Summary

Hücre Lineage belirteçlerinin Eş-lokalizasyonu ve Domates Sinyali

Published: December 28, 2016
doi:

Summary

Immünofloresan ile (osteoblastlar özgü) 2.3Col1a1-GFP ile diğeri (kemik hücrelere özgü): İki / Cre fareler (özellikle kondrosit olarak ifade edilmiştir) (her yerde her zaman bütün hücrelerde ifade edilmiştir) Rosa26 tdTomato kombinasyonları izleme grupları geliştirdi. veri kemik hücrelerine kondrosit doğrudan dönüşümünü göstermektedir.

Abstract

Hücre soyu izleme sistemi gelişim biyolojisi çalışmalarında ağırlıklı olarak kullanılmıştır. Cre rekombinazın kullanımı belirli bir hücre çizgisi ve döl muhabir aktivasyonu için izin verir. Burada, kondrositler doğrudan uzun kemik ve Cre, Col10a1-Cre ve Agrekanın-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2) iki çeşit kullanarak mandibular kondil gelişimi sırasında osteoblast ve osteositleri dönüşme olduğunu göstermek için teknik izleme hücre soyu kullanılan Rosa26 ile geçti tdTomato. Col10 ve Agrekanın Hem kondrositlerin için belirteçleri iyi tanınmaktadır.

Bu temelde, belirli hücre belirteçleri ifadesini analiz ederek floresan immünohistokimya-tanımlamak hücre kaderi ile birlikte izleme yeni bir yöntem hücre soyu geliştirdi. Runx2 (erken evre osteojenik hücreler için bir işaret) ve dentin matrisi protein1 (DMP1ve, geç evre osteojenik hücreler için bir işaret) idikondrosit türetilmiş kemik hücreleri ve bunların farklılaşma durumunu tanımlamak için kullanılan. Bu kombinasyon, hücre soyu izleme uygulaması genişletir, ama aynı zamanda bileşik farelerin nesil kolaylaştırır sadece. Daha da önemlisi, ana hücre döl sayısı, yeri ve farklılaşma durumları yalnız izleme hücre soyu daha fazla bilgi sağlayan, aynı anda görüntülenir. Sonuç olarak, hücre soyu takip teknikleri ve immünofloresan birlikte uygulamaya in vivo olarak, hücre biyolojisi araştırmak için güçlü bir araçtır.

Introduction

gelişimi sırasında, endokondral kemik oluşumu iskelet hacmi% 80'inden sorumludur. Yaygın olarak hipertrofik kondrositlerin apoptozu ile başlar inanılmaktadır. Daha sonra, altta yatan kemik iliği hücreleri istila ve kemik iliği ve periost kökenli hücreler 1,2 yeni kemik birikimi ile takip anjiyogenezi başlatmak. Hipertrofik kondrositlerin hücre kaderi (HC), ancak, yıllardır 3 tartışma konusu olmuştur. Başlangıçta, HCS kondrosit farklılaşması yolunun sonu olarak kabul edildi ve apoptoz genellikle HCS nihai kaderi olduğu düşünülmüştür. Şimdi, bazı araştırmacılar en azından bazı HCS hayatta olabilir ve endokondral kemik oluşumuna katkıda bulunduğunu göstermektedir. O büyümeyi önerdi rağmen plaka kondrositler ultrastrüktürdeki, immünohistokimyasal dayalı osteoblast içine transdifferentiate yeteneği vardı ve in vitro, 46 bu yöntemlerin w hiçbiri çalışmalarıosteoblast soy kondrosit katkı gösteren kesin ere.

Hücre soyu izleme tekniği hücre kaderi incelemek için daha titiz bir yol sağlar. Kısaca söylemek gerekirse, sadece spesifik bir hücre türü ifade edilen bir yeniden bağlayıcı enzim, bildirici genin ekspresyonunu uyarır. Bu şekilde, bu hücrenin tipi ve onların soyundan kalıcı 7 etiketlenir. Cre-loxP sistemi yaygın soy izleme kullanılır. Cre (rekombinaz enzim) iki loxP siteleri arasında DUR dizisi tüketim ve belirli bir hücre hattı (Şekil 1A) 'de muhabir aktive eder. Bazı durumlarda, araştırmacı, östrojen reseptörü (Cre ERT2) 8 modifiye edilmiş bir formu kaynaşmaya Cre neden tamoksifen gibi bir ilaç ile Cre aktif hale getirmek için uygun bir zaman noktası seçebilir. Floresan gazeteciler onlar dramatik karmaşıklığını azaltmak için deneyler izleme soy standart haline gelmiştirve 8,9 izleme hücre kaderinin doğruluğunu ve verimliliğini artırmak. bunun kolayca 7 (Şekil 1A) görüntülenmiştir yapma, parlak floresan proteini ve güçlü Epifloresans beri tdTomato floresan gazetecilere arasında en iyi seçenek haline geliyor.

Sistem izleme Rosa26 tdTomato soy kullanarak, grubumuz ve diğer araştırmacılar HCS gelişimi 10-14 esnasında kemik hücreleri içine fenotip değiştirebilir göstermiştir. 2.3Col1a1-GFP (osteoblastlar özgü) ile bağışıklık fluorışıması (kemik hücrelere özgü): Bunu yapmak için, Rosa26 tdTomato (her yerde ifade, tüm hücrelerde) / Cre (kondrosit özgü) fareler ile kombinasyonlar izleme iki set geliştirdi. Veri iki yolun in vivo hücre kaderine çalışma uygulanabilir yollar olduğunu göstermektedir.

Protocol

Tüm protokoller gözden ve Teksas A & Diş Hekimliği M University College'da Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Hayvan Yetiştiriciliği Bu çalışmada, üç hayvan modelleri kullanarak. İlk kullanım Col10a1-CRE 15 fareler kondil oluşumunda embriyonik kondrositlerin kaderi araştırmak ve Rosa26 tdTomato onları geçmeye (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor tm9 (CAG-tdTomato) H…

Representative Results

Kondrositler Doğrudan mandibular ve Uzun Kemik Kemik Hücrelerinin (Osteobalstlar ve osteositlerde) içine Transform. Agrekan, kondrojenez için kritik bir geni, ağırlıklı olarak, erken ve olgun kondrositler 18 olarak ifade edilir. Bunun bir sonucu olarak, Agg-Cre ERT2 bölgesindeki 2 haftalık tamoksifen enjeksiyonu; Rosa26 tdTomato fareler tüm…

Discussion

Teknolojik sınırlamalar nedeniyle, in vivo hücre davranışlarını araştırmak için her zaman zordur. Ancak, hücre soyu izleme tekniği hücre biyolojisi 7-9 çalışmak için güçlü bir araç olduğunu gösteriyor. Bu çalışmada, biz daha fazla immünofloresan ile birleştirerek bu protokolü geliştirmek. Bu şekilde, hücre kaderi soyu izleme uygulaması genişletmektedir birden çok ilişkili markörler tarafından tanımlanabilir. Ayrıca, immünofloresan ve domates sinyalinin bu co-l…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was supported by NIH grant DE025014 to JQF.

Materials

Tamoxifen  Sigma T5648 activate the Cre event 
Paraformaldehyde Sigma  P6148 fix the sample
Ethylenediaminetetraacetic acid Alfa Aesar A10713 decalcify the hard tissue
Sucrose  Sigma S0389 dehydrate the tissue
Hyaluronidase from bovine testes  Sigma H4272 retrieve antigen for immunochemical staining
Bovine serum albumin Sigma  A3059 blocking solution 
primary antibody for Runx2  Cell Signal D1L7F primary antibody for immunochemical staining
primary antibody for DMP1 provided by Dr. Chunlin Qin primary antibody for immunochemical staining
anti-rabbit IgG Sigma 18140 control for immunochemical staining
secondary antibody  Invitrogen A11008 second antibody for immunochemical staining
OCT Tissue-Tek 4583 embed the sample for frozen section
Tween 20 Fisher Scientific BP337 PBST
non-fluorescing antifade mountant Life technologies P36934 mounting slides
DAPI Life technologies P36931 nuclear staining
Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories circle the section on the slide for for immunochemical staining 
Xylazine AnaSed anesthetization 
Ketaset  Zoetis anesthetization 
cryosection machine Leica CM1860 UV
confocal microscope Leica DM6000 CFS 

References

  1. Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
  2. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
  3. Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).
  4. Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
  5. Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).
  6. Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).
  7. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).
  8. Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. Lineage-tracing methods and the kidney. Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).
  9. Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).
  10. Yang, G., et al. Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes. Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).
  11. Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).
  12. Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).
  13. Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10 (12), (2014).
  14. Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).
  15. Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).
  16. Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31 (6), 654-660 (2002).
  17. Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).
  18. Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).
  19. Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
  20. Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse?. Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).
  21. Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension?. Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).
  22. Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).
  23. Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).
  24. Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).
  25. Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
  26. Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).
  27. Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
  28. Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).
  29. Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).

Play Video

Cite This Article
Jing, Y., Hinton, R. J., Chan, K. S., Feng, J. Q. Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal. J. Vis. Exp. (118), e54982, doi:10.3791/54982 (2016).

View Video