Introduction
קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן כבר, ותמשיך להיות, טכניקה חזקה מאוד להבין את אופי האינטראקציות קולטן ליגנד. עצם העובדה שאנו רואים את יחסי הגומלין הללו בפירוט אטומי, לא רק שזה אפשרי לגלות את המנגנונים המולקולריים השולטים בתהליכים ביולוגיים רבים, אבל אפשר גם לשנות ממשקי מגע ישיר לטובת הטיפול. יחד עם טכניקות כגון תהודה plasmon פני השטח calorimetry טיטרציה בידוד תרמי (אם להזכיר רק כמה), שינויים כאלה לאחר מכן ניתן לנתח biophysically להעריך את ההשפעה הישירה על זיקה מחייבת, קינטיקה אינטראקציה, התרמודינמיקה. לבסוף, על ידי ביצוע ניסויים תפקודיים על סוגי תא רלוונטיים, תמונה מפורטת של ההשפעה המולקולרית ופונקציונלית של שינויי האינטראקציות ליגנד רצפטור ניתן לדלות, מתן מידע מכניסטית ספציפי מאוד. בסך הכל, אלו סוגים של שיטות לספק תמונה ברזולוציה אטומית המאפשרת להרתיע mination של איך ביולוגי מערכות לעבוד, עם השלכות דיילת התקדמויות אבחון וטיפול.
המעבדה שלנו שגרתי משתמשת בטכניקות הללו כדי ללמוד את קולטנים אשר מתווכים חסינות תאי T אנושיים לפתוגנים וסרטן, למחלות אוטואימוניות, ובמהלך ההשתלה. כאן, אנו מתמקדים בתגובה CD8 + T-cell האדם לסרטן, בתיווכו של אינטראקציה בין רצפטור תאי T (TCR) ו אנטיגן לויקוציטים אנושיים (HLA) פפטידים -restricted הנגזרות הגידול (pHLA). זה חשוב כי, אם כי תאי CD8 + T מסוגלים למקד תאים סרטניים, אנו ואחרים הראו בעבר כי TCRs נגד הסרטן להיקשר תת-אופטימלית כדי pHLA 1 מאותו המקור שלהם, 2. לפיכך, במעבדות רבות ניסו לשנות גם את 3 TCR, 4, 5 או ליגנד פפטיד 6,class = "Xref"> 7, 8 על מנת להגדיל immunogenicity ו לתאי סרטן מטרה טובה יותר. עם זאת, גישות אלה אינן תמיד יעילות יכולות להיות תופעות לוואי חמורות, כולל רעילות מחוץ היעד 4, 9, 10. מחקר נוסף לחקור את המנגנונים המולקולריים השולטים הכרה תא T של אנטיגנים סרטניים יהיה חיוני להתגבר הגירעונות הללו.
במחקר הנוכחי, התמקדנו התגובות נגד תאים מלנומה עצמיים על ידי תאי CD8 + T ספציפיים עבור שבר של אנטיגן מלנוציט בידול גליקופרוטאין 100 (gp100), gp100 280-288, שהציגו HLA-A * 0201 (הנפוץ ביותר אני אדם pHLA בכיתה -expressed). אנטיגן זה כבר מטרה למדה נרחב עבור חיסונים מלנומה פותח פפטיד שנקרא "heteroclitic" שבו ולין מחליף אלאניןעוגן בעמדה 9 כדי לשפר את יציבות pHLA 11. גישה זו הייתה לשמש כדי לשפר את הגיוס של תאי-ההרג תגובתי מלנומה במבחנה שמשה בהצלחה בניסויים קליניים 12. עם זאת, שינויי שאריות פפטיד יכולים להיות השפעות בלתי צפויות על סגוליות תאי T, שהפגינו את היעילות הירודה של רוב פפטידים heterolitic במרפאת 6, 13. ואכן, עוד טופס heteroclitic של gp100 280-288, שבו שאריות פפטיד Glu3 הוחלף עבור עלא, ביטל הכרה על ידי האוכלוסייה polyclonal של gp100 280-288 תאים -specific T 14, 15. אנחנו הוכחנו בעבר כי אפילו שינויים קלים שאריות עוגנות פפטיד יכולים לשנות T-cell הכרה משמעותי בדרכים בלתי צפויות 6, 16. לפיכך, המחקר התמקד לבנותing תמונה מפורטת יותר של אופן שבו תאי CD8 + T מכירים gp100 וכיצד שינויים של האינטראקציה בין TCRs ו pHLA יכול להשפיע בפונקציה זו.
הנה, אנחנו שנוצרנו מאוד טהורות, צורות מסיסות של שתי TCRs הספציפית gp100 280-288 שהציג HLA-A * 0201 (A2-YLE), כמו גם צורות הטבעיות ושינה של pHLA. ריאגנטים אלה שמשו להפקת גבישי חלבון כדי לפתור את המבנה האטומי המשולש של TCR אדם מורכב עם טופס heteroclitic של A2-YLE, וכן השנייה של pHLAs המוטציה בצורת unligated. לאחר מכן השתמשו בגישת סריקת פפטיד כדי להדגים את ההשפעה של החלפות פפטיד על TCRs ידי ביצוע מעמיק ניסויי biophysical. לבסוף, שעוררנו קו מהונדס גנטי CD8 + T-cell, ישכתב להביע אחד TCRs A2-YLE הספציפי, על מנת לבצע ניסויים תפקודיים כדי לבדוק את ההשפעה הביולוגית של השינויים פפטיד השונים. נתונים אלה מראים כי אפילו מודיםfications כדי פפטיד שאריות כי הם מחוץ מוטיב מחייב TCR יכול להיות עקום על בלתי צפויות השפעות על שאריות פפטיד סמוכים לבטל TCR מחייב והכרה T-cell. הממצאים שלנו מייצגים את הדוגמא הראשונה של המנגנונים המבניים שבבסיס הכרה תא T של מטרה הטיפולית חשובה זו למלנומה.
Protocol
1. ביטוי חלבון
- הפוך בונה גן לייצור המסיס TCRs ו pHLAs, כמתואר בפירוט בעבר 17, 18. לעצב כל לבנות עם 'BamH1 וכן 3' 5 אתר EcoR1 הגבלה להכנסה לתוך וקטור pGMT7.
- Transform E. coli רוזטה (DE3) pLysS עם וקטור הפלסמיד הנגזרות pGMT7 המכיל את רצף המקודד את החלבון של הריבית על ידי דוגרים 1 μL של 50-200 ng / פלסמיד μL עם 5 μL של E.coli במשך 5 דקות ב 4 ° C , 2 דקות ב 42 מעלות צלזיוס, 5 דקות ב 4 ° C, ואת הצלחת החוצה לילה בשעה 37 ° C על צלחת אגר LB בתוספת 50 מ"ג / L carbenicillin.
- פיק מושבות הפרט לגדול ב 37 מעלות צלזיוס, 220 סל"ד ב 30 מ"ל של התקשורת TYP (tryptone 16 גר '/ ל, 16 גר' / ל תמצית שמרים, ו -5 גר '/ ל HK 2 O 4) בתוספת 100 מיקרומטר carbenicillin עד ההשעיה מגיע דה אופטיnsity (OD 600) של בין 0.4 ו -0.6.
- להשרות ייצור החלבון aliquot 5 מ"ל על ידי החדרת 0.5 מ"מ איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) למשך 3 שעות. שמור 20 μL של ההשעיה עם ובלי אינדוקציה עבור ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן ניתוח (SDS-PAGE) ו להכתים את הג'ל.
- להוסיף תרבויות המתנע עד 1 ליטר של TYP בתוספת 100 מיקרומטר carbenicillin ולגדול תאים כמתואר לעיל בשלב 1.3 עד ההשעיה מגיע OD 600 בין 0.4 ו -0.6.
- להשרות ביטוי חלבון במשך 3 שעות עם 0.5 מ"מ IPTG. צנטריפוגה התאים במשך 20 דקות ב 3000 XG ויוצקים את supernatant בזהירות.
- ממיסים את גלולה ב 40 מ"ל של חיץ תמוגה (10 מ"מ טריס, pH 8.1; 10 מגנזיום כלוריד מ"מ, MgCl 2; 150 מ"מ NaCl; ו -10% גליצרול), sonicate על קרח למשך 30 דקות בהספק 60% בהתבסס על רווח של 2 , ו דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות עם 0.1 g / L DNase.
- פנקו את susפנסיה המכיל חלבונים בצורת גופים הכללה (IB) עם 100 מ"ל של חיץ לשטוף (0.5% טריטון X-100; 50 מ"מ טריס, pH 8.1; 100 mM NaCl ו -10 מ"מ EDTA).
- צנטריפוגה מדגם במשך 20 דקות ב 4 ° C ו- 8,000 XG ויוצקים את supernatant בזהירות. Re- להשעות גלולה ב 100 מ"ל של חיץ מחדש ההשעיה (50 מ"מ טריס, pH 8.1; 100 mM NaCl ו -10 מ"מ EDTA, pH 8.1), צנטריפוגות כמו קודם ב 8000 XG, ויוצקים את supernatant בזהירות.
- לבסוף, לפזר את גלולה ב 10 מ"ל של חיץ guanidine (6 M guanidine; 50 מ"מ טריס, pH 8.1; 2 מ"מ EDTA, pH 8.1; ו 100 מ"מ NaCl) ולמדוד את ריכוז החלבון ב 280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
2. pHLA ו TCR refolding
- עבור מקפלת pHLA, לערבב 30 מ"ג של HLA-A2 (או HLA-A2 עם תג ביוטין) IBS, 30 מ"ג של β2m IBS, ו -4 מ"ג של פפטיד למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים בנפח סופי של 6 מ"ל של חיץ guanidine בתוספת 10 מ"מ dithiothreitol(DTT).
- ליזום חלבון refolding ידי דילול תערובת הקודם 1 ליטר של חיץ ולקפל HLA מראש צונן (50 מ"מ טריס, pH 8.1, 400 מ"מ L- ארגינין; 2 מ"מ EDTA, pH 8.1; 6 מ"מ cysteamine; ו -4 מ"מ cystamine).
- השאירו את HLA ולקפל ערבוב על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות ולאחר מכן להעביר אותו לתוך 12.4 kDa MWCO (משקל מולקולרי חתוכים) צינור דיאליזה דיאליזה פעמיים במשך 24 שעות נגד 20 L של 10 מ"מ טריס, pH 8.1.
- עבור מקפלת TCR, לערבב 30 מ"ג של שרשרת α TCR IBS ו -30 מ"ג של שרשרת TCR β IBS במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים ב 6 מ"ל של חיץ guanidine בתוספת 10 מ"מ DTT.
- ליזום refolding חלבון על ידי דילול התערובת TCR מפוגל ב 1 ליטר של חיץ ולקפל TCR מראש צונן (50 מ"מ טריס, pH 8.1, 2.5 M אוריאה; 2 EDTA מ"מ, pH 8.1; 6 cysteamine מ"מ; ו -4 מ"מ cystamine) עבור 3 ח.
- מעבירים את ולקפל לתוך צינור דיאליזה 12.4-kDa MWCO ו dialyze פעמיים במשך 24 שעות נגד 20 L של 10 מ"מ טריס, 8.1 pH.
- סנן הוא pHLA או נ"צ TCRבני באמצעות מסנן הממברנה 0.45 מיקרומטר עבור השלבים לטיהור.
3. טיהור ידי כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר (FPLC)
- טען את הכנת ולקפל מסוננים (או pHLA או TCR) על טור שרף חילוף 7.9 מ"ל, 50 מיקרומטר אניון מראש equilibrated עם 20 מ"ל של 10 מ"מ טריס, pH 8.1 על מערכת כרומטוגרפיה גמיש ואינטואיטיבי.
- Elute החלבון ב 5 מ"ל / דקה עם שיפוע מלח (0-500 מ"מ NaCl ב 10 מ"מ טריס, pH 8.1, מעל 8 כרכים עמודה) ולאסוף שברים 1 מ"ל.
- לנתח את השברים המתאים החלבון של עניין על ידי SDS-PAGE, בריכת שברים המכיל את החלבון של עניין יחד, ולרכז אותם למטה כדי 500 μL עם 10 kDa MWCO 20 או 10 kDa MWCO 4 על ידי צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 4000 XG , השליך את הזרימה דרך.
- טען את הכנות חלבון המרוכזות ללולאת הזרקת מיליליטר 2 על עמודת כרומטוגרפיה הדרת גודל 24 מיליליטר מראש equilibrated עם האפליקציהחיץ elution ropriate: בופר פוספט (PBS), HBS (10 HEPES מ"מ, pH 7.4; 150 מ"מ NaCl; 3.4 mM EDTA; ו 0.005 פעילי שטח%), או חיץ קריסטל (10 מ"מ טריס, pH 8.1, ו -10 מ"מ NaCl ).
- Elute החלבונים בקצב זרימה של 0.5 mL / min מעל 1 נפח הטור; לאסוף 1 שברים מ"ל המכיל את החלבון של עניין מאומת על ידי SDS-PAGE.
הערה: שיטות אלה שימשו להפקת TCRs PMEL17 TCR ו gp100 מסיסים, כמו גם את כל pHLAs השתמשו במחקר זה: HLA-A * 0201 עם YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 7A), או YLEPGPVAA (A2-YLE-8A).
ניתוח 4. Surface Plasmon תהודה (SPR)
- ביצוע ניתוח מחייב שיווי משקל או ניתוח תרמודינמי באמצעות מערכת ניתוח אינטראקציה מולקולרית מצויד בשבב חיישן CM5 19.
- הפעל את שבב CM5 ידי fגועות של 1: תערובת 1 של 100 מ"מ N-hydroxysuccinimide (NHS) ו -400 מ"מ 1-אתיל-3- (3-dimethylpropyl) -carboiimide (EDC) במשך 10 דקות בקצב זרימה של 10 μL / דקה ב -25 ° ג
- כ טען 5,000 יחידות התגובה (RU) של streptavidin (110 μL של 200 מיקרוגרם / מ"ל אצטט 10 מ"מ, 4.5 pH) על ידי קוולנטיים המקשר אל פני השטח שבב בכל ארבעת זרימה תאים ולהשתמש 100 μL של 1 M hydrochloride ethanolamine לנטרל באף אחת מקבוצות תגובתי נותרים.
- הזוג כ 500-600 RU של pHLA, ב ~ 1 מיקרומטר חיץ מסחרי (המסופק על ידי היצרן), לשבב חיישן CM5 בכל בספיקה איטית של 10 μL / דקה כדי להבטיח פיזור אחיד על פני השבב.
- להרוות את פני השבב עם 1 ביוטין מ"מ במאגר מסחרי (המסופקים על ידי היצרן) עבור 60 s.
- להזריק עשרה דילולי סדרה של TCRs המסיס רחב תא הזרימה הרלבנטיים בספיקה גבוהה של 30 μL / דקות ב 25 מעלות צלזיוס.
- חשב את קבוע מחייב שיווי משקל(K D (E)) ערכים באמצעות התאמת עקומה ליניארית (y = (P1x) / (P2 + x)) 20.
הערה: יחידות y = תגובה, x = ריכוז אנליסט, מקסימום P1 = r, P2 = K D. - ביצוע ניתוח קינטיקה בהנחה 1: לאנגמיור 1 מחייב להתאים את הנתונים באמצעות אלגוריתם גלובלי-fit בחבילת התוכנה 2.
- בצע ניסויי תרמודינאמיקה על ידי חזרה על שיטה זו בטמפרטורה הבאה: 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C, 30 ° C 19.
- השתמש ערכי D K נקבע על ידי SPR בטמפרטורות שונות לחשב ΔG ° באמצעות המשוואה התרמודינמית סטנדרטי (ΔG ° = -RTlnK D) 19.
הערה: R = גז קבוע, T = טמפרטורת K, ln = לוג טבעי. - חשב את הפרמטרים התרמודינמית פי המשוואה גיבס-הלמהולץ (ΔG ° = ΔH - TΔS °) 19. מגרש את האנרגיות חינם מחייב, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK D), כנגד הטמפרטורה (K) באמצעות רגרסיה ליניארית כדי להתאים את המשוואה שלוש פרמטר (y = ΔH + ΔCp * (x-298) -x * ΔS- x * ΔCp * ln (x / 298)) 19.
הערה: y = הטמפרטורה K, x = ΔG °.
5. Calorimetry טיטרציה איזו תרמים (ITC)
- בצע ניסויים ITC באמצעות קלורימטר טיטרציה בידוד תרמי. להזריק 30 מיקרומטר pHLA לתוך התא קלורימטר והעומס 210 מיקרומטר מסיסים TCR לתוך המזרק. השתמש התנאים חיץ הבאים: 20 מ"מ Hepes (pH 7.4) המכיל 150 mM NaCl.
- בצעו 20 זריקות TCR, כל אחד בנפח 2 μL. לחשב ΔH ו- K D באמצעות תוכנת ניתוח.
6. התגבשות, איסוף נתוני השתברות, ואת דגם חידוד
- בצע ניסויי התגבשות באמצעות רובוט התגבשות.
- לגדול גבישים ידי VAPאו דיפוזיה על 18 מעלות צלזיוס באמצעות טכניקת הירידה יושבת בצלחת 96-היטב עם מאגר המכיל 60 μL של חיץ התגבשות (לייקר אמא) 21.
- לרכז את pHLA המסיס לכ -10 מ"ג / מיליליטר (0.2 מ"מ) במאגר קריסטל על ידי ספינינג ב 3000 XG ב concentrator צנטריפוגלי מולקולרי 10-kDa משקל חתוך.
- עבור המבנים שיתוף מורכבים, לערבב את TCR ו pHLA ביחס של 1: 1 יחס טוחנת כדי להשיג פתרון חלבון כ 10 מ"ג / מ"ל (0.1 מ"מ).
- הוספת 200 nL של pHLA לבד, או 1: תערובת יחס טוחנת 1 של TCR ו pHLA, 200 nL של כל פתרון מאגר ממסך ההתגבשות באמצעות רובוט התגבשות וציון עבור גבישים תחת מיקרוסקופ לאחר 24 שעות, 48 שעות, 72 h, ולאחר מכן פעם בשבוע.
- גבישים יחידים קציר ידי מקבע אותם באופן ידני קריו-לולאות תחת מיקרוסקופ קריו-לקרר אותם על ידי השריית ואחסונם בחנקן נוזלי (100 K).
הערה: גבישים טוענים לוקח קצת pracטייס, והחלטה אשר גבישים הם טובים מספיק עבור איסוף נתונים בא עם הניסיון. ככלל אצבע, הגדול יותר קבוע גביש, כן ייטב. - אסוף נתונים זרם של גז חנקן ב 100 K.
הערה: נתונים אלה נרכשו על מקור אור היהלום (DLS) המתקן הלאומי למדע סינכרוטרון בבריטניה. - לנתח את הנתונים על ידי אומדן עוצמות השתקפות עם xia2 הן באמצעות 22 MOSFLM ואת XDS חבילות 23, ולאחר מכן קנה המידה של נתונים עם SCALA או ללא מטרה 24 ואת חבילת CCP4 25.
- לפתור את המבנים עם החלפה מולקולרית באמצעות PHASER 26.
- התאם את המודל עם קרסול 27 ולשכלל את המודל עם REFMAC5 28.
- כן ייצוגים גראפיים עם PyMOL 29.
- חשב את המגעים באמצעות "צור קשר"תכנית בחבילת CCP4. השתמש חתוך 4 עבור אנשי קשר ואן דר ואלס ו 3.4 Å חתוכים לאג"ח מימן וגשרי מלח.
- חישוב השלמת שטח באמצעות התכנית "SC" בחבילת CCP4.
- חשב את זווית המעבר של המתחם TCR-pHLA, כמתואר 30.
הערה: במחקר זה, הנתונים השתקפות קואורדינטות המודל הסופי הופקדו עם מסד הנתונים PDB (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-YLE-3A PDB: 5EU4, ו- A2 PDB -YLE-5A: 5EU5).
Representative Results
באמצעות השיטות שתוארו לעיל, שעוררנו מסיסים TCR (טבלה 1) ומולקולות pHLA לנהל מעמיק בניתוחים מולקולריים של הכרה gp100 280-288 ידי תאי CD8 + T. מערכת ביטוי החיידק שונה שימש ליצור IBS מסיס לכל שרשרת נפרדת של שני TCRs (שרשראות α ו β) ו pHLAs (שרשרת α ו β2m). שיטה זו יש את היתרון של להיות זול יחסית וקל להקים ומייצרת תשואות גדולות של חלבון (100-500 מ"ג / L של תרבות). כמו כן, החלבונים המסיסים הם יציבים מאוד אם מאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השתמשו בטכניקת refolding וטיהור ומבוססת לייצר חלבונים פונקציונליים, הומוגנית, מסיסים. שיטה זו שימושית ליצירת חלבונים לניסויי biophysical, מבניים והמכשירים סלולריים, כמו גם חומרים כימיים שיכול לשמש לאבחון או רפוי.
-together.within-page = "1"> כאן, השתמשתי חלבונים אלה לבצע ניסויי mutagenesis סריקת אלאנין פני עמוד השדרה פפטיד ומוערך TCR מחייב זיקה באמצעות תהודת plasmon פני השטח (SPR) ניסויים (טבלה 2). assay זה הוכיח בו שאריות של פפטיד היו חשוב ביותר לכריכת TCR. ברזולוציה גבוהה המנתח של זיקות מחייבות שימוש בטכניקה זו הוא מאוד שימושי לקביעת מנגנונים ביולוגיים השולטים אינטראקציות חלבונים, כמו גם לניתוח הזיקה המחייבת של מולקולות טיפוליות.
לאחר מכן, אנו גבשנו TCR המסיס ספציפי מלנומה (PMEL17 TCR) בקומפלקס עם שונה גידול נגזר pHLA (A2-YLE-9V) כדי לחקור את המצב המחייב ברזולוציה אטומית (איורים 1 ו -2 ולוח 3). ניסויים אלה מספקים ראיה ישירה של הממשק המחייב בין שתי מולקולות, providinמידע מפתח g על העקרונות שבבסיס המסדירים את האינטראקציה. בנוסף, אנו ערכנו ניתוח תרמודינמי של האינטראקציה היא באמצעות SPR ו- ITC, חושף את התרומות האנרגטיות שאפשרו מחייב (איורים 3). ניתוחים אלה נתמכו עוד יותר על ידי תיאור ברזולוציה גבוהה של טביעת רגל הקשר בין שני החלבונים (איור 4 ולוח 4).
לאחר מכן, אנו לפתור את המבנים של מולקולות pHLA unligated, הצגת טפסי מוטציה של הפפטיד, חושפים כי מתג מולקולרי יכול להסביר מדוע מוטציות מסוימות בטלו TCR מחייב (איורים 5).
בסך הכל, טכניקות אלה סיפקו נתונים חדשים להדגים את מנגנון המסביר כיצד תאי T מזהים אנטיגן נגזר מלנומה כי הוא מטרה חשובה עבור תרופות נגד סרטן. במובן רחב יותר, טכניקות אלהיכול לשמש כדי לחקור כל אינטראקצית קולטן ליגנד כמעט, בחשיפת מנגנונים ביולוגיים חדשים שעשויים להיות ממוקד עבור מקדמות טיפוליות חדשניות.
איור 1: ניתוח חלקת צפיפות. התוכניות בעמודה השמאליות להשמיט מפות, בה נראית הדוגמנית הייתה מעודנת בהעדר הפפטיד. צפיפות הבדל היא קווים מתארת על 3.0 סיגמא, קווי מתאר חיוביים מוצגים ירוקים, וקווי מתאר שלילי הם אדומים. העמודה הימנית מציגה את המפה שנצפתה 1.0 סיגמא (כפי שמוצגת רשת אפורה סביב ייצוגים מקלים של שרשרות החלבון) לאחר עידון עוקב באמצעות מעצורי סימטריה בלתי crystallographic אוטומטיים מיושמים על ידי REFMAC5. (א) מודל PMEL17 TCR-A2-YLE-9V עם CDR3 TCR לולאות בצבע כחול (שרשרת α) וכתום (שרשרת β) ואת פפטיד בירוק. (ב) מודל A2-YLE עםהפפטיד בצבע ירוק כהה. (ג) מודל A2-YLE-3A עם כתום פפטיד צבעוני (עבור A2-YLE-3A, היו 2 מולקולות ביחידה סימטרית, אך אלה היו כמעט זהים מבחינת מפות להשמיט וצפיפות, כך שרק להעתיק 1 מוצג כאן). (ד) מודל A2-YLE-5A עם ורוד צבעוני פפטיד. הודפס מחדש באישור בהפניה 31. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: מבט כולל של TCR PMEL17 בקומפלקס עם A2-YLE-9V. (א) ייצוג קריקטורה של המתחם PMEL17 TCR-A2-YLE-9V. TCR הוא בצבע שחור; לולאות TCR CDR מוצגים (אדום, CDR1α; ירוק כהה, CDR2α; כחול, CDR3α; צהוב, CDR1β; אקווה, CDR2 ^6 ;; כתום, CDR3β); ואת-A HLA * 0201 מתואר באפור. הפפטיד YLE-9V מיוצג על ידי מקלות ירוקים. (ב) שטח ולתקוע ייצוגים של שאריות של CDR PMEL17 TCR לולאות (בצבעים כמו א) כי קשר עם משטח A2-YLE (A2, אפור; YLE-9V, מקלות ירוקים). הקו האלכסוני השחור מציין את זווית המעבר של TCR ביחס לציר הארוך של הפפטיד YLEPGPVTV (46.15 °). (C) טביעת רגל לתקשר של TCR PMEL17 על משטח A2-YLE-9V (A2, אפור); סגול וירוק (משטח ומקלות) מצביעים על-A HLA * 0201 ושאריות YLE, בהתאמה, פונה על ידי TCR gp100. Cut-off של 3.4 Å לאג"ח מימן 4 עבור אנשי קשר ואן דר ואלס. הודפס מחדש באישור ההפניה 31. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: ניתוח תרמודינמיים של PMEL17 אינטראקציה TCR-A2-YLE. (א) שיווי משקל מחייב PMEL17 TCR התגובות A2-YLE ב 5, 12, 18, 25, ו -37 מעלות צלזיוס על פני תשעה לעשרה דילולים סדרתי TCR. נתונים גולמיים מצויד SPR (בהנחה 1: 1 לאנגמיור מחייב) מוצגים הבלעה של כל עקומה ושימשו לחישוב K על ו- K את הערכים באמצעות אלגוריתם גלובלי-fit (BIAevaluation 3.1). הטבלה מציגה שיווי משקל מחייב (K D (E)) וקבועים הקינטית מחייב (K D (K) = K off / K on) בכל טמפרטורה. שיווי המשקל מחייב קבוע (K D, מיקרומטר) ערכים חושבו באמצעות התאמה ליניארית (y = (P1x) / (P2 + x)). (ב) הפרמטרים התרמודינמית חושבו על פי המשוואה גיבס-הלמהולץ (ΔG ° = ΔH ° - TΔS °). אנרגיות חינם מחייבות, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK D), היו זממו נגד טמפרטורה (K) באמצעות רגרסיה ליניארית כדי להתאים את המשוואה שלוש פרמטר (y = ΔH ° + ΔCp ° * (x-298) -x * ΔS ° -x * ΔCp ° * ln (x / 298)). אנתלפיה (ΔH °) ואנטרופיה (TΔS °), בעמ '298 K (25 מעלות צלזיוס) מוצגים קלוריות / mol ו חושבו על ידי רגרסיה שאינו ליניארי של הטמפרטורה (K) זממו נגד אנרגיה חופשית (ΔG °). (C) טיטרציה קלוריות איזו תרמים (ITC) מדידות לאינטראקציה PMEL17 TCR-A2-YLE. אנתלפיה (ΔH °) ואנטרופיה (TΔS °), בעמ '298 K (25 מעלות צלזיוס) מוצגים קלוריות / mol. הודפס מחדש באישור בהפניה 31. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: השוואה קונפורמציה של YLE, YLE-3A, ו- A2-YLE-5A פפטידים מוגש ע"י HLA-A * 0201. (א) YLE (מקלות ירוקים כהים) ו YLE-3A (ומקלוני) יישור פפטיד על ידי החפיפה של HLA-A * סליל α1 0201 (קריקטורה אפורה). שאריות ארוזות מצביעים על מוטציה של Glu3 לתוך אלאנין. את ריבועי להראות כיצד החלפת Glu3Ala גורמת לשינוי בעמדה (חץ שחור) של Pro4 שאריות שכן במבנה A2-YLE-3A לעומת מבנה A2-YLE. (ב) YLE (מקלות ירוקים כהים) ו YLE-5A (מקלות ורודים) יישור פפטיד על ידי החפיפה של HLA-A * סליל α1 0201 (קריקטורה אפורה). שאריות התאגרף לציין את המוטציה של גליצין 5 לתוך אלאנין. הודפס מחדש באישור מהתייחסות
| TCR | CDR1α | CDR2α | CDR3α | CDR1β | CDR1β | CDR1β |
| PMEL17 | DSAIYN | IQSSQRE | CAVLSSGGSNYKLTFG | SGHTA | FQGTGA | CASSFIGGTDTQYFG |
| gp100 | TSINN | IRSNERE | CATDGDTPLVFG | LNHDA | SQIVND | CASSIGGPYEQYFG |
| KALYS | LLKGGEQ | CGTETNTGNQFYFG | SGHDY | FNNNVP | CASSLGRYNEQFFG | |
| 296 | DSASNY | IRSNVGE | CAASTSGGTSYGKLTFG | MNHEY | SMNVEV | CASSLGSSYEQYFG |
טבלה 1: יישור של TCR CDR3 אזורים של PMEL17, gp100, MPD, ו 296 TCRs ספציפי gp100. הודפס מחדש באישור בהפניה 31.
| רצף פפטיד | פפטיד | PMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3 זיקה K D | gp100 TCR TRAV17 TRBV19 אפיnity K D | ||||
| YLEPGPVTA | YLE | 7.6 ± 2 מיקרומטר | 26.5 ± 2.3 מיקרומטר | ||||
| YLEPGPVT V | YLE-9V | 6.3 ± 1.2 מיקרומטר | 21.9 ± 2.4 מיקרומטר | ||||
| LEPGPVTA | YLE-1A | 15.9 ± 4.1 מיקרומטר | 60.6 ± 5.4 מיקרומטר | ||||
| י.ל. PGPVTA | YLE-3A | לא מחייב | לא מחייב | ||||
| YLE GPVTA | YLE-4A | 19.7 ± 1.3 מיקרומטר | 144.1 ± 7.8 מיקרומטר | ||||
| YLEP PVTA | YLE-5A | > 1 מ"מ | > 1 מ"מ | ||||
| YLEPG VTA | YLE-6A | 11.4 ± 2.7 מיקרומטר | 954.9 ± 97.8 מיקרומטר | YLEPGP ת"א | YLE-7A | 31.1 ± 4 מיקרומטר | 102.0 ± 9.2 מיקרומטר |
| YLEPGPV A A | YLE-8A | 38.1 ± 7.4 מיקרומטר | 121.0 ± 7.5 מיקרומטר |
טבלה 2: ניתוח זיקה (K D) של PMEL17 TCR ו gp100 TCR כדי gp100 280-288 גרסאות פפטיד. הודפס מחדש באישור בהפניה 31.
| פרמטרים | PMEL17 TCR-A2-YLE-9V | A2-YLE | A2-YLE-3A | A2-YLE-5A |
| קוד PDB </ Strong> | 5EU6 | 5EU3 | 5EU4 | 5EU5 |
| סטטיסטיקת מערך נתונים | ||||
| קבוצת Space | P1 | P1 21 1 | P1 | P1 21 1 |
| פרמטרי תא יחיד (א) | a = 45.52, ב = 54.41, c = 112.12, a = 85.0 °, ב = 81.6 °, G = 72.6 ° | a = 52.81, ב = 80.37, c = 56.06, ב = 112.8 ° | a = 56.08, ב = 57.63, c = 79.93, a = 90.0 °, ב = 89.8 °, G = 63.8 ° | a = 56.33, ב = 79.64, c = 57.74, ב = 116.2 ° |
| מקור קרינה | DIAMOND I03 | DIAMOND I03 | DIAMOND I02 | DIAMOND I02 |
| אורך גל (א) | .9763 | .9999 | .9763 | .9763 |
| צפחותמגוון ברזולוציה אדומה (א) | 51,87 - 2.02 | 45.25 - 1.97 | 43.39 - 2.12 | 43,42 - 1.54 |
| Outer ההחלטה Shell (א) | 2.07 - 2.02 | 2.02 - 1.97 | 2.18 - 2.12 | 1.58 - 154 |
| השתקפות שנצפתה | 128.191 (8.955) | 99.442 (7.056) | 99.386 (7.463) | 244.577 (17.745) |
| השתקפויות ייחודיות | 64.983 (4.785) | 30.103 (2.249) | 49.667 (3.636) | 67.308 (4.962) |
| שלמות (%) | 97.7 (96.7) | 98.5 (99.3) | 97.4 (96.7) | 99.6 (99.9) |
| ריבוי | 2.0 (1.9) | 3.3 (3.1) | 2.0 (2.1) | 3.6 (3.6) |
| I / סיגמא (אני) | 5.5 (1.9) | 7.2 (1.9) | 6.7 (2.3) | 13 (2.3) |
| Rpim (%) | 5.7 (39.8) | 8.8 (44.7) | 8.7 (41.6) | 4.5 (35.4) |
| R מיזוג (%) | 7.8 (39.6) | 9.8 (50.2) | 8.7 (41.6) | 5.0 (53.2) |
| סטטיסטיקת חידוד | ||||
| רזולוציה (א) | 2.02 | 1.97 | 2.12 | 1.54 |
| אין השתקפויות בשימוש | 61,688 | 28557 | 47,153 | 63,875 |
| אין השתקפות סט Rfree | 3294 | 1526 | 2514 | 3406 |
| R cryst (לא חתוך) (%) | 18.1 | 19.7 | 17.2 | 17.0 |
| R חינם | 22.2 | 25.5 | 21.1 | 20.1 |
| שורש ממוצע סטייה רבועה מן הגיאומטריה אידיאלית | ||||
| אורכי בונד (א) | 0.018 (0.019) * | 0.019 (0.019) * | 0.021 (0.019) * | 0.018 (0.019) * |
| זוויות בונד (°) | 1.964 (1.939) * | 1.961 (1.926) * | 2.067 (1.927) * | 1.914 (1.936) * |
| בסך הכל לתאם שגיאה (א) | .122 | .153 | .147 | .055 |
| סטטיסטיקת ראמאצ'אנדראן | ||||
| רוב מועדף | 791 (96%) | 371 (98%) | 749 (99%) | 384 (98%) |
| מוּתָר | 32 (4%) | 6 (2%) | 10 (1%) | 5 (1%) |
| חריג | 2 (0%) | 3 (1%) | 1 (0%) | 2 (0%) |
טבלה 3: הפחתת נתונים ועידון לסטטיסטיקה (החלפה מולקולרית). הודפס מחדש באישור בהפניה 31. הערכים בסוגריים הם עבור פגז הרזולוציה הגבוהה ביותר.
| HLA / פפטיד שאריות | שאריות TCR | מס vdW (≤4Å) | H-אג"ח מס (≤3.4Å) |
| Gly62 | αGly98 | 3 | |
| αSer99 | 1 | ||
| Arg65 | αSer99 | 2 | |
| Arg65 O | αAsn100 Nδ2 | 2 | 1 |
| Arg65 NH1 | βAsp58 Oδ2 | 1 | |
| βSer59 | 8 | ||
| Lys66 | αGly98 | 1 | |
| αSer99 | 4 | ||
| αAsn100 | 4 | ||
| Ala69 | αAsn100 | 2 | |
| βAla56 | 2 | ||
| Gln72 Nε2 | βGln51 O | 3 | 1 |
| βGly54 | 7 | ||
| βAla55 | 1 | ||
| Thr73 | βGln51 | 1 | |
| Val76 | βGln51 | 3 | |
| βGly52 | 2 | ||
| Lys146 | βPhe97 | 3 | |
| βIle98 | 3 | ||
| Ala150 | βIle98 | 1 | |
| βAsp102 | 3 | ||
| Val152 | βIle98 | 1 | |
| Glu154 | αTyr32 | 1 | |
| Gln155 N | αTyr32 OH | 4 | 1 |
| Gln155 Oε1 | βThr101 N | 10 | 1 | αGly97 O | 1 | 1 |
| αGly98 | 1 | ||
| αSer96 | 1 | ||
| Glu3 | αTyr101 | 1 | |
| Pro4 | αSer96 | 1 | |
| αSer99 | 1 | ||
| αAsn100 | 4 | ||
| Pro4 O | αTyr101 N | 14 | 1 |
| Gly5 | αTyr101 | 3 | |
| βGly100 | 2 | ||
| Val7 | βIle98 | 7 | |
| βGly99 | 2 | ||
| βGly100 | 2 | ||
| Thr8 | βThr31 | 5 | |
| βGln51 | 1 | ||
| βPhe97 | 1 | ||
| Thr8 N | βIle98 O | 6 | 1 |
לוח 4: PMEL17 TCR-A2-YLE-9V לתקשר טבלה. הודפס מחדש באישור בהפניה 31.
Discussion
הפרוטוקולים המפורטים כאן מספקים מסגרת לנתיחה מולקולרית תאית של תגובות תאי T בהקשר של כל מחלות אנושיות. למרות שהסרטן היה המוקד העיקרי של מחקר זה, השתמשנו גישות דומות מאוד לחקור תגובות תאי T לוירוסי 32, 33, 34, 35, 36, 37 ובמהלך אוטואימוניות 38, 39, 40. יתר על כן, השתמשנו בטכניקות האלה בהרחבה כדי להבין את העקרונות המולקולריים אשר שולטים אנטיגן T-cell הכרה 2, 19, 41, 42. אכן, אופי שינויים בלתי צפויים כדי פפטיד שאריות, אפילו אלהמחוץ של שאריות מגע TCR, הכרת T-cell משפיע יש השלכות חשובות על העיצוב של פפטידים heteroclitic. ממצאים אלו תרמו באופן ישיר לפיתוח של טיפולים T-cell רומן, כולל חיסונים פפטיד 6, 43 ו TCRs גבוהה זיקה מלאכותית 3, 4, 5, 20, 44, כמו גם אבחון משופר 45, 46, 47.
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
הדור של חלבון טהור, מאוד פונקציונלי חיוני לכל מהשיטות המתוארות במאמר זה.
שינויים ופתרון בעיות
קשיים ביצירת חלבון טהור מאוד מרבים להתייחס בעת ביותר-pure, מסיס IBS ממערכת ביטוי E. coli. בדרך כלל, שינוי פרוטוקול הביטוי (למשל, גרימה בצפיפויות אופטיות שונות, תוך שימוש קולי זנים שונים א, או באמצעות תצורות מדיה שונות) פותר בעיות אלה.
מגבלות הטכניקה
טכניקות אלה להשתמש מולקולות חלבון מסיס (TCR ו pHLA) אשר מתבטאות בדרך כלל על פני התא. לכן, חשוב להבטיח כי מבניים / ממצאי biophysical עולים בקנה אחד עם גישות הסלולר כדי לאשר משמעות ביולוגית.
משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות
באמצעות השימוש קריסטלוגרפיה וביופיסיקה רנטגן תימוכין באמצעות ניתוח פונקציונלי, אנו ואחרים הוכחנו כי ספציפי TCRs עבור אפיטופים סרטן מאופיינים לרוב זיקות מחייבות נמוכות 48. זיקה נמוכה זו TCR עשויה לעזור להסביר מדוע תאי T arדואר לא יעיל באופן טבעי בפינוי הסרטן. מבנים אטומיים ברזולוציה גבוהה של קומפלקסים בין TCRs נגד סרטן ו אנטיגנים סרטניים מאותו מקור מתחילים לחשוף את הבסיס המולקולרי זיקה חלשה זו. יתר על כן, מחקרים אלה עשויים להיות מועילים לקביעת המנגנונים העומדים בבסיס ההתערבויות הטיפוליות שנועדו להתגבר על בעיה זו, זריעה לשיפורים עתידיים 16. במחקר זה, בחנו את המבנה הראשון של αβTCR טבעיים המתחוללים בקומפלקס עם epitope מלנומה-A HLA gp100 * 0201-מוגבל. המבנה, בשילוב עם בחינה המעמיקה biophysical, חשף את מצב המחייב הכולל של האינטראקציה. גם חשפנו מתג מולקולרי בלתי צפוי, אשר התרחש בצורת מוטציה של הפפטיד, כי בטל מחייב TCR (הוערך באמצעות תהודת plasmon פני שטח) ו CD8 + T-cell הכרה (ניסויים תפקודיים). זה היה אפשרי רק כדי להדגים מנגנון חדש זה של presentati אנטיגן HLAעל שימוש בשיטות ברזולוציה גבוהה המתואר.
יישומים עתידיים או כיוונים אחרי מאסטרינג טכניקה זו
ככלל, התוצאות שלנו להפגין את כוחו של קריסטלוגרפיה באמצעות קרן רנטגן ושיטות biophysical בשילוב עם ניתוחים תפקודיים חזקים. באמצעות גישות אלה, אפשר לנתח את מנגנונים מולקולריים שולטים מדויקים הכרת אנטיגן T-cell. אכן, אפשר גם להשתמש בגישה זו כדי לפתור את המבנה של unligated TCRs, המדגים כיצד שינויים מרחביים יכול לשחק תפקיד במהלך אפליה אנטיגן 49, 50, 51. הבנה טובה יותר של הטבע מורכב ודינמי מאוד כי בבסיס אינטראקציות TCR-pHLA יש גם משמעות ברורה לגבי עיצוב טיפול. היכולת ישירות "לראות" את מולקולות ממוקדות טיפולית, כמו גם את ההשפעה שיש שינויים על recognitio אנטיגןn, ישפר את פיתוח בבירור של תרופות אלה הולכים קדימה. במחקר זה, אנו מראים כי אפילו שינויים משקעים פפטיד יחיד שאינו מעורב בכבדות על ידי TCR יכולים לשדר שינויים מבניים בלתי צפוי שאריות אחרות הפפטיד הנכנס HLA, אשר, בתורו, באופן דראמטי שמשנה הכרת T-cell. הבנה שלמה יותר של המנגנונים המולקולריים המועסקים במהלך הכרת אנטיגן T-cell תהיה לנו יתרון משמעותי בעת תכנון טיפולים עתידיים עבור מגוון רחב של מחלות אנושיות.
Acknowledgments
בע"מ נתמך על ידי מלגת לימודים לתואר שלישי Cancer Research UK. AG נתמך על ידי מלגת לימודים לתואר שלישי ויילס רשת לחקר מדעי חיים. VB נתמך על ידי מלגת לימודים לתואר שלישי Cancer Research ויילס. DKC הוא עמית מחקר ופיתוח קריירה קרן Wellcome (WT095767). AKS הוא חוקר קרן Wellcome. GHM ממומנת על ידי Studentship PhD סרטן הטיפול ויילס רשת לחקר מדעי חיים משותף Tenovus. אנו מודים לצוות יהלום מקור אור למתן מתקנים ותמיכה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S.O.C. media | Invitrogen | ||
| Orbi-Safe New Orbit incubator | Sanyo | ||
| carbenicillin | Sigma | ||
| IPTG | Fisher | ||
| Quick Coomassie Stain SafeStain | Generon | ||
| Legend RT centrifuge | Sorvall | ||
| Tris | Fisher | ||
| magnesium chloride | Arcos | ||
| NaCl | Fisher | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | ||
| Sonopuls HD 2070 | Bandelin | ||
| DNAse | Fisher | ||
| Triton | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Fisher | ||
| guanidine | Fisher | ||
| NanoDrop ND1000 | Thermo | ||
| Peptides | Peptide Protein Research | ||
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | ||
| L-arginine | SAFC | ||
| cysteamine | Fisher | ||
| cystamine | Fisher | ||
| dialysis tubing | Sigma-Aldrich | ||
| urea | Sigma-Aldrich | ||
| Metricel 0.45 μm membrane filter | Pall | ||
| POROS 10/100 HQ | Applied biosystems | ||
| ÄKTA pure FPLC system | GE Healthcare Life Sciences | ||
| 10 kDa MWCO Vivaspin 20 | Sartorius | ||
| 10 kDa MWCO Vivaspin 4 | Sartorius | ||
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Phosphate Buffer Saline | Oxoid | ||
| BIAcore buffer HBS | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Biotinylation kit | Avidity | ||
| BIAcore T200 | GE Healthcare Life Sciences | ||
| CM5 chip coupling kit | GE Healthcare Life Sciences | ||
| streptavidin | Sigma-Aldrich | ||
| Microcal VP-ITC | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | ||
| Gryphon crystallisation robot | Art Robbins Instruments | ||
| Intelli-plate | Art Robbins Instruments | ||
| Crystallisation screens and reagents | Molecular Dimensions | ||
| 75 cm2 flask | Greiner Bio-One | ||
| 0.22 μm filters | Miller-GP, Millipore | ||
| Ultra-Clear ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | ||
| Optima L-100 XP with SW28 rotor | Beckman Coulter | ||
| CD8 microbeads | Miltenyi Biotec | ||
| anti-CD3/CD28 Dynabeads | Invitrogen | ||
| anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | ||
| CK medium, PHA | Alere Ltd | ||
| anti-TCRVβ mAb | BD | ||
| dasatinib | Axon | ||
| MIP-1β and TNFα ELISA | R&D Systems | ||
| 51Cr | PerkinElmer | ||
| 1450 Microbeta counter | PerkinElmer |
References
- Aleksic, M., Liddy, N., et al. Different affinity windows for virus and cancer-specific T-cell receptors: implications for therapeutic strategies. European journal of immunology. 42 (12), 3174-3179 (2012).
- Cole, D. K., Pumphrey, N. J., et al. Human TCR-binding affinity is governed by MHC class restriction. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 178 (9), 5727-5734 (2007).
- Cole, D. K., Sami, M., et al. Increased Peptide Contacts Govern High Affinity Binding of a Modified TCR Whilst Maintaining a Native pMHC Docking Mode. Frontiers in immunology. 4 (JUN), 168 (2013).
- Raman, M. C. C., Rizkallah, P. J., et al. Direct molecular mimicry enables off-target cardiovascular toxicity by an enhanced affinity TCR designed for cancer immunotherapy. Scientific reports. 6, 18851 (2016).
- Liddy, N., Bossi, G., et al. Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing. Nature medicine. 18 (6), 980-987 (2012).
- Cole, D. K., Edwards, E. S. J., et al. Modification of MHC anchor residues generates heteroclitic peptides that alter TCR binding and T cell recognition. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 185 (4), 2600-2610 (2010).
- Parkhurst, M. R., Salgaller, M. L., et al. Improved induction of melanoma-reactive CTL with peptides from the melanoma antigen gp100 modified at HLA-A*0201-binding residues. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 157 (6), 2539-2548 (1996).
- Salgaller, M. L., Marincola, F. M., Cormier, J. N., Rosenberg, S. A. Immunization against epitopes in the human melanoma antigen gp100 following patient immunization with synthetic peptides. Cancer research. 56 (20), 4749-4757 (1996).
- Cameron, B. J., Gerry, A. B., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science translational medicine. 5 (197), 197ra103 (2013).
- Linette, G. P., Stadtmauer, E. A., et al. Cardiovascular toxicity and titin cross-reactivity of affinity-enhanced T cells in myeloma and melanoma. Blood. 122 (6), 863-871 (2013).
- Miles, K. M., Miles, J. J., Madura, F., Sewell, A. K., Cole, D. K. Real time detection of peptide-MHC dissociation reveals that improvement of primary MHC-binding residues can have a minimal, or no, effect on stability. Molecular immunology. 48 (4), 728-732 (2011).
- Lesterhuis, W. J., Schreibelt, G., et al. Wild-type and modified gp100 peptide-pulsed dendritic cell vaccination of advanced melanoma patients can lead to long-term clinical responses independent of the peptide used. Cancer immunology, immunotherapy CII. 60 (2), 249-260 (2011).
- Speiser, D. E., Baumgaertner, P., et al. Unmodified self antigen triggers human CD8 T cells with stronger tumor reactivity than altered antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (10), 3849-3854 (2008).
- Schaft, N., Willemsen, R. A., et al. Peptide fine specificity of anti-glycoprotein 100 CTL is preserved following transfer of engineered TCR alpha beta genes into primary human T lymphocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 170 (4), 2186-2194 (2003).
- Schaft, N., Coccoris, M., et al. An Altered gp100 Peptide Ligand with Decreased Binding by TCR and CD8α Dissects T Cell Cytotoxicity from Production of Cytokines and Activation of NFAT. Frontiers in immunology. 4 (SEP), 270 (2013).
- Madura, F., Rizkallah, P. J., et al. Structural basis for ineffective T-cell responses to MHC anchor residue-improved "heteroclitic" peptides. European journal of immunology. 45 (2), 584-591 (2015).
- Boulter, J. M., Glick, M., et al. Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics. Protein engineering. 16 (9), 707-711 (2003).
- Garboczi, D. N., Utz, U., et al. Assembly, specific binding, and crystallization of a human TCR-alphabeta with an antigenic Tax peptide from human T lymphotropic virus type 1 and the class I MHC molecule HLA-A2. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 157 (12), 5403-5410 (1996).
- Madura, F., Rizkallah, P. J., et al. T-cell receptor specificity maintained by altered thermodynamics. Journal of Biological Chemistry. 288 (26), 18766-18775 (2013).
- Cole, D. K., Rizkallah, P. J., et al. Computational design and crystal structure of an enhanced affinity mutant human CD8 alphaalpha coreceptor. Proteins: Structure, Function and Genetics. 67 (1), 65-74 (2007).
- Benvenuti, M., Mangani, S. Crystallization of soluble proteins in vapor diffusion for x-ray crystallography. Nature protocols. 2 (7), 1633-1651 (2007).
- Leslie, A. G. W., Powell, H. R., et al. Automation of the collection and processing of X-ray diffraction data - a generic approach. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (11), 1924-1928 (2002).
- Kabsch, W.
- Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
- Bailey, S. N. Collaborative Computational Project, N. 4. The CCP4 suite: Programs for protein crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (5), 760-763 (1994).
- McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J.
- Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 60 (12 I), 2126-2132 (2004).
- Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 53 (3), 240-255 (1997).
- DeLano, W. L. The PyMOL Molecular Graphics System. Schrödinger LLC. 1, Available from: http://www.pymol.org (2000).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How Tcrs Bind Mhcs, Peptides, and Coreceptors. Annual Review of Immunology. 24 (1), 419-466 (2006).
- Bianchi, V., Bulek, A., et al. A Molecular Switch Abrogates Glycoprotein 100 (gp100) T-cell Receptor (TCR) Targeting of a Human Melanoma Antigen. Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8951-8959 (2016).
- Matthews, P. C., Koyanagi, M., et al. Differential clade-specific HLA-B*3501 association with HIV-1 disease outcome is linked to immunogenicity of a single Gag epitope. Journal of virology. 86 (23), 12643-12654 (2012).
- Gostick, E., Cole, D. K., et al. Functional and biophysical characterization of an HLA-A* 6801-restricted HIV-specific T cell receptor. European Journal of Immunology. 37 (2), 479-486 (2007).
- Miles, J. J., Bulek, A. M., et al. Genetic and structural basis for selection of a ubiquitous T cell receptor deployed in Epstein-Barr virus infection. PLoS Pathogens. 6 (11), e1001198 (2010).
- Holland, C. J., Rizkallah, P. J., et al. Minimal conformational plasticity enables TCR cross-reactivity to different MHC class II heterodimers. Scientific reports. 2, 629 (2012).
- Kløverpris, H. N., Cole, D. K., et al. A molecular switch in immunodominant HIV-1-specific CD8 T-cell epitopes shapes differential HLA-restricted escape. Retrovirology. 12, 20 (2015).
- Motozono, C., Kuse, N., et al. Molecular Basis of a Dominant T Cell Response to an HIV Reverse Transcriptase 8-mer Epitope Presented by the Protective Allele HLA-B*51:01. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 192 (7), 3428-3434 (2014).
- Motozono, C., Pearson, J. A., et al. Distortion of the major histocompatibility complex class i binding groove to accommodate an insulin-derived 10-mer peptide. Journal of Biological Chemistry. 290 (31), 18924-18933 (2015).
- Cole, D. K., Bulek, A. M., et al. Hotspot autoimmune T cell receptor binding underlies pathogen and insulin peptide cross-reactivity. The Journal of clinical investigation. , (2016).
- Bulek, A. M., Cole, D. K., et al. Structural basis for the killing of human beta cells by CD8(+) T cells in type 1 diabetes. Nature immunology. 13 (3), 283-289 (2012).
- Ekeruche-Makinde, J., Clement, M., et al. T-cell receptor-optimized peptide skewing of the T-cell repertoire can enhance antigen targeting. Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37269-37281 (2012).
- Cole, D. K., Miles, K. M., et al. T-cell Receptor (TCR)-peptide specificity overrides affinity-enhancing TCR-major histocompatibility complex interactions. Journal of Biological Chemistry. 289 (2), 628-638 (2014).
- Cole, D. K., Gallagher, K., et al. Modification of the carboxy-terminal flanking region of a universal influenza epitope alters CD4+ T-cell repertoire selection. Nature communications. 3, 665 (2012).
- Varela-Rohena, A., Molloy, P. E., et al. Control of HIV-1 immune escape by CD8 T cells expressing enhanced T-cell receptor. Nature medicine. 14 (12), 1390-1395 (2008).
- Holland, C. J., Dolton, G., et al. Enhanced Detection of Antigen-Specific CD4+ T Cells Using Altered Peptide Flanking Residue Peptide-MHC Class II Multimers. The Journal of Immunology. 195 (12), 5827-5836 (2015).
- Wooldridge, L., Clement, M., et al. MHC class I molecules with Superenhanced CD8 binding properties bypass the requirement for cognate TCR recognition and nonspecifically activate CTLs. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 184 (7), 3357-3366 (2010).
- Laugel, B., Den Berg, H. A. V. an, et al. Different T cell receptor affinity thresholds and CD8 coreceptor dependence govern cytotoxic T lymphocyte activation and tetramer binding properties. Journal of Biological Chemistry. 282 (33), 23799-23810 (2007).
- Bridgeman, J. S., Sewell, A. K., Miles, J. J., Price, D. A., Cole, D. K. Structural and biophysical determinants of αβ T-cell antigen recognition. Immunology. 135 (1), 9-18 (2012).
- Willcox, B. E., Gao, G. F., et al. TCR binding to peptide-MHC stabilizes a flexible recognition interface. Immunity. 10 (3), 357-365 (1999).
- Borbulevych, O. Y., Piepenbrink, K. H., Baker, B. M. Conformational melding permits a conserved binding geometry in TCR recognition of foreign and self molecular mimics. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 186 (5), 2950-2958 (2011).
- Armstrong, K. M., Piepenbrink, K. H., Baker, B. M. Conformational changes and flexibility in T-cell receptor recognition of peptide-MHC complexes. The Biochemical journal. 415 (2), 183-196 (2008).
