi di ritenzione (ECL), su spettri di massa di FAME, di DMOX, e di picolinyl-estere. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: confronto dei profili cromatografici per le diverse 16: acidi grassi 1 rilevati in Bacillus cereus.
(A) Derivati FAME (ione molecolare estratto a m / z 268); (B) Derivati DMOX (ione molecolare estratto a m / z 307); (C) derivati picolinyl (ione molecolare estratto a m / z 345).iles / ftp_upload / 54960 / 54960fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: i16 picolinyl spettro di massa derivato generate per ionizzazione di elettroni.
Ioni a m / z 151 e m / z 164 indicano la presenza di un derivato picolinyl di acido grasso. Lo ione molecolare a m / z 347 è identificato come un isomero di acido palmitico. La presenza di un gap di 28 amu tra lo ione m / z 304 e m / z 332 è indicativo di I16. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: N16: 1 Δ 8 DMOX spettro di massa derivato generato da elettroniionizzazione.
Lo ione m / z 126 indica un derivato DMOX, m / z 307 è lo ione molecolare di 16: 1 DMOX e la presenza di un gap di 12 amu tra gli ioni a m / z 196 e m / z 208 identifica la posizione di doppio legame carbonio su 8. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: N16: 1 Δ 5 DMOX spettro di massa derivato generate per ionizzazione di elettroni.
Ion a m / z 126 è indicativo di un derivato DMOX e m / z 307 è lo ione molecolare di 16: 1 DMOX. Il m intenso / z 153 ionica è caratteristica di un doppio legame si trova sul carbonio 5. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: DMOX (in alto) e picolinyl (in basso) confronto tra I16: 1Δ 9 spettri.
In entrambi i casi il gap di 28 amu indica la posizione della ramificazione metile. La posizione doppio legame può essere derivato da un gap di 12 amu e 26 amu per DMOX e picolinyl derivati, rispettivamente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| composti putativi | ione molecolare (m / z) FAME; DMOX; picolinyl | RT | ECL | identificazione confermato | ioni diagnostici DMOX | ioni diagnostici picolinyl |
| I12 | 214; 253; 291 | 7.93 | nessun riferimento | I12 | [276 (15); 262 (0); 248 (15)] mb | |
| n12 | 214; 253; 291 | 8.21 | 12.00 | n12 | [276 (10); 262 (20); 248 (20)] mb | |
| I13 | 228; 267; 305 | 8.53 | 12.5 | I13 | [290 (15); 276 (0); 262 (48)] mb | |
| A13 | 228; 267; 305 | 8.64 | 12.67 | A13 | [276 (48); 262 (0); 248 (65)] mb | |
| I14 | 242; 281; 319 | 9.24 | 13.52 | I14 | [304 (20); 276 (45) 290 (0)] mb | |
| n14 | 242; 281; 319 | 9.60 | 14.00 | n14 | [304 (7), 290 (17); 276 (17)] mb | |
| I15 | 256; 295; 333 | 10.06 | 14.51 | I15 | [318 (20); 314 (0); 290 (50)] mb | |
| a15 | 256; 295; 333 | 10.19 | 14.66 | a15 | [304 (30); 290 (tr); 276 (62)] mb | |
| n15 | 256; 295; 333 | 10.49 | 15.00 | n15 | [318 (5); 304 (13); 290 (18)] mb | |
| I16 | 270; 309; 347 | 11.04 | 15.5 | I16 | [332 (18); 318 (tr); 304 (42)] mb | |
| metil ramificato 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.19 | 15.64 | I16: 1Δ 5 | [152 (2), 153 (10)] db [292 (3); 278 (tr); 264 (2)] mb | |
| metil ramificato 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.40 | 15.83 | I16: 1 Δ 9 | [210 (3); 222 (3)] db [292 (12); 278 (tr); 264 (40)] mb | |
| n16 | 270; 309; 347 | 11.59 | 16.00 | n16 | [332 (5); 318 (15); 304 (15)] mb | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.78 | 16.14 | N16: 1 Δ 5 | [152 (2), 153 (10)] db | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.94 | 16.24 | N16: 1 Δ 8 | [196 (5); 208 (3)] db | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 12.00 | 16.31 | N16: 1Δ 9 | [210 (3); 222 (3)] Db | |
| 16: 2 | 266; 305; 343 | 12.18 | 16.44 | N16: 2 Δ 5, Δ 9 | [152 (2), 153 (12)] db [208 (1), 220 (2)] db | |
| I17 | 284; 323; 361 | 12.25 | 16,5 | I17 | [346 (20); 332 (tr); 318 (35)] mb | |
| metil ramificato 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.43 | 16.64 | I17: 1Δ 5 | [152 (2), 153 (10)] db | [344 (10); 316 (5)] mb |
| A17 | 284; 323; 361 | 12.47 | 16.66 | A17 | [332 (30); 318 (0); 304 (52)] mb | |
| metil ramificato 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.57 | 16.74 | I17: 1Δ 8 | [196 (2), 208 (2)] db | [344 (10); 316 (5)] mb |
| metil ramificato 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.64 | 16.79 | I17: 1Δ 9 | [210 (3); 222 (3)] db | |
| metil ramificato 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.70 | 16.84 | I17: 1Δ 10 | [224 (1), 236 (1)] db | |
| metil ramificato 17: 1 | 282; 321; 359 | 12.84 | 16.94 | A17: 1Δ 9 | [210 (3); 222 (4)] db | [330 (10); 316 (0); (90)] mb |
Tabella 1: Identificazione di acidi grassi da Bacillus cereus ATCC 14579.
I tempi di ritenzione, valori equivalenti lunghezza della catena (ECL), e gli ioni molecolari per esteri metilici degli acidi grassi (FAME) sono mostrati, insieme con ioni molecolari e ioni diagnostici per DMOX e derivati picolinyl.
[] Mb pair ione diagnostico indicando una perdita di 28 amu corrispondente al frammento prima e dopo ramificazione carbonio.
[] Db pair ione diagnostico indicando una perdita di 12 amu corrispondente alla scissione di un doppio legame.
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Discussion
I profili cromatogramma AF indicati nella tabella 1 corrispondono a B. cereus ATCC 14579 cresciuta su una superficie della piastra di agar. Profili simili sono stati ottenuti quando il batterio è stato coltivato in terreni liquidi aerato alla stessa temperatura 8. Nel caso dei batteri coltivati in terreno liquido, la biomassa batterica viene raccolto per centrifugazione del mezzo di crescita e può essere lavato secondo protocolli precedentemente descritti a seconda delle condizioni di crescita 8,19. L'identificazione delle varie federazioni prodotti da B. cereus permesso cambiamenti sottili nella proporzione del FAs essere rilevati in ceppi mutati su alcuni geni necessari per la crescita a bassa temperatura 7,9.
Solitamente, ECL calcolata utilizzando valori di registro del tempo di ritenzione adjusted determinata a una temperatura fissa (utilizzando un forno con controllo di temperatura isotermica) 20. Qui, a causa dell'uso di un forno non isotermica per permit una separazione ottimale della fama di interesse, il metodo di calcolo utilizzato è stato quello precedentemente descritto per gli indici di ritenzione lineari 3,21.
Lo scopo del presente lavoro era non confronta i valori calcolati ECL con quelli descritti nella letteratura, ma per predire la struttura FA, all'interno dello stesso profilo cromatogramma, sulla base di questi dati di ritenzione e informazioni spettri. Infatti, per AF saturi, un dato ramificazione (iso o anteiso) provoca sempre lo stesso cambiamento di ECL, rispetto all'equivalente catena lineare FA. Inoltre, la ECL calcolato nel presente studio abbinato con i valori misurati dai Stransky 22 su una colonna di polarità equivalente. Questa concomitanza con i valori precedentemente riportati indicano che i valori ECL sono quindi molto utile per una rapida identificazione dei picchi da AF profili cromatogramma B. cereus coltivate in altre condizioni, o di altri ceppi (ad es., Mutanti) di B. cereus.
derivati Picolinyl forniscono più ioni caratteristici indicativi della posizione ramificazione di ioni generati da derivati DMOX, mentre la posizione del doppio legame è più facilmente assegnato con i derivati DMOX. Il presente studio dimostra l'utilità di combinare informazioni da entrambi derivati per identificare il metil ramificata catena insatura FAs da B. cereus, che fino ad ora sono stati mal descritti in letteratura.
jove_content "> L'approccio proposto può essere completata entro 2 giorni. A titolo di confronto, per spettroscopia NMR, ogni FA deve essere purificato, che rappresentano diverse settimane di lavoro e una grande quantità di materiale biologico. Tuttavia, l'approccio non distingue la geometria ( cis, trans) di doppi legami. Una volta che ogni FA è identificato, possono essere di routine quantificati dai loro derivati fama, ad esempio, per confrontare ceppi batterici e mutanti o per studiare l'impatto delle condizioni di crescita. Nelle nostre mani, non più di 8 mg di cellule batteriche freschi erano sufficienti per la quantificazione di AF, che rende il metodo applicabile a difficile far crescere batteri. il limite di quantificazione per ciascuna delle federazioni identificata è 1 ng / ml di soluzione iniettata nel GC / MS.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Gli autori sono grati a Thomas Mison per il suo supporto tecnico, e di Rachel Kopec per la revisione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
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