Abstract
Bacillus türleri metil dalının farklı pozisyonları ile zincirli ve doymamış yağ asitleri (FAS) dallanmış (izo ya anteiso-) ve çift bağın. FA kompozisyonundaki değişikliklerin çevreye bakterilerin adaptasyon önemli bir rol oynamaktadır. Bu değişiklikler anteiso- fas dallı karşı iso oranında bir değişiklik gerektirir ve belirli pozisyonlarda oluşturulan ikili bağlar ile doyurulmuş Fas'a doymamış FAs göreli, oranında. FA profilinin kesin kimlik Bacillus türlerinin adaptasyon mekanizmalarının anlaşılması gereklidir.
Bacillus'dan Fas'ı çoğu ticari olarak temin edilebilir değildir. yağlı asit metil esterleri (FAME), 4,4-dimetil oksazolin: Bu tarifnamede önerilen strateji üç FA türevlerinin tiplerine kütle spektrumları ile (eş zincir uzunluğuna sahip (ECL) hesaplanması ile) alıkoyma süresi hakkında bilgi birleştirerek Fas tanımlar türevleri (DMOX) ve3-pyridylcarbinyl ester (pikolinil). Bu yöntem, bilinmeyen fas arındırmak için gerek kalmadan fas belirleyebilir.
Standartları ticari bir karışım olan, Bacillus cereus hazırlanabilir FAME kromatografik profillerini karşılaştırmak için diğer Fas'ın kimliğine fas, ECL hesaplama ve hipotez, doymuş, düz zincirli tanımlanmasına izin verir. ve Fames karbona aynı sayıda doğrusal doymuş finansman kurumu göre FAS, iso veya anteiso-, ECL sürekli bir negatif kayma gösterir doymuş dallı. Doymamış Fas'ı kareleri moleküler iyon kütlesi ile tespit ve karşılık gelen doymuş Fas'ına göre ECL olumlu bir artışa neden olabilir.
Fas'ı dallanma konumu ve doymamış Fas'ın çift bağ pozisyonu, sırasıyla, pikolinil ve DMOX türevlerinin elektron iyonizasyon kütle spektrumları ile tespit edilebilir. Bu yaklaşım, tüm bilinmeyen doymuş şube tanımlarEd fasının doymamış, düz zincirli Fas ve B. cereus özü doymamış dallı FASB.
Introduction
Yağlı asit metil ester (FAME), gaz kromatografisi (GC), lipid karakterizasyonu için gerekli bir yöntemdir. Bu hızlı bir şekilde ayırır ve kısa bir ekstraksiyon aşamasından sonra bir numune, çeşitli yağlı asitleri (FAS) ifade etmektedir. metil ester türevleri, kromatografik kolona doğru yüksek, uçucu istikrarlı ve inert böylece atık doruklarına kaçınarak. kromatografik profiller yayımlanmış veya standartlarla karşılaştırıldığında, çünkü örnek tanınmış finansman kurumu oluşuyorsa kendi kimlik oldukça basittir. Buna ek olarak, çeşitli Fas'ın ölçümü için bir kalibrasyon standartları tekrar enjeksiyon alev iyonizasyon saptamasıyla (FID) 1 kendi hemen hemen sabit tepki verilir, gerekli değildir.
FID ek olarak, kütle spektrometrisi (MS) tespit FAMEler teyit etmek için bir bilgi tamamlayıcı bir dizi sağlar. Kareleri elektron iyonizasyonu (El) ile şarj edilir, ancak elde edilen spektrumlar her th için izin vermeFA ince yapısının e tanımlanması. Teşhis iyonları 1 tespit edilmesi zor olan ve hedef iyon bolca karakteristik bir değişiklik kütle spektrumu kütüphaneleri 2 kullanımını engelleyen, makineye bağlı olduğu için, örneğin, konum dallanma (yani, metil dallı grup) tahmin etmek zordur. Başka bir sorun EI çift bağ göçünü neden olduğundan çift bağ pozisyonunu belirleme yatıyor. Böylece, çift bağ pozisyonlarını değişen FA izomerleri kendi kütle spektrumları ayırt edilemez. Neyse ki, başka araçlar FA tanımlanması için geliştirilmiştir. Örneğin, durum ve fasıl'da çift bağların ya da dallanma konumu eş zincir uzunluğuna sahip (ECL) 3 hesaplanarak conjectured edilebilir.
Diğer türetme yöntemleri bir çift bağ ya da kollara ayrılmış bir metil grubunun konumuna bağlı olarak, farklı kütle spektrumları ile sonuçlanır. 4,4-Dimetil oksazolin türevleri (DMOX) 4 EAS izintekli doymamış yağ asidi çift bağların pozisyon y tanımlanması. Ester (pikolinil ester) türevleridir metil yerini kesin tanımlanması için izin veren 3-pyridylcarbinyl FAs 5 dallanmış. Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektrumu, yapısal karakterizasyon 1 tartışılmaz bir yöntem için gerekli olan, saflaştırma karmaşık yöntemler kullanmaya gerek kalmadan kromatografik (ECL) ile kütle spektrumları (DMOX ve pikolinil) bilgi çoğu Fas'ın saptanmasına olanak birleştirme .
Bazı insan ve hayvan patojenleri içeren Bacillus, bakteriler, çok çeşitli bir niş kolonize edebiliyoruz ve bu nedenle yaygın olarak çevre 6 dağıtılır. Bacillus cinsi içinde, FA bileşimi (çevresel değişiklikler geniş bir uyum FA desen modülasyonlar türlerin ekolojik niş etkilenir, örneğin, büyüme ortamı, sıcaklık,pH, vs.) 7-9. Çünkü standart koşullarda büyüme sırasında Bacillus türleri arasında FA model göreli homojenlik FA bileşimin belirlenmesi Bacillus türleri tanımlamak için kullanılan temel kriterlerden biridir. Bacillus cinsinin eşsiz bir nitelik 12-17 karbon iso ve çevre koşullarına uyum önemli bir belirleyicisi olan anteiso- izomerler arasındaki oran ile 10-12 ihtiva eden dallı zincirli finansman kurumu bolluğu olduğunu. Bacillus türleri de doymamış yağ asitlerinin oranının değiştirilmesiyle çevresel değişimlerin uyum. Bacillus cereus gibi bazı türler, iki yağ asidi desatürazlar uyum 9 farklı rollere sahip alkil zincirinin 13 farklı pozisyonlarda çift bağ oluşturur. Bacillus cinsinin örnek tam çift bağ pozisyonunu belirleme ve FA dallanma önemini göstermektedir. Toplamakively, Bacillus FA desen kimlik birçok yararlı uygulamalar vardır. Bu yazıda, klasik bir GC-MS analizi doğasında kısıtlamaların üstesinden Bacillus FA desen tanımlanması için yeni bir GC-MS yaklaşımı öneriyoruz.
Bu yenilikçi yaklaşım, ham biyolojik bir malzeme üzerinde doğrudan kullanılan ve mevcut tekniklerin bir kombinasyonundan oluşur edilebilir: tutma süreleri (ECL) ve farklı FAs türevleri (FAME, DMOX ve pikolinil-ester) kütle spektrumları modülleri.
Biz şu FA isimlendirme kullanın. a ve n, iso gösterir I, anteiso- metil sırasıyla dallanmış ve düz zincirli yağlı asit. Doymamış FAs C olarak seçilmiştir: Cı karbonlu yağlı asit atomuna ve D sayısı D ikili bağların sayısı. Δ X bir çift bağ karboksilik asit uç sayarak, X. karbon-karbon bağı bulunmaktadır çift bağ pozisyonunu gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakteri kültürleri
- LB agar ortamı bir plaka yüzeyi üzerine, LB (Luria-Bertani ortamında) içinde 30 ° C'de inkübe soyun bir gecelik kültüründen 100 ul yayarak bakteriler (Bacillus cereus ATCC 14579) 'in bir çim hazırlayın. 30 ° C'de gece boyunca inkübasyona bırakılır.
2. ECL: Eşdeğer Zincir uzunluğu
- şöyle ECL hesaplayın:
ile:
Ben ilgi çözünen;
N, çözünen önce elüsyon düz zincirli, doymuş yağlı asit metil ester karbon sayısı I;
N + 1, çözünen sonra elüsyon, düz zincirli doymuş yağlı asit metil ester karbon sayısı I;
RTI, RTN R (n + 1), yukarıda tarif edilen FAME tepe tutma süreleri verir.
Not: (aykırı bir karışımının enjeksiyonla B, düz zincirli doymuş yağ asitleri metil esterlerin tutma süreleri elde edilirAME).
ile: 3. FAME Hazırlama ve Analiz
- Agar plakasından koloniler kazınarak lipit yağlı asitler, hasat bakteriyel hücreler elde etmek ve vidalı kapaklar ve PTFE keçe 10 ml'lik bir cam tüp içine bakteri (10 9 canlı hücre eşdeğer taze ağırlık), 40 mg aktarmak için.
- Aşağıda ayrıntıları verilen ester bağlantı yöntemiyle 14,15 aracılığıyla transesterifikasyon gerçekleştirin.
- Taze bakteri hücreleri için metanol içinde 0.2 M KOH 5 ml ilave edilir ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bu reaksiyon, lipid ester bağlantısı kırma ve yağlı asit metil esterlerinin üretilmesi, alkalin metanoliz oluşur.
- 7.0 pH değerini düşürmek için 1 M asetik asit 1 ml ilave edilir. pH test şeritleri ile pH'ı kontrol edin.
- FAMEler çıkarmak için heksan 3 ml ekleyin.
- yaklaşık 200 ul elde etmek üzere bir nitrojen sürekli akış altında oda sıcaklığında buharlaştırma ile temiz bir tüp içine süpernatant (organik faz) aktarın ve konsantreekstresi. ekleme ile GC şişe içine örnek aktarın.
- Bir gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS) sistemi hülasalarının enjekte edilir.
4. GC / MS koşulları
- bir kılcal kolon ZB-balmumu (çapı, 0,25 mm, film kalınlığı 0.25 um uzunluğunda, 30 m) ile donatılmış bir GC-MS cihazı içine FAME örnekleri enjekte edilir.
- (Yarıksız modunda) enjeksiyon ağzının 250 ° C'ye sıcaklığa ayarlayın. 37 cm / sn arasında bir doğrusal hız ile, taşıyıcı gaz olarak helyum kullanın. 20 ° C / dk bir oranda 190 ° C'ye arttırmak ve 2 ° C / dk bir oranda 230 ° C'lik bir son sıcaklığa kadar daha da artması, 1 dakika boyunca 50 ° C de fırın sıcaklığı tutun.
- MS için 70 eV elektron iyonizasyon (EI) kütle spektrumları kaydedebilir ve 50 ve 400 atomik kütle birimi (akb) (2 tarama / sn) arasındaki toplam iyon akımı satın ayarlayın.
- Gerektiğinde, aynı durum İstisnai altında DMOX ve pikolinil türevleri enjekteaşağıdaki gibi sıcaklık programı fırın t:
DMOX: 50 ° C (1 dakika), 20 ° C 210 ° C ye kadar / dk ve 2 ° C / dakika, 240 ° C (5 dakika) kadar;
Pikolinil: 6 ° C (1 dakika), 220 ° C'ye kadar 20 ° C / dakika ve 250 ° C (20 dakika kadar) 2 ° C / dak.
FAME 16 5. Pikolinil ester Preparasyon
- bir azot akımı (en az 10 mg kuru madde) ile Kısım 3'ten FAME özü buharlaştınn ve kuru diklorometan 1 ml içinde çözülür.
- Tetrahidrofuran içerisinde potasyum tert t-butoksit içindeki bir 1.0 M çözelti hazırlayın.
- FAME özü ve aşama 5.2'de yapılan çözeltinin 0.2 ml 3-piridinmetanol ila 0.1 ml ilave edilir.
- kapalı bir şişede 30 dakika boyunca 40 ° C'da, çözelti ısıtılır.
- Oda sıcaklığına kadar soğutulduktan sonra, (Malzeme bakınız Tablo, 2 mL) ve heksan (4 mi) arıtılmış, iyonu giderilmiş su ilave edilir. Bir girdap ile karıştırın faz ayrılması için izin ve organik faz toplamak.
- drorganik faz kadar susuz sodyum sülfat ilave edilerek y bunu çok açıktır. Temiz bir tüp içine aktarın. Daha sonra 200 ul buharlaştırılmaktadır. ekleme ile GC şişe içine örnek aktarın.
FAME 17 6. DMOX hazırlanması
- nitrojen (en az 10 mg kuru madde) içindeki bir akışı ile Bölüm 3'ten FAME özü buharlaştırın.
- FAME kuru ekstre etmek için, 2-amino-2-metil-1-propanol, 250 mg ekleyin. Nitrojen ile kap yıkayın bir stoper ekleyin ve 190 ° C de bir gece boyunca ısıtma bloğu içine koyun.
- Oda sıcaklığına kadar soğutulduktan sonra, tüp, 3 ml diklorometan ekleyin ve 5 ml deiyonize edilmiş su (Malzeme Tablosu) arıtıldı.
- Faz ayrımı için çalkalanır ve daha sonra sulu faz çıkarın.
- 5 ml su ile organik faz yıkanır. Faz ayrımı için çalkalanır ve daha sonra sulu faz çıkarın.
- organik faz kadar susuz sodyum sülfat eklenerek kuru çok açıktır veTemiz bir tüp içine aktarın. 200 ul bir hacim elde edilene kadar bir azot akımı altında buharlaştırılır. ekleme ile GC şişe içine örnek aktarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bakteriyel hücrelerden FA kimlik stratejisi Şekil 1 'de sunulmuştur. Her adım tamamlayıcı spektral bilgi veya kromatografik tutma hakkında bilgi sağlar. Aşama 1, standart çözeltisi kullanılarak, ön FA belirlenmesinden oluşur. Adım 2 geçici ürünlerini belirlemek için, FAME EI spektrumları ve ECL yorumlanması için izin verir. Adım 3 dallı zincirli-Fas kesin dallanma konumunu tanımlar. Son olarak, aşama 4, doymamış fasıl'da çift bağların kesin konumunu tanımlar.
FAME ve ECL
BAME Karışım US düz zincirli doymuş yağlı asitlerin bir dizi (N17 de N12) tanımlamak için bırakıldı ve bir metil yağ asit (I15, A15, I16, I17) birimleri içerir. Ancak, B. cereus çok az fasa özgü develo haklı, bizim örnek tespit edilditanımlama yöntemi pment aşağıda tarif edilmiştir.
Bağımsız olarak zincir uzunluğu, doymuş dallanmış Fas'ın bir homolog dizi (ISO veya anteiso-) (yani, aynı genel formüle sahip bir bileşikler serisi), düz, doymuş FA karbon aynı sayıda olan göre ECL sabit bir Shift sergilediklerini karbon zinciri. Bu kayma, adı fraksiyonel zincir uzunluğu (FCL), bir homolog dizi Fas'ın tanımlanmasına izin verir. (Ön ek "A" ile gösterilen) anteiso- FAs -0.33 bir FCL varken Örneğin, izo-Fas (önek ile gösterilir, "i"), -0.48 bir FCL değerine sahiptir. Sırasıyla 13.52 ve 12.52, bir ECL ile I14 ve I13 tanımlamak sonra kolay ve sırasıyla 12.67 ve 14.66, bir ECL ile a13 ve a15.
Tablo finansman kurumu her biri için 1 görüntüler ECLS bizim örnek tespit edildi. Tutma süreleri tahminbirlikte MS spektrumları ile FAME ile elde edilen iso ve anteiso- dizi ed, bize örnek dallı zincirli-FA tüm tanımlamak için izin verdi. Bu aşamada böyle bir tanımlama belirsiz, ama daha sonra pikolinil FAs türevlerinden elde edilen EI spektrumları ile doğrulandı.
moleküler iyon kütlesi ile gösterildiği gibi ISO uymayan ECLs ya anteiso- kaymalarla kareleri, düz veya dallı zincir fasının doymamıştır. karşılık gelen doymuş FA ile karşılaştırıldığında doymamış FAs ECL olumlu bir kayma göstermektedir. dallanmış finansman kurumu için pikolinil türevinden spektrumları ile birlikte DMOX türevleri, Spectra, çift bağ pozisyonu tanımlanmasına olanak tanımaktadır.
Böyle bir türetme yöntemleri Şekil üç türev karışımlar (yani, FAME, DMOX ve pikolinil) gösterildiği gibi sağım sırası korunmuyor yalnızca FA tanımlanması için uygun1. Bir finansman kurumu: 16 çok sayıda 2. Bu yaklaşım, FA yapısını belirlemek için birleştirilebilir 3 türetme yöntemleri kullanılarak bir tepe tamamlayıcı spektral enformasyonun toplanmasına izin verir. tutma süreleri ve fırın sıcaklıklarının farklı olmasına rağmen elüsyon için hiçbir fark 3 türevleri arasında gözlenmiştir.
ISO Pikolinil esterleri ve anteiso- metil dallı zincirli, doymuş yağlı asit
EI ile elde edilen spektrumları metil dallı zincirli finansman kurumu varlığını doğrulamaktadır. Gerçekten de, moleküler iyonlar doymuş Fas'ına karşılık gelen m / z sahiptir. Bu ikame edilmiş karbon atomuna karşılık gelen iyon eksik dal noktası bölgesi civarı dışında, bir metilen grubunun bir kaybına tekabül 14 kütle birimi (amu) bir boşluk ile bir iyon serileri gözlenebilir. Biz daha önce oluşturulan parçalara gelen iki iyonlar arasındaki 28 akb bir boşluk gözlemlemek vedallanmış karbon sonra. Şekil 3 dallanma konumunu gösteren tanı iyonları (304 ve 332) ile I16 spektrumunu göstermektedir.
düz zincirli doymamış yağlı asitlerin DMOX
1 yağ asidi: Şekil 2, 16 ile bağlantılı beş farklı bileşim. İlk iki tepe ECL değerleri 16 <sahiptir. Biz onların yapısı kesinlikle dallı olduğu sonucuna varıldı. Bu bileşiklerin tanımlanması DMOX ve pikolinil ester türevleri tarafından üretilen kütle spektrumlarının yorumlanması gerekmektedir. ECL> 16 maç sahip üç zirveleri düz zincirli yağ asitleri tekli doymamış. DMOX türevi kütle spektrumları bu bileşiklerin çift bağ pozisyonunu tanımlayan tanısal iyonları göstermektedir. 1 Δ: Şekil 4'te N16 ve 8 karbon çift bağın mevcudiyetine işaret eden 196 ve 208 arasında 12 amu iyonunun bir boşluk görebilir
metil dallı zincirli DMOX ve pikolinil kütle spektrumları yağlı asitler monounsatured
1 Δ 9 FA: Şekil 6 I16 yapısını belirlemek için kullanılan DMOX spektrumunu ve pikolinil ester türevleri, sunar. pozisyonuDallanma iki türevleri 28 amu bir boşluk ile gösterilir. Şekil 6'da gösterildiği gibi, pikolinil ester bir DMOX 12 amu boşluğu 26, çift bağ pozisyonunu belirler.
yağ asitleri ve teşhis iyonlarının tespiti
Tablo 1, 30 ° C 'de yetiştirilen Bacillus cereus ATCC 14579 karşılık gelen tanı iyonlarıyla tanımlanan çeşitli yağ asitleri, göstermektedir. Bu teşhis iyonlar tamamlayıcı yapısal bilgi vermek DMOX ve pikolinil ester türevleri, karbon zincirindeki metil dallanma pozisyonları ve çift bağa tanımlar. tanı iyonlar pikolinil türevleri ile gözlemlemek kolay bazen DMOX türevleri ile gözlemlemek kolay, ve diğer zamanlarda olduğu gibi iki yaklaşım, gerçekten tamamlayıcı niteliktedir.
src = "/ files / ftp_upload / 54960 / 54960fig1.jpg" />
Şekil 1: Bacillus cereus yağ asitlerinin tanımlanması için strateji.
ardışık DMOX ve FAME kütle spektrumları, tutma süreleri (ECL) hakkında bilgi üreten adımlar ve pikolinil-ester gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2, Bacillus cereus tespit 1 yağ asidi: farklı 16 kromatografik profillerini karşılaştırması.
(A) FAME türevleri (m çıkarılan moleküler iyon / z 268); (B) DMOX türevleri (m ekstre moleküler iyon / z 307); (C) pikolinil türevleri (m / z 345 ekstre moleküler iyon).iles / ftp_upload / 54960 / 54960fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Elektron İyonizasyon tarafından üretilen I16 pikolinil türevi kütle spektrumu.
m / z 151, m / z 164 iyonları varlığı yağlı asitin bir pikolinil türevi göstermektedir. m / z 347 moleküler iyonu palmitik asidin bir izomer olarak tanımlanır. m iyonu arasında 28 amu bir boşluğun varlığı / z 304, m / z 332 I16 göstergesidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: n16: 1 Δ 8 DMOX türevi kütle spektrumu elektron tarafından oluşturulaniyonizasyon.
m iyonu / z 126 DMOX türevi, m / z 307 16 moleküler iyonu olduğunu gösterir: 1. DMOX ve m / z 196, m / z 208 de iyonlar arasında 12 amu bir boşluk bulunması konumunu tanımlar karbon 8. çift bağın bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: n16: elektron iyonizasyon tarafından üretilen 1 Δ 5 DMOX türev kütle spektrumu.
1 DMOX: m İyon / z 126 DMOX türevi ve m göstergesidir / z 307 16 moleküler iyonudur. Yoğun m / z 153 iyonu karbon 5. üzerinde bulunan bir çift bağ özelliğidir bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: DMOX (üst) ve pikolinil (alt) I16 karşılaştırılması 1Δ 9 spektrumları.
Her iki durumda da 28 amu boşluğu metil dallanma konumunu göstermektedir. çift bağ yeri, sırasıyla DMOX ve pikolinil türevleri için 12 amu boşluğu ve 26 amu tarafından elde edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| varsayılan bileşikler | Moleküler iyon (m / z) FAME; DMOX; pıkolinil | RT | ECL | Onaylandı kimlik | Teşhis iyonları DMOX | Teşhis iyonları pikolinil |
| i12 | 214; 253; 291 | 7.93 | bir referans | i12 | [276 (15); 262 (0); 248 (15)] MB | |
| n12 | 214; 253; 291 | 8.21 | 12.00 | n12 | [276 (10); 262 (20); 248 (20)] mb | |
| i13 | 228; 267; 305 | 8.53 | 12.5 | i13 | [290 (15); 276 (0); 262 (48)] mb | |
| a13 | 228; 267; 305 | 8.64 | 12.67 | a13 | [276 (48); 262 (0); 248 (65)] mb | |
| I14 | 242; 281; 319 | 9.24 | 13.52 | I14 | [304 (20); 276 (45) 290 (0)] mb | |
| N14 | 242; 281; 319 | 9.60 | 14.00 | N14 | [304 (7); 290 (17); 276 (17)] mb | |
| i15 | 256; 295; 333 | 10.06 | 14.51 | i15 | [318 (20); 314 (0); 290 (50)] mb | |
| a15 | 256; 295; 333 | 10.19 | 14.66 | a15 | [304 (30); 290 (TR); 276 (62)] mb | |
| N15 | 256; 295; 333 | 10.49 | 15.00 | N15 | [318 (5); 304 (13); 290 (18)] MB | |
| i16 | 270; 309; 347 | 11.04 | 15.5 | i16 | [332 (18); 318 (tr); 304 (42)] mb | |
| 1: Metil 16 çatallı | 268; 307; 345 | 11.19 | 15.64 | i16: 1Δ 5 | [152 (2); 153 (10)] db [292 (3); 278 (tr); 264 (2)] MB | |
| 1: Metil 16 çatallı | 268; 307; 345 | 11.40 | 15.83 | i16: 1 Δ 9 | [210 (3); 222 (3)] db [292 (12); 278 (tr); 264 (40)] mb | |
| n16 | 270; 309; 347 | 11.59 | 16.00 | n16 | [332 (5); 318 (15); 304 (15)] MB | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.78 | 16.14 | n16: 1 Δ 5 | [152 (2); 153 (10)] db | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11.94 | 16.24 | n16: 1 Δ 8 | [196 (5); 208 (3)] db | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 12.00 | 16.31 | n16: 1Δ 9 | [210 (3); 222 (3)] Db | |
| 16: 2 | 266; 305; 343 | 12.18 | 16.44 | N16: 2 Δ 5, Δ 9 | [152 (2); 153 (12)] db [208 (1); 220 (2)] db | |
| I17 | 284; 323; 361 | 12.25 | 16.5 | I17 | [346 (20); 332 (TR); 318 (35)] mb | |
| 1: Metil 17 çatallı | 282; 321; 359 | 12.43 | 16.64 | I17: 1Δ 5 | [152 (2); 153 (10)] db | [344 (10); 316 (5)] MB |
| a17 | 284; 323; 361 | 12.47 | 16.66 | a17 | [332 (30); 318 (0); 304 (52)] mb | |
| 1: Metil 17 çatallı | 282; 321; 359 | 12.57 | 16.74 | I17: 1Δ 8 | [196 (2); 208 (2)] db | [344 (10); 316 (5)] MB |
| 1: Metil 17 çatallı | 282; 321; 359 | 12.64 | 16.79 | I17: 1Δ 9 | [210 (3); 222 (3)] db | |
| 1: Metil 17 çatallı | 282; 321; 359 | 12.70 | 16.84 | I17: 1Δ 10 | [224 (1); 236 (1)] db | |
| 1: Metil 17 çatallı | 282; 321; 359 | 12.84 | 16.94 | a17: 1Δ 9 | [210 (3); 222 (4)] db | [330 (10); 316 (0); (90)] mb |
Tablo 1: Bacillus cereus ATCC 14579 ile ilgili yağ asitlerinin tanımlanması.
yağlı asit metil esterleri (FAME) için tutma süreleri, eşdeğer zinciri uzunluğu (ECL) değerleri ve moleküler iyonlar birlikte molekül iyonları ve DMOX Teşhis iyonlar ve pikolinil türevleri gösterilir.
[] 28 amu önce ve C dallanma sonra fragmanına tekabül eden bir kayıp gösteren MB tanısal iyon çifti.
[] Db tanısal iyon çifti, bir çift bağın parçalanması tekabül eden 12 amu kaybına işaret etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tablo 1 'de gösterilen FAs kromatogram profilleri bir agar plakası yüzeyi üzerinde büyütülmüş, B. cereus ATCC 14579 karşılık gelmektedir. Bakteri, aynı sıcaklıkta 8 de gaz sıvı ortam içinde büyütülmüştür da benzer profilleri elde edilmiştir. Sıvı ortamda yetişen bakteri durumunda, bakteriyel biyokütlenin büyüme ortamının santrifüj ile toplanır ve büyüme koşulları 8,19 bağlı olarak daha önce tarif edilen protokollere göre yıkanabilir. B. cereus tarafından üretilen çeşitli finansman kurumu tanımlanması düşük sıcaklık 7,9 olarak büyümesi için gerekli olan bazı genler üzerinde mutasyona uğramış suşlar tespit edilecek finansman kurumu oranında ince değişiklikler izin verdi.
Genellikle, ECL sabit bir sıcaklıkta belirlenen düzeltilmiş tutma süresi log değerleri kullanılarak hesaplanmaktadır: 20 (izotermal sıcaklık kontrollü bir fırın kullanarak). Burada, P bir izotermal olmayan fırının kullanılmasıilgi FAME optimize ayrılmasını ermit, hesaplama yöntemi daha önce lineer tutma endeksleri 3,21 için tarif edildiği kullanılır.
Bu çalışmanın amacı, literatürde tarif edilenler ile hesaplanan ECL değerleri karşılaştırmak için, ancak bu tutma verileri ve spektrumları bilgilere dayanarak, aynı kromatogram profil içinde, FA yapısını tahmin etmek değildi. Nitekim, doymuş finansman kurumu için, bir (iso veya anteiso-) dallanma vermiş olduğu eşdeğer düz zincirli FA ile karşılaştırıldığında her zaman olduğu gibi, ECL aynı kaymasına neden olur. Buna ek olarak, ECL eşdeğer polariteli kolonu üzerinde Stransky 22 ile ölçülen değerler ile uyumlu bu çalışmada hesaplanan. Daha önce bildirilen değerlerle bu uyuşma ECL değerler, bu şekilde ya da başka soybaşları içinde diğer durumlarda yetiştirilen B. cereus FAS'ıyla kromatogram profilleri (örn., Mutantlar) B. cereus tepe noktaların hızlı tespit edilmesi için çok yararlı olduğuna işaret etmektedir.
çift bağın konumu daha kolay DMOX türevleri ile atanmışken Pikolinil türevleri DMOX türevleri tarafından üretilen iyonların daha dallanma konumu göstermektedir daha karakteristik iyonlar bulunur. Bu çalışma, şu ana kadar, kötü literatürde tarif edilmiştir B. cereus, adlı FAs doymamış metil dallı zincirli belirlemek için, her iki türevleri bilgileri birleştirme yararını göstermektedir.
jove_content "> önerilen yaklaşım, NMR spektroskopisi için bir karşılaştırma olarak, her bir FA çalışma ve biyolojik maddenin büyük miktarda birkaç hafta temsil arındırılmalıdır. 2 gün içinde tamamlanabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım (geometri ayırt etmez çift sınırları) sis, trans. bir kez, her FA tanımlanır, bunlar rutin bakteri suşları ve mutantlar karşılaştırmak ya da büyüme koşullarının etkisini incelemek için, örneğin kendi FAME türevleri ile ölçülebilir. bizim ellerde, çok az olarak 8 mg taze bakteri hücreleri. bakteriler büyümek için zor uygulanabilir bir yöntem yapar tanımlanan finansman kurumu her biri için miktar limiti GC / MS enjekte solüsyonun 1 ng / ml olan Fas'ın ölçümü için yeterli idi evi.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar kendi teknik destek için Thomas Mison minnettarız ve yazının gözden geçirilmesi için Rachel Kopec için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
References
- Christie, W. W., Han, X. Lipid Analysis 4th Edition. , Oily press. (2010).
- HÜbschmann, H. -J. Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition. , Wiley-vch. (2015).
- Sasser, M. Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids. MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).
- Spitzer, V. Structure analysis of fatty acids by gas chromatography - Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives - A review. Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).
- Harvey, D. J. Advances in lipid methodology. Volume 1. Christie, W. W. , Oily press. Dundee. 19-80 (1992).
- Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebretière, M. -H., Broussolle, V., Brillard, J. Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation. Front Microbiol. 6, (2015).
- Brillard, J., et al. Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).
- de Sarrau, B., et al. Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties. Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).
- Diomandé, S. E., et al. Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth. Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).
- Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P. Applications and Systematics of Bacillus and Relatives. Berkeley, R. C. W. , Blackwell Science Publ. 1-7 (2002).
- Kämpfer, P. Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species. System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).
- Kaneda, T. Fatty-acids of genus bacillus - example of branched-chain preference. Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).
- Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).
- Sasser, M., et al. Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters. J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).
- Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities. Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).
- Destaillats, F., Angers, P. One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids. J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).
- Fay, L., Richli, U. Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization. J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).
- Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids. Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).
- de Sarrau, B., et al. Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions. Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).
- Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters. Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).
- van Den Dool, H., Kratz, P. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).
- Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids. J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).
