Introduction
L'obiettivo di questo lavoro è quello di delineare un metodo riproducibile per misurare in modo non invasivo in vivo funzione mitocondriale nel muscolo scheletrico in persone fisiche che hanno una vasta gamma di abilità. insufficienza mitocondriale aberrante è un segno distintivo di una vasta gamma di sindromi metaboliche e le malattie genetiche, dalle condizioni comuni come l'invecchiamento e il diabete di malattie rare come l'atassia di Friedreich.
Sindrome metabolica e disfunzione mitocondriale
La sindrome metabolica è stato indicato per interrompere la funzione mitocondriale, deprimere scheletrico OXPHOS muscolare, e portare a stoccaggio dei lipidi ectopica nel muscolo scheletrico 1, 2. Organelli come critici che regolano metabolismo e l'omeostasi energetica, i mitocondri sono implicati nella fisiopatologia dell'obesità 3, 4, 5 insulino-resistenza (DM2) 6, 7, correlata al diabete micro 8, 9, 10, 11 e complicanze macrovascolari 12, 13, e non alcoliche malattia del fegato grasso (NAFLD) 14, 15, 16, tra gli altri, .Insulin resistenza è caratterizzato da profondi cambiamenti nel muscolo scheletrico attività mitocondriale, tra cui diminuito mitocondriale degli acidi tricarbossilici (TCA) tasso di flusso, il tasso di sintesi di ATP e citrato sintasi e NADH: O 2 attività ossidoreduttasi 5. Una ipotesi è che queste alterazioni potrebbero essere dovute all'accumulo di acidi grassi liberi (FFA) metaboliti nel muscolo, che vengono notevolmente aumentata durante l'obesità e altri obesità-rmalattie euforico 2, 17. L'esposizione del muscolo FFAs elevati e intermedi lipidici può diminuire l'espressione di geni nella via ossidativa dei lipidi e il ciclo TCA e catena di trasporto degli elettroni (ETC) 18. Questa riduzione mitocondriale scheletrico capacità OXPHOS muscolare nella cornice di un sovraccarico di lipidi è accompagnata da una diminuzione del (contenuto e la biogenesi dei mitocondri) quantitativa 19 e la funzione qualitativa dei mitocondri dei muscoli scheletrici 20. Esponendo muscolo scheletrico e miociti a FFAs porta a grave resistenza all'insulina, e una maggiore assorbimento di FFA nel muscolo è associata alla resistenza all'insulina in entrambi gli esseri umani e roditori 21. Il intermedi lipidici ceramide e diacilglicerolo (DAG) hanno dimostrato di inibire direttamente la via di segnalazione dell'insulina alterando l'attività di chinasi, come la proteina chinasi C e protein chinasi B 21. Pertanto, molecole lipidiche di derivazione sembrano svolgere un ruolo di primo piano nello sviluppo della scheletrico insulino-resistenza muscolare e diabete di tipo 2. Tuttavia, non è chiaro se i cambiamenti nella capacità mitocondriale sono una causa o una conseguenza di insulino-resistenza 22.
Atassia e mitocondriale disfunzione di Friedrich
OXPHOS Diminuzione possono anche derivare da difetti genetici. L'atassia di Friedrich (FA), la forma più comune di atassia ereditaria, è una malattia genetica causata da una mutazione nel fratassina (FXN) gene, con conseguente accumulo di ferro intra-mitocondriale, la produzione di specie reattive dell'ossigeno, e anomalie della fosforilazione ossidativa 23, 24, 25, 26. Questa importante scoperta ha portato allo sviluppo di terapie mirate, which obiettivo di migliorare la funzione mitocondriale a livello sub-cellulare. Nonostante questa comprensione, vi è stato limitato sviluppo in vivo, biomarcatori riproducibili per la ricerca clinica FA. In realtà, una barriera critica nella valutazione efficace delle terapie mirate in FA è l'incapacità di tenere traccia delle modifiche in funzione mitocondriale. misure funzionali attuali, per esempio, può identificare diminuzione della gittata cardiaca; tuttavia, sono incapaci di determinare il livello a cui avviene il erettile (Figura 1). Lo sviluppo di un indicatore affidabile della funzione mitocondriale che può essere utilizzato per identificare e valutare la progressione della malattia in atassia di Friedrich è fondamentale per valutare il relativo impatto meccanicistica di terapie mirate.
OXPHOS deteriorate e disfunzione cardiaca
Aberrant funzione mitocondriale, sia acquisita o genetica, potrebbe contribuire allo sviluppo o la progressione di cardiLa disfunzione ac. Nelle condizioni di sovraccarico di pressione e di insufficienza cardiaca, l'energia primaria passa substrato di preferenza da FFA al glucosio. Questo è associato con diminuzione dell'attività ETC e fosforilazione ossidativa 27. La fisiopatologia della bioenergetica mitocondriale nella disfunzione cardiaca può essere diverso a seconda della provenienza primaria del difetto mitocondriale. Diabete e sindrome metabolica risultati in alterazioni mitocondriali nel miocardio, come la biogenesi compromessa e il metabolismo degli acidi grassi, che portano ad una ridotta flessibilità del substrato, l'efficienza energetica, e alla fine, la disfunzione diastolica 28, 29. In FA, invece, una carenza frataxin risultati in significativo accumulo di ferro mitocondriale in cardiomiociti 30, 31. Accumulo di ferro porta alla produzione di radicali liberi tramite la reazione di Fenton 32 </ Sup> e aumenta la possibilità di danni dei radicali liberi indotti cardiomiociti. L'accumulo di ferro intra-mitocondriale è anche associata ad una maggiore sensibilità allo stress ossidativo e una ridotta capacità ossidativa 30, 31. L'accumulo di ferro e la successiva funzione mitocondriale aberranti, a causa della carenza di fratassina, possono quindi essere responsabile per l'energetica cardiaca compromessa e cardiomiopatia osservati in FA 33, 34. E 'anche interessante notare che la capacità ossidativa ridotta nei mitocondri dei muscoli scheletrici parallela alla intolleranza esercizio e ridotta capacità metabolica nello scompenso cardiaco (HF) 35. Misurazione della scheletrico capacità OXPHOS muscolare, come specificato nel presente documento, è facilmente implementabile e robusto; accoppiato con il significato di OXPHOS muscolo scheletrico in HF, queste caratteristiche lo rendono un biomarker attraente in studi completi di sentiret malattia 36.
OXPHOS deteriorate e la disfunzione cardiaca di accompagnamento non è un aspetto irrilevante di metabolica e malattia mitocondriale. I soggetti con diabete e malattie metaboliche sono a più alto rischio di sviluppare malattie cardiovascolari e hanno eccesso di mortalità dopo infarto miocardico (MI) 37, 38, 39, 40, 41; oltre la metà dei soggetti FA avere cardiomiopatia, e molti muoiono di aritmia cardiaca o insufficienza cardiaca 42. Pertanto, la quantificazione della riduzione OXPHOS potrebbe non solo permettere la diagnosi precoce e il trattamento della disfunzione cardiaca, ma potrebbe anche alleviare un grande onere clinica in queste malattie.
terapie mirate per aumentare direttamente la capacità OXPHOS è un settore promettente per migliorare il trattamento di soggetti, whether la causa della disfunzione metabolica è genetica o acquisita. Attualmente, lo sviluppo di nuovi farmaci che alleviano o anormale funzione mitocondriale 43 o correggere il difetto genetico primario 44 in grado di migliorare la bioenergetica caratteristica squilibrato di FA mirati. Nel caso di disfunzione mitocondriale acquisita, aumento dell'attività fisica può migliorare la funzione mitocondriale 45, 46, 47.
31 Fosforo spettroscopia di risonanza magnetica come biomarcatore non invasivo della funzione mitocondriale
Indipendentemente dalla terapia testata, un integrato nella valutazione vivo di bioenergetica del muscolo scheletrico è uno strumento fondamentale per valutare l'impatto degli interventi mirati, soprattutto nei soggetti con grave intolleranza esercizio fisico o l'incapacità di subire metabo convenzionaletest lic. Spettroscopia di risonanza magnetica sintonizzato fosforo (31 PMRS), un nucleo endogena trovato in vari substrati ad alta energia all'interno delle cellule in tutto il corpo, è stato utilizzato per quantificare la capacità ossidativa mitocondriale utilizzando una varietà di approcci, compreso a magnete protocolli esercizio recupero e stimolazione muscolare protocolli 48. I protocolli esercizio di recupero si basano su una serie di apparecchi che vanno in complessità da ergometri compatibili con la risonanza magnetica che regolano e misurano il carico di lavoro per semplici configurazioni di cinghie e tamponi che consentono di scoppio di tipo resistivo e l'esercizio fisico quasi-statico. Uno degli obiettivi primari di qualsiasi di questi protocolli è quello di produrre uno squilibrio energetico per il quale la domanda di adenosina trifosfato (ATP) viene inizialmente soddisfatta attraverso la ripartizione enzimatica di fosfocreatina (PCR) attraverso la creatina chinasi reazione 49. Al momento della cessazione di esercizio, il tasso di produzione di ATP è dominata da pho ossidativosphorylation e rappresenta la massima capacità vivo dei mitocondri 50. Inoltre, OXPHOS durante il recupero post-esercizio può essere descritto da una reazione di primo ordine 51. Il recupero post-esercizio della PCR può quindi essere quantificata dal montaggio di una costante di tempo esponenziale (τ PCR), con i valori più bassi di τ PCr che rappresentano una maggiore capacità di sintesi di ATP ossidativo. Notevoli sforzi sono stati fatti per validare 31 PMRS contro ex vivo e misure più dirette di OXPHOS e dimostrare il potenziale applicabilità clinica di questa tecnica 52, 53, 54, 55.
In particolare, il protocollo descritto in questo lavoro può essere implementato su scanner clinicamente disponibili, ed è stato ampiamente validato quale non invasivo biomarker of funzione mitocondriale 56. Tuttavia, un esercizio di 31 protocollo PMRS ottimizzato per l'applicazione alle persone con diversi livelli di gravità della compromissione neuromuscolare o di mobilità non è stato ben definito 57. A ben definito, in generale, applicabile protocollo di esercizio e il 31 la tecnica PMRS sarebbero particolarmente utili nella valutazione delle patologie con anomalie fondamentali nella funzione mitocondriale.
Diversi studi precedenti hanno esplorato le applicazioni di tecniche non invasive per quantificare la funzione mitocondriale nei soggetti. Per esempio, queste tecniche hanno dimostrato OXPHOS ridotta nei soggetti con diabete di tipo 2 36. Lodi et al. prima testato la fattibilità di tecniche PMRS in soggetti con FA ed ha trovato che 1) il difetto genetico fondamentale nella FA danneggia scheletrico OXPHOS muscolare e 2) il numero di GAA tripletta ripetizioni è inversamente proporzionale al muscolo scheletrico OXPHOS 33. Più recentemente, Nachbauer et al. PMRS usato come misura di esito secondario in un trial clinico di FA con 7 soggetti. I tempi di recupero PCR sono stati significativamente più lungo nei soggetti rispetto ai controlli, riaffermando precedente lavoro di Lodi e che indica che gli effetti di espressione frataxina aberrante in FA possono causare una diminuzione della capacità mitocondriale che è rilevabile con tecniche PMRS 58.
Metodi affidabili per definire in modo adeguato in vivo funzione del muscolo scheletrico in un rapporto costo-efficacia, e modo riproducibile fattibile sono fondamentali per migliorare i risultati soggetti a una serie di malattie che colpiscono la funzione mitocondriale.
Questo lavoro delinea una procedura affidabile per ottenere in vivo massima capacità ossidativa del muscolo scheletrico con 31 PMRS. Il protocollo di esercizio in-magnete è ben tollerato da individui che coprono una vasta gamma di fisica e functionaL capacità e offre una messa a punto soggetto semplificata utilizzando attrezzature poco costoso e ampiamente disponibili.
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Protocol
Questo protocollo è approvato dalla e segue le linee guida della Institutional Review Board Ohio State University per la sperimentazione umana. E 'estremamente importante che tutte le procedure che coinvolgono attrezzature MR vengono eseguite da personale adeguatamente addestrato che aderiscono ai più alti standard di sicurezza MR 59.
1. Materiali e preparazione
- Assicurarsi che tutti i materiali necessari sono disponibili prima dell'esperimento (Figura 2).
- Inserire la bobina 31 P nel connettore bobina-tabella alla fine della tabella esame più vicino al foro. Mettere un grande cuscino di schiuma triangolo vicino alla testa del tavolo esame RM, ma non direttamente sulla bobina 31 P. Posizionare un cuscino capo all'altro capo del tavolo dell'esame MR, lontano dal foro, per il comfort soggetto.
2. Fatte salve di posizionamento (Figura 3a)
- Istruire il soggetto a mentire in posizione supina, piediprima sul tavolo MR. Posizionare un cuscino di schiuma sotto le ginocchia per sostenere la gamba in una posizione parzialmente flessa.
- Posizionare il soggetto vicino al lato destro della tabella (destra del soggetto) per centrare il più fedelmente la coscia sinistra alla isocentro magnete possibile, garantendo così l'omogeneità B0 ottimale nel muscolo della coscia in esame. Fornire l'argomento con tappi per le orecchie e / o cuffie.
- Posizionare la bobina RF 31 P sul quadricipite sinistro a circa il punto medio tra la rotula e la testa del femore, e fissare alla gamba utilizzando cinghie. Posizionare la bobina sulla porzione laterale della gamba, sopra vasto laterale.
- Fissare l'olio bambino al mediale della coscia con le stesse cinghie utilizzate per fissare la bobina alla gamba. Questo facilita la localizzazione di scansione.
- Legate gambe del soggetto insieme con una cinghia posto sotto la bobina e sopra il ginocchio. Fissare le gambe del soggetto al tavolo MR con Stra aggiuntivops, uno sopra il ginocchio e uno a metà strada tra il ginocchio e la caviglia.
- Utilizzare la guida di luce laser per delineare il centro della bobina e spostare la tavola all'isocentro magnete utilizza questo centraggio riferimento.
3. Esercizio protocollo
- Spiegare al soggetto che il protocollo di esercizio si compone di tre fasi: una fase della linea di base iniziale; una breve, fase di esercizio intenso; e una fase di recupero.
- Istruire il soggetto a restare immobile e rilassare i muscoli delle gambe durante le fasi iniziali e recupero dell'acquisizione spettroscopia per minimizzare artefatti da movimento.
- Fornire un conto alla rovescia per il soggetto che indica l'inizio di esercizio. A questo punto, ha il soggetto avviare ginocchio estensione / flessione come forza e il più rapidamente possibile contro la resistenza delle cinghie.
NOTA: I muscoli quadricipiti sono usati per spostare la parte inferiore della gamba sinistra su e giù, fino incaricato di fermare. - Termina esercizio dopo un calo del 30%in altezza del picco PCr.
- Osservare l'altezza del picco PCr nella finestra di visualizzazione di acquisizione, ed anche vederlo al termine della sequenza di esercizio.
NOTA: Una linea guida generale è che un approssimativo diminuzione del 30% in PCr altezza del picco corrispondente a un picco Pi che è il 50% dell'altezza del picco PCr. Se l'esaurimento la PCR non sta avvenendo abbastanza rapidamente per ottenere un calo del 30% durante la fase di esercizio della prova, di incoraggiare il soggetto a calciare più forte o più veloce durante l'attività fisica.
NOTA: cessazione di esercizio è determinata monitorando l'altezza di picco della PCr e durata di esercizio. Ciò può dar luogo a diverse durate di esercizio di diversi pazienti e può essere rappresentato nell'analisi.
- Osservare l'altezza del picco PCr nella finestra di visualizzazione di acquisizione, ed anche vederlo al termine della sequenza di esercizio.
4. Protocollo di scansione
- Acquisire un localizzatore tri-plane per verificare il corretto posizionamento soggetto e identificare la posizione della bobina 31 P.
NOTA: La sequenza localizzatore inizia automaticamente e centra al indicposizione ated utilizzando la guida di luce laser (passo 2,9) - Acquisire un secondo localizzatore tri-aereo.
- Aprire la vista fetta su le prime immagini localizzatore tri-aereo.
NOTA: Questo processo può essere diverso per i diversi sistemi software e hardware. - Centro e ruotare l'orientamento fetta sinistro del mouse e tenendo premuto sul gruppo fetta. Ruotare il gruppo fetta. Assicurarsi che l'orientamento finale di fette coincide con la posizione del bambino dell'olio.
- Nella finestra di routine di sequenza, aumentare il numero di fette di coprire l'intera gamba in immagini assiali e sagittali (Figura 3b).
- Aprire la vista fetta su le prime immagini localizzatore tri-aereo.
- 31 P sequenza spettroscopia:
- Utilizzare i seguenti parametri della sequenza non localizzato impulsi acquisire: TR: 1,000 msec; TE: 0,34 msec; larghezza spettrale: 2.000 Hz; flip angle: 90 gradi; punti di dati acquisiti: 1.024; 4 medie risultanti in una risoluzione temporale di spettro 1 ogni 6 sec.
- 31 P spessore box posizionamento:
- Utilizzo di un mouse, trascinare le seconde immagini triplane localizzatore nella finestra di visualizzazione nella parte superiore dello schermo. Trascinare la sequenza di spettroscopia nella finestra di protocollo e fare doppio clic per aprire.
- Utilizzare la barra degli strumenti di posizione per visualizzare la voxel spessore (selezionare il rettangolo nero con linee orizzontali). Dopo aver selezionato questa opzione, osservare una scatola verde sulle immagini localizzatore.
NOTA: Questo è il voxel spessore. - Spostare il voxel sinistro del mouse e tenendo premuto il voxel nel centro. Modificare le dimensioni e ruotare l'orientamento del voxel sinistro del mouse e tenendo premuto il voxel all'angolo della scatola. Posizionare la scatola spessore in modo da garantire l'omogeneità B0 campo direttamente sotto la bobina e parallelo al piano del quadricipite.
NOTA: Questo per garantire una corretta shimming nella regione sensibile sotto la bobina, che è il volume di tessuto direttamente sotto il centro della bobina. - Utilizzare le immagini tri-plane localizzatore per individuare il sensitive regione della bobina e regolare la casella shim per comprendere questa regione all'interno del muscolo quadricipite.
NOTA: La scatola spessore può essere lunga superiore alla copertura della bobina di superficie al fine di garantire l'omogeneità B0 ai acquisizione dati voxel (figura 3c). - Acquisizione di prova 31 P:
- Aprire la finestra di visualizzazione di acquisizione e selezionare l'icona testa nella barra degli strumenti di acquisizione. Ciò consentirà per la visualizzazione di acquisizione spettroscopia in tempo reale.
- Dopo il posizionamento del 31P spessore voxel, eseguire la sequenza per ottenere un singolo spettro facendo clic sul pulsante "Esegui" nella parte superiore della finestra del protocollo.
- Esaminare la qualità della B0 shimming. Osservare lo spettro risultante nella finestra di acquisizione. Osservare un importante picco di PCr centrato a 0 ppm e nessun rumore significativo (figura 4a, a sinistra).
NOTA: Risoluzione dei problemi: Se lo spettro appare rumorosa, assicurarsi che la casella di spessore è collocato all'interno del muscolo. Anno Dominisolo la dimensione e la posizione della casella shim per migliorare il rapporto segnale-rumore. Ripetere l'acquisizione di test come necessario. - Per vedere l'altezza del picco PCr, aprire lo spettro nello strumento di spettroscopia ( "Applicazioni" → "spettroscopia"). Aprire la cartella del paziente (cartella albero icona), selezionare la scansione appropriata, e fare doppio clic per caricare lo spettro.
- immagine T1 pre-esercizio:
- Ottenere un'immagine T1 pesate assiali singola slice al centro di una bobina.
- 31 P acquisizione pre-esercizio:
- Copiare la sequenza dal punto 4.4 (che ha prodotto la migliore qualità spettrale) sinistro del mouse e trascinando la sequenza nella finestra di protocollo. Utilizzare questa sequenza per tutte le misurazioni successive.
- Nella finestra di routine di sequenza, aumentare il numero di misurazioni da 1 a 10. Selezionare run acquisire 10 misurazioni mentre il soggetto è a riposo.
- 31 </ Sup> P acquisizione esercizio:
NOTA: Prendere nota dei tempi di inizio e di fine esercizio, in quanto questo sarà importante per l'analisi.- Riposo: Applicare le impostazioni shim dalla scansione precedente e impostare la sequenza di acquisire 20 misure. Istruire il soggetto di iniziare a calci dopo un conto alla rovescia. Istruire il soggetto a restare a riposo per 2 misure.
- Esercizio: Chiedi al soggetto di eseguire l'esercizio estensione del ginocchio per ~ 30 sec (o il tempo necessario per ottenere una riduzione del 30% nel picco di ampiezza PCr). Dopo che il soggetto raggiunge esaurimento PCr sufficiente, chiedere loro di riposare.
- 31 P post-esercizio acquisizioni:
- Acquisire ulteriori 20 misurazioni a riposo. Assicurarsi che le acquisizioni di post-esercizio iniziano subito dopo la sequenza di esercizio, senza pause o spessori (figura 4a, a destra).
NOTA: La suddivisione del periodo di recupero in due distinte operazioni consente di analizzare l'initial 20 spettri dinamica durante l'acquisizione del secondo 20 spettri dinamico, consentendo all'operatore di evitare l'acquisizione del periodo di recupero completo se l'esercizio deve essere ripetuta.
- Acquisire ulteriori 20 misurazioni a riposo. Assicurarsi che le acquisizioni di post-esercizio iniziano subito dopo la sequenza di esercizio, senza pause o spessori (figura 4a, a destra).
- Garantire la qualità esercizio:
- Confrontare le altezze dei picchi PCr all'inizio e alla fine dell'esercizio. sessioni di esercizio di alta qualità producono un ~ diminuzione del 30% della concentrazione PCr.
- Verificare che l'altezza del picco PCr è uguale all'inizio di riposo e al termine del recupero (tipicamente, <10% di differenza è desiderato). Ciò assicura che non vi era trascurabile perdita di campo omogeneità durante l'acquisizione.
NOTA: Se la ripartizione PCR è insufficiente, o se vi è stata una perdita di campo omogeneità, quindi ripetere la porzione di esercizio / recupero della prova (avendo cura di evitare l'affaticamento), assicurarsi che la bobina e le cinghie sono fissate in modo sicuro, e si estendono la durata di esercizio e / o incoraggiare l'esercizio più vigorosa (Figura 4b).
NONE: Il confronto delle immagini ottenute nei passaggi 6 e 11 permessi di un passo ulteriore controllo di qualità di visualizzare qualsiasi spostamento della coscia e la bobina per effetto dell'esercizio, assicurando così che il movimento minimo si è verificato durante il protocollo, che potrebbero influenzare in modo significativo i dati acquisiti .
- A seguito di imaging T1 post-esercizio, ripetere il pre-esercizio assiale di imaging T1 (passo 4,5) utilizzando gli stessi parametri di acquisizione.
- Oltre a sufficiente deplezione di PCr, misurare l'esercizio pH finale garantire che l'esercizio non induce acidosi del muscolo.
- Eseguire questa misurando lo spostamento chimico tra Pi e PCR (Ap i) e utilizzando la seguente equazione 60:
pH = 6.77 + log [(Ap i -3.29) / (5,68-Ap i)]
NOTA: Il pH dovrebbe rimanere superiore a 6.8 61. Se la ripartizione PCr è sufficiente ma il pH è troppo basso, ripetere l'esercizio per un breve periodoer durata e / o con una ridotta intensità.
- Salvataggio dei dati:
- Salva tutti gli spettri acquisiti come file DICOM ed esportarli per l'elaborazione utilizzando JMRUI.
- Se si utilizza uno scanner, selezionare tutte le acquisizioni di spettroscopia nella finestra "Navigator".
- In "Applicazioni", selezionare "Strumenti Dicom" → "Esporta MR spettroscopia", e salvare i file DICOM (* .dcm) a C: / user / MedCom / temp / CDROFFLINE
(Lo strumento sceglie automaticamente questa posizione). - In "Transfer", selezionare "Esporta in linea." Salvare nella posizione desiderata.
5. Elaborazione dati e analisi 62
- Analizzare la MR spettri con il software JMRUI liberamente disponibile (versione 5.2; http://www.jmrui.eu/).
- Apodize e sfasamento gli spettri per garantire l'uniformità di tutti i punti temporali acquisiti (Figura 5). Il picco PCR sarà centrato unt 0 ppm negli spettri.
- Utilizzare l'algoritmo amares incorporato per quantificare l'ampiezza del picco PCr in ogni spettro acquisito. L'ampiezza di picco rappresenta la concentrazione della PCr nella regione sensibile della bobina di superficie in quel particolare punto di tempo.
- Nel software computazionale, tracciare le concentrazioni PCr in funzione del tempo di acquisizione. Utilizzando il built-in strumento di curva-fit software di calcolo, si adattano i dati periodo di recupero PCR per la seguente equazione 52, 63:
- Registrare i valori della linea di base PCr (
), Il più basso PCr ( 
), E il tempo di recupero ( 
. - Assicurarsi che le condizioni appropriate siano soddisfatte durante il Exersessione CISE calcolando l'esaurimento PCr, la differenza percentuale tra la linea di base PCR e il più basso PCR. sessioni di esercizio ideale si ottiene un 20 - deplezione 50%.
NOTA: La qualità del montaggio di curva può essere assicurata verificando che il valore R 2 è maggiore di 0,75. R 2 valori vengono calcolati automaticamente dal software di montaggio.
), Il più basso PCr ( 
), E il tempo di recupero ( 
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Representative Results
La riproducibilità di studio
Sei volontari (4 uomini e 2 donne, età media: 24,5 ± 6,2 anni) con nessun cuore auto-riportati, metabolica o malattia mitocondriale sono stati sottoposti a sessioni di esercizio e di imaging tecnica 31 PMRS descritto a 2 giorni diversi entro 1 settimana per valutare la tecnica riproducibilità (Figura 6a). Gli studi condotti su volontari sani confermano la riproducibilità dello studio 31 PMRS nella quantificazione della funzione mitocondriale. Un'analisi Bland-Altman di PCr tempo di recupero dimostra una differenza deviazione standard medio di 1,03 4,83 sec ed un coefficiente tra-processi di variazione di 4.66 (figura 6b). sono stati richiesti modifiche al protocollo di acquisizione o di analisi descritto nella sezione metodi per ottenere dati di buona qualità, come descritto al punto 4 del protocollo. questi resULT dimostrano la riproducibilità delle tecniche di acquisizione e analisi descritte in questo lavoro.
Tecnica di valutazione nei partecipanti non deambulanti con atassia di Friedrich
Quattro partecipanti (2 uomini e 2 donne, età media: 35) sono stati sottoposti una singola sessione di esercizio e di imaging tecnica 31 PMRS descritta in questo lavoro per valutare la sua fattibilità in una popolazione non deambulanti con FA. Questi soggetti sono stati in grado di eseguire gli esercizi in-calamita per ottenere sufficienti esaurimento della PCR per adattare i parametri di recupero indicati al punto 5.6. Tuttavia, i tempi di esercizio più - sono stati richiesti (60 90 sec) per esaurire sufficientemente i livelli di PCR. Inoltre, oscillazioni attorno la misura che sono stati causati dalla progressiva perdita del controllo muscolare, che è caratteristica di questa malattia, sono stati rilevati (Figura 7). Per questi subjects, abbiamo utilizzato due cinghie resistivi aggiuntivi tra le ginocchia e caviglie, per un totale di tre cinghie, per limitare il movimento indesiderato. Questi risultati dimostrano la fattibilità della tecnica acquisizione e l'analisi di ottenere tempi di recupero PCr in soggetti non ambulatoriale. Tuttavia, le modifiche necessarie per ottenere dati di buona qualità indicano che ulteriori studi di valutazione e di normalizzazione sono necessarie.
Studio di fattibilità
Nove volontari senza malattia cardiovascolare auto-riferito e 15 soggetti di cui a un programma di riabilitazione cardiaca e la prevenzione secondaria (CRSP) sono stati arruolati in un comitato di revisione istituzionale locale (IRB) di studio -approvato. Abbiamo ottenuto alcuni valori clinici come indicatori di salute cardiovascolare e la gravità della sindrome metabolica. La frazione di eiezione ventricolare sinistra è stata conservata in soggetti CRSP (56 10%). il maximum capacità sforzo cardiovascolare, misurato prima di iniziare CRSP, è risultata simile nei soggetti con e senza diabete (3.05 0.6 contro 3.4 0.8 equivalenti metabolici Mets, p = 0,4). Prima di iniziare CRSP, ogni soggetto Iscritta sottoposto l'esercizio e l'imaging tecnica 31 PMRS, descritto in questo lavoro, e la formazione immagine di grasso intramuscolare quantificazione, descritto in precedenza 64. La costante di tempo di recupero PCR è stata più lunga (41,9 1.4 contro 32.1 7.4 sec, p = 0.05), e la percentuale di grasso intramuscolare era più alta nei soggetti CRSP rispetto ai controlli (8,7 2,9 contro 2,54 0.6%, p <0,001). La percentuale di grasso intramuscolare è risultata simile in soggetti CRSP con e senza diabete (p = 0,4), e della costante di tempo di recupero PCr tendeva ad essere più lungo nei soggetti diabetici rispetto a quelli senza diabete e nei controlli (p = 0,03 per le tendenze tra i gruppi). i dati di follow-up preliminari suggeriscono un miglioramento notevolmente peggiore inMET post-CRSP in soggetti diabetici rispetto a quelli senza (delta = 1,0 0,8 contro 4,0 2,4, p = 0,06; Figura 8). Questi risultati dimostrano la fattibilità di questa tecnica per quantificare differenze OXPHOS muscoli scheletrici tra soggetti con e senza malattia metabolica nota.
Figura 1. I mitocondri, muscolo scheletrico e sistemi cardiopolmonari.
Viene mostrata una rappresentazione del legame tra mitocondri, muscolo scheletrico, la gittata cardiaca, la ventilazione, e la capacità funzionale. Tratto da Milani et al 65.
Figura 2. Materiali.
I materiali richiesti comprendono 1) un cuscino triangolo,
Figura 3. Posizionamento.
A) I soggetti vengono esposte in posizione supina, piedi-prime. La bobina 31 P è posto sulle quadricipite sinistro. cinghie resistivi sono posizionati sopra e sotto il ginocchio e fissate al tavolo. Una singola cinghia viene utilizzato per legare due gambe sopra il ginocchio. B) Il posizionamento fetta viene mostrato per la seconda localizzatore. Si noti che le fette siano centrate alla Locazione della bottiglia olio per bambini, e fette coprire l'intero quadricipite. C) Il posizionamento scatola spessore di 31 PMRS è mostrato. Questo volume viene posizionato direttamente sotto la bobina del quadricipite e copre una profondità che assicura segnale sufficiente e spessoramento appropriata all'interno della zona della bobina di superficie.
Figura 4. Acquisizione dati.
A) Viene mostrato un rappresentante acquisizione 31 P a riposo. La PCR è il grande picco di singolo, e non vi è il minimo rumore (a sinistra). Un tipico acquisizione durante la parte esercizio dei risultati di protocollo in due grandi picchi, Pi e PCr (destra). Come esercizio progredisce, i picchi Pi e PCR aumentare o diminuire, rispettivamente. B) Il confronto dell'altezza del picco della PCr a riposo e post-esercizio dovrebbe rivelare almeno% di diminuzione ~ 30. Questo c ALCOLO dovrebbe essere fatto alla console scanner per garantire il completamento dello studio esercizio.
Figura 5. Analisi.
Sono indicati la correzione di fase e apodizzazione di uno spettro rappresentativo. A) Uno spettro grezzo che mostra un picco di un-fasi e la presenza di rumore che oscura i picchi. B) Uno spettro che mostra 0 ° - e il 1 ° correzione di fase-order. Il picco PCr situato alla frequenza centrale è facilmente identificabile, ma altri picchi di metaboliti sono ancora oscurato. C) Lo spettro dopo apodizzazione con una forma di linea lorentziana, con una conseguente riduzione del rumore e una migliore visualizzazione dei picchi 3 ATP e la PDE e Pi picco. Questo spettro è pronto per il picco quantificazione con lo strumento amares. file / ftp_upload / 54.977 / 54977fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. 31 PMRS in soggetti sani.
A) La figura mostra il recupero della fosfocreatina (PCr) concentrazione dopo il suo esaurimento con rapida esercizio di estensione del ginocchio quasi statica. La linea rappresenta la misura della funzione di recupero esponenziale descritto al punto 5.6, con il tempo di recupero costante τ mostrato; questa costante di tempo è un biomarker consolidata della funzione ossidativa mitocondriale. B) L'analisi Bland-Altman del 31 PMRS tecnica riproducibilità dimostra una differenza deviazione standard media di 1,03 4,83 sec per il tempo di recupero PCr tra la prova; il coefficiente di variazione è 4.66.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54977/54977fig6large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. 31 PMRS in soggetti non deambulanti.
Viene mostrata una curva di recupero PCr rappresentante dal 31 PMRS esame di un soggetto non deambulanti. Si noti che un impoverimento di PCR del 64% è stato raggiunto con questo protocollo di esercizio. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8. 31 PMRS in soggetti CRSP.
Un confronto della PCR RECOVery volte dimostra in modo sequenziale più povera capacità ossidativa mitocondriale in controllo, non diabetici, e soggetti diabetici. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard.
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Discussion
Questo documento descrive un protocollo standard per l'esame 31 PMRS che permette la misurazione di serie e non invasiva in vivo del muscolo scheletrico funzione mitocondriale. Il protocollo tiene notevole appeal quando si considera l'ampiezza delle indagini rivolte al crescente peso della sindrome metabolica e la sua morbilità e mortalità che ne deriva. Questo protocollo 31 PMRS richiede una quantità minima di tempo scanner e può essere incorporato in indagini metaboliche globali nei soggetti in qualsiasi centro con strutture disponibili in commercio MRS.
I passaggi critici all'interno del protocollo
Contraindications- prima degli esami MR, è fondamentale per lo screening soggetti per i potenziali controindicazioni. Oltre ai criteri tipici di esclusione MR, il seguente dovrebbe essere considerato prima di implementare questo protocollo: protesi 1) del ginocchio o dell'anca omolaterale (indipendentemente ocompatibilità f MR) per evitare artefatti, 2) le condizioni che limitano il flusso di sangue o la consegna di ossigeno agli arti inferiori (per esempio, malattia delle arterie periferiche), 3) l'incapacità di eseguire resistivo esercizio quadricipite estensione, e 4) l'incapacità di mentire in posizione supina per circa 30 min.
Movimento manufatto riduzione-Il movimento della bobina 31 P rispetto al quadricipite del soggetto e il movimento del soggetto coscia rispetto alla tavola deve essere minimizzata. Assicurarsi che la bobina è saldamente fissato alla gamba del soggetto e che che le cinghie resistivi siano fissati saldamente al tavolo degli esami. Prova questo assicurando che il tallone del soggetto non aumenta più di 5 a. Fuori dal lettino durante la pinneggiata e che non vi è alcuna rotazione della bobina durante l'esercizio.
Acquisizione
Esercizio qualità- Il soggetto deve esercitare per unChieve almeno una deplezione del 30% nel PCr. Per questo protocollo, abbiamo determinato che 30 s di esercizio per i soggetti ambulatoriali e 60 s per i soggetti non deambulanti raggiunge questo obiettivo. Abbiamo osservato che i soggetti non deambulanti esercitano meno forza per calcio e richiedono pertanto un intervallo più lungo per l'esaurimento sufficiente.
Analisi-I metodi descritti qui forniscono una struttura per minimizzare la soggettività e massimizzare l'automazione. Selezione dei parametri di input dell'utente per l'analisi degli spettri dovrebbe essere fatta attenzione al fine di garantire la riproducibilità.
Modifiche e risoluzione dei problemi
Qualità dei allo spettro Se lo spettro appare rumorosa, assicurarsi che la casella di spessore è collocato all'interno del muscolo. Regolare la dimensione e la posizione della casella shim per migliorare il rapporto segnale-rumore. Ripetere l'acquisizione di test come necessario.
in quantolità di Exercise Se i risultati di esercizio iniziali di esaurimento PCr insufficiente, ci sono diverse modifiche che possono essere utilizzati per risolvere i problemi: 1) le cinghie può essere stretto, per aumentare la resistenza; 2) il soggetto può essere istruito per dare il più veloce, il che aumenta lo sforzo; o 3) la durata di esercizio prolungata può essere aumentata. Tuttavia, si noti che l'eccesso di esercizio fisico può portare a pH alterato e potrebbe portare ad acidosi, che può inibire la cinetica di recupero OXPHOS 61. Ciò può essere evitato limitando il tempo di esercizio ad un massimo di 3 min.
LIMITI DELLA TECNICA
Un'analisi biopsia muscolare consente la misurazione delle caratteristiche mitocondriali specifici, quali il contenuto mitocondriale e le dimensioni, così come la massima velocità di sintesi di ATP mitocondriale. Tuttavia, è importante notare che la misurazione in vivo usando 31 PMRS rappresenta un aggregato di questi dimisure rect, oltre a fattori extra-mitocondriale, quali la fornitura microvascolare di sangue ossigenato al muscolo. Così, in situazioni in cui lo stato del microcircolo è in questione a causa della ridotta fornitura di ossigeno o di altri fattori, non sarebbe fornire un indicatore inequivocabile dello stato mitocondriale. Piuttosto, sarebbe indicare lo stato in vivo della massima sintesi di ATP ossidativo del muscolo, che può riflettere una combinazione di OXPHOS e problemi microvascolari.
Una limitazione dell'esercizio di 31 protocollo PMRS dettagliato in questo lavoro è la mancanza di standardizzazione della produzione di lavoro. Questa mancanza di standardizzazione semplifica l'apparato necessario, e quindi l'attuazione del presente protocollo. Tuttavia, va a scapito di non consentire la valutazione quantitativa di altri parametri, quali la resistenza e affaticabilità, e la loro relazione alle misure metaboliche. Di conseguenza, diversi livelli di sforzo potrebbero influire sul PCrtempo di recupero oltre la gravità del difetto mitocondriale sottostante. Si può ridurre al minimo tali effetti e assicurare l'esaurimento PCr sufficiente e può standardizzare ulteriormente l'output lavoro utilizzando ergometri compatibili con MR resistenza regolabile e le uscite di lavoro misurabili.
Importanza della tecnica con rispetto a metodi esistenti o alternativi
La capacità di quantificare direttamente la funzione mitocondriale nel muscolo scheletrico è il principale vantaggio della tecnica 31 PMRS rispetto al test da sforzo metabolico standard. Invasiva biopsia muscolare permette misurazioni in singole fibre 66, anche se con rischi che ne conseguono che lo rendono meno attraente per le indagini che richiedono la valutazione seriale. Approcci basati sulla spettroscopia nel vicino infrarosso 67 possono essere limitati dalla profondità di penetrazione, in particolare nei pazienti obesi, in cui non più di 5 mm di grasso attenua il NIRS signal del 20% 68. Inoltre, la tecnica non si presta alla valutazione multidimensionale del muscolo e altri sistemi offerte dalle tecniche MR-base. Inoltre, a differenza dei metodi invasivi biopsia per quantificare energetica muscolari, questa misura non invasiva e non distruttiva permessi ripetute misure dello stato metabolico nel muscolo intatto, rendendo vantaggioso per la valutazione delle popolazioni soggette ed interventi terapeutici.
Applicazioni future
Le potenziali applicazioni Dopo aver imparato questa tecnica 31 PMRS comprendono la valutazione delle malattie con difetti mitocondriali specifici o qualsiasi di una vasta gamma di disturbi metabolici. In pazienti con gittata cardiaca scarsa, le attuali tecniche possono identificare capacità funzionale ridotta ma non in grado di stabilire il livello al quale si verifica il erettile (ad esempio, il muscolo scheletrico, cuore o polmoni). Sarebbe particolarmenteinteressante da sviluppare protocolli integrati che combinano 31 PMRS con misure metaboliche e saggi cardiopolmonari per identificare le cause della ridotta capacità specifiche del soggetto al fine di agevolare le terapie personalizzate.
Abbiamo esempi dettagliati di importanti terapie e interventi mirati che potrebbero trarre beneficio dall'utilizzo di marcatori in vivo della funzione mitocondriale. Un standardizzato 31 PMRS protocollo di esercizio, come quello citati in precedenza, è un passo importante per un uso più diffuso di questa importante dentro vivo del muscolo scheletrico capacità mitocondriale in entrambi gli studi di base e di intervento.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 T MR Scanner | Siemens | manufacturer will not affect results | |
| 10 cm 31P transmit-receive coil, 1.5T compatible | PulseTeq | manufacturer will not affect results | |
| 3 fl oz Baby Oil | Johnson & Johnson | manufacturer will not affect results | |
| Foam triangle cushion (Knee) | Siemens | manufacturer will not affect results | |
| (3) plastic buckle resistive straps; table to table | Siemens | manufacturer will not affect results | |
| (1) plastic buckle resistive strap; self-connecting | Siemens |
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