Introduction
Рентгеновской кристаллографии было и будет по-прежнему, чрезвычайно мощная техника, чтобы понять природу лиганд-рецепторных взаимодействий. Визуализируя этих взаимодействий в атомном деталях, не только возможно, чтобы раскрывать молекулярные механизмы, регулирующие многие биологические процессы, но также можно непосредственно изменять контактные интерфейсы для терапевтического эффекта. В сочетании с методами, такими как поверхностного плазмонного резонанса и изотермические титрование калориметрии (назвать только пару), такие изменения могут быть проанализированы биофизически оценить непосредственное влияние на аффинность связывания, кинетики взаимодействия и термодинамики. Наконец, выполняя функциональные эксперименты на соответствующих типах клеток, детальная картина молекулярного и функционального воздействия модификаций взаимодействий рецептор-лиганд, можно почерпнуть, обеспечивая очень специфическую механистическую информацию. В целом, эти типы методов обеспечивают атомное разрешение изображения, что позволяло бы сдерживать mination как биологические системы работают, с соответствующими последствиями для сопутствующих диагностических и терапевтических достижений.
Наша лаборатория регулярно использует эти методы для изучения рецепторов, которые обеспечивают иммунитет человека Т-клеток к патогенам и рака, в аутоиммунитета, и во время трансплантации. Здесь, мы обратили внимание на человека CD8 + Т-клеточного ответа к раку, опосредованного взаимодействия между Т-клеточного рецептора (TCR) и антиген лейкоцитов человека (HLA) -ограниченных опухолей , полученных пептидов (pHLA). Это важно , поскольку, несмотря на то CD8 + Т - клетки способны раковыми клетками - мишенями, мы и другие ранее показали , что противораковые ТКР неоптимально связываются с их родственными pHLA 1, 2. Таким образом, многие лаборатории попытались изменить либо ТКС 3, 4, 5 или пептидный лиганд , 6,класс = "Xref"> 7, 8 с целью повышения иммуногенности и лучше раковых клеток - мишеней. Тем не менее, эти подходы не всегда эффективны и могут иметь серьезные побочные эффекты, в том числе и от ворот токсичностью 4, 9, 10. Дальнейшие исследования изучения молекулярных механизмов, которые регулируют Т-клеточного распознавания раковых антигенов будет иметь жизненно важное значение для преодоления этих недостатков.
В настоящем исследовании мы сосредоточились на ответах против аутологичных клеток меланомы по CD8 + Т - клеток , специфичных для фрагмента антигена дифференцировки меланоцитов гликопротеина 100 (gp100), gp100 280-288, представленные HLA-A * 0201 (наиболее часто -expressed человек pHLA класс I). Этот антиген был широко изучен мишенью для иммунотерапии меланомы и был разработан в качестве так называемого "гетероклитический" пептид, в котором валин замещает аланинна якорной позиции 9 для повышения стабильности pHLA 11. Этот подход был использован для усиления индукции меланомой-реактивный ЦТК в пробирке и успешно используется в клинических испытаниях 12. Тем не менее, изменения в пептидных остатков может иметь непредсказуемое воздействие на Т-клеточной специфичности, о чем свидетельствует плохой эффективности большинства heterolitic пептидов в клинике 6, 13. Действительно, еще одна гетероклитический форма gp100 280-288, в котором пептидный остаток Glu 3 был заменен на Ala, аннулировал признание поликлональной популяции gp100 280-288 Определённые Т - клеток 14, 15. Ранее мы показали , что даже незначительные изменения в пептидный якорных остатков может существенно изменить распознавание Т-клеток непредсказуемым образом 6, 16. Таким образом, исследование было сосредоточено на сборкеING более детальную картину того , как CD8 + Т - клетки распознают gp100 и как модификации взаимодействия ТКО и pHLA может повлиять на эту функцию.
Здесь, мы сгенерировали с высокой степенью чистоты, растворимые формы двух ТКР специфических для gp100 280-288 , представленный HLA-A * 0201 (А2-YLE), а также природные и измененные формы pHLA. Эти реагенты были использованы для создания кристаллов протеина решить тройную атомную структуру человеческого TCR в комплексе с гетероклитический форме А2-YLE, а также двух мутантных pHLAs в unligated форме. Затем мы использовали сканирующий подход пептида, чтобы продемонстрировать влияние пептидных замен на ТКР путем проведения углубленного биофизических экспериментов. И, наконец, мы получили генетически модифицированную CD8 + линии Т-клеток, перепрограммирован, чтобы выразить один из А2-YLE конкретных ТКР, для выполнения функциональных экспериментов для определения биологической воздействия различных пептидных модификаций. Эти данные свидетельствуют о том, что даже Модиленностью к пептидным остатков, которые находятся за пределами связывания мотива TCR может иметь непредсказуемый эффект домино на соседних пептидных остатков, которые отменяют TCR связывания и распознавания Т-клеток. Наши результаты представляют собой первый пример структурных механизмов, лежащих в основе Т-клеточного распознавания этой важной терапевтической мишенью для меланому.
Protocol
1. Экспрессия белка
- Сделать генные конструкции для генерации растворимых TCR , и pHLAs, как подробно описано ранее 17, 18. Дизайн каждой конструкции с 5 'BamH1 и 3' сайт рестрикции EcoR1 для вставки в вектор pGMT7.
- Трансформации E.coli Rosetta (DE3) pLysS с pGMT7 производный вектором плазмиды , содержащей последовательность , кодирующую белок , представляющий интерес путем инкубирования 1 мкл 50-200 нг / мкл плазмиды с 5 мкл E.coli в течение 5 мин при 4 ° C , 2 мин при 42 ° с, и 5 мин при 4 ° с, и осаждаются в течение ночи при 37 ° с на агаровой пластине LB, дополненной 50 мг / л карбенициллина.
- Выбор отдельных колоний и расти при температуре 37 ° С и 220 оборотах в минуту в 30 мл TYP носителя (16 г / л триптона, 16 г / л дрожжевого экстракта и 5 г / л HK 2 O 4) , не дополненной 100 мкМ карбенициллина пока суспензия достигает оптического деnsity (OD 600) от 0,4 до 0,6.
- Индуцировать образование белка в 5 мл аликвоту путем введения 0,5 мМ изопропил- β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) в течение 3 ч. Хранить 20 мкл суспензии, с использованием и без индукции для электрофореза с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) анализ и окрашивать гель.
- Добавить заквасок на 1 л TYP с добавлением 100 мкМ карбенициллина и роста клеток , как описано выше на стадии 1.3 , пока суспензи не достигнет OD 600 от 0,4 до 0,6.
- Индуцируют экспрессию белка в течение 3 ч с помощью 0,5 мМ IPTG. Центрифуга клетки в течение 20 мин при 3000 XG и слейте супернатант тщательно.
- Растворить осадок в 40 мл буфера для лизиса (10 мМ Трис, рН 8,1; 10 мМ хлорида магния, MgCl 2, 150 мМ NaCl, и 10% глицерина), гомогенат , на льду в течение 30 мин при 60% -ной мощности с использованием 2 - секундного интервала , и инкубируют при комнатной температуре (КТ) в течение 30 мин с 0,1 г / л ДНКазы.
- Лечить SUSпенсия, содержащая белки в виде телец включения (IB) с помощью 100 мл промывочного буфера (0,5% Тритон Х-100; 50 мМ Трис, рН 8,1, 100 мМ NaCl, и 10 мМ ЭДТА).
- Центрифуга образца в течение 20 мин при температуре 4 ° С и 8000 XG и слейте супернатант тщательно. Повторное приостановить осадок в 100 мл ресуспендирования буфера (50 мМ Трис, рН 8,1, 100 мМ NaCl и 10 мМ ЭДТА, рН 8,1), центрифуга, как и раньше при 8000 XG, и слейте супернатант тщательно.
- И, наконец, растворить осадок в 10 мл буфера гуанидина (6 М гуанидин; 50 мМ Трис, рН 8,1; 2 мМ ЭДТА, рН 8,1, и 100 мМ NaCl), и измеряют концентрацию белка при 280 нм с использованием спектрофотометра.
2. pHLA и TCR Рефолдинг
- Для refolds pHLA, смешайте 30 мг HLA-A2 (или HLA-A2 с биотином меткой) СРК 30 мг β2m СРК и 4 мг пептида в течение 30 мин при 37 ° С в водяной бане в конечном объеме 6 мл гуанидин буфера с добавлением 10 мМ дитиотреитола(ДТТ).
- Инициирование белка повторной укладки путем разбавления предыдущей смеси в 1 л предварительно охлажденного буфера HLA рефолдинга (50 мМ Трис, рН 8,1, 400 мМ L-аргинин, 2 мМ ЭДТА, рН 8,1; 6 мМ цистеамин, и 4 мМ цистамин).
- Оставьте гистосовместимости повторно сворачивают перемешивание при температуре 4 ° С в течение 3 ч, а затем передать его в 12,4 кДа MWCO (молекулярная масса отключений) диализную трубку и диализ в два раза в течение 24 ч против 20 л 10 мМ Трис, рН 8,1.
- Для refolds TCR, смешайте 30 мг TCR α цепи брокерами и 30 мг TCR β цепи IBs в течение 30 мин при 37 ° С в водяной бане в 6 мл гуанидин буфера с добавлением 10 мМ DTT.
- Инициирование белка повторной укладки путем разбавления денатурированный смесь TCR в 1 л предварительно охлажденного ТКС рефолдинга буфера (50 мМ Трис, рН 8,1; 2,5 М мочевина, 2 мМ ЭДТА, рН 8,1; 6 мМ цистеамин, и 4 мМ цистамин) в течение 3 час
- Перенести рефолдинга в диализную трубку 12,4-кД MWCO и диализ в два раза в течение 24 ч против 20 л 10 мМ Трис, рН 8,1.
- Фильтр как pHLA или TCR рефдети, используя мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм для стадий очистки.
3. После очистки с помощью быстрой жидкостной хроматографии протеинов (FPLC)
- Нагрузка отфильтрованный препарат рефолдинга (либо pHLA или ТКС) на 7,9 мл, мкм анионом колонка 50 ионообменной смолы, предварительно уравновешенную 20 мл 10 мМ Трис, рН 8,1 на гибкой и интуитивной системы хроматографии.
- Элюции белка на уровне 5 мл / мин с градиентом соли (0-500 мМ NaCl в 10 мМ Трис, рН 8,1, в течение 8 объемами колонки) и собирают 1 мл фракций.
- Анализируют фракции, соответствующие интересующего белка с помощью SDS-PAGE, пул фракций, содержащих белок, представляющий интерес вместе, и сконцентрировать их до 500 мкл с помощью 10-кДа MWCO 20 или 10 кДа MWCO 4 центрифугированием в течение 20 мин при 4000 х г , отбрасывая проточные.
- Загрузить концентрированные белковые препараты в 2 мл инъекционного петли на 24 мл с колонкой гель-проникающей хроматографии, предварительно уравновешенную с приложениемropriate элюирующий буфер: фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) HBS (10 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 3,4 мМ ЭДТА и 0,005% поверхностно-активное вещество), или кристаллический буфер (10 мМ Трис, рН 8,1, и 10 мМ NaCl, ).
- Элюировать белки при скорости потока 0,5 мл / мин в течение 1 колонка объем; собирают 1 мл-фракции, содержащие белок, представляющий интерес заверенного SDS-PAGE.
Примечание: Эти методы были использованы для создания растворимых PMEL17 TCR и gp100 ТКО, а также все pHLAs, используемых в данном исследовании: HLA-A * 0201 с YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9В), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6А), YLEPGPATA (A2-YLE- 7А), или YLEPGPVAA (А2-YLE-8A).
4. поверхностного плазмонного резонанса (SPR) Анализ
- Выполните равновесный анализ связывания или термодинамического анализа с использованием системы молекулярного анализа взаимодействия , оснащенный CM5 чипа датчика 19.
- Активируйте чип CM5 через Гмычание 1: 1 смесь из 100 мМ N-гидроксисукцинимида (NHS) и 400 мМ 1-этил-3- (3-диметилпропил) -carboiimide (EDC) в течение 10 мин при скорости потока 10 мкл / мин и при 25 ° C.
- Нагрузка около 5000 единиц отклика (RU) стрептавидина (110 мкл 200 мкг / мл в 10 мМ ацетата, рН 4,5) с помощью ковалентных, ссылающихся на поверхности чипа во всех четырех флоу-клеток и используют 100 мкл 1 М этаноламина гидрохлорида дезактивировать любые оставшиеся реактивные группы.
- Пара приблизительно 500-600 RU из pHLA, при ~ 1 мкМ в коммерческом буфере (предоставленного производителем) для сенсорного чипа CM5 при медленной скорости потока 10 мкл / мин, чтобы обеспечить равномерное распределение на поверхности чипа.
- Пропитайте поверхность чипа с 1 мМ биотина в коммерческом буфере (предоставляется изготовителем) в течение 60 с.
- Вводят десять серийных разведений растворимых ТКО над соответствующим потоком клеток при высокой скорости потока 30 мкл / мин при 25 ° С.
- Вычислить равновесную-константа связывания(K D (E)) значений с помощью нелинейной кривой Fit (у = (P1x) / (P2 + х)) 20.
Примечание: у = ответа единицы, х = концентрация аналитик, P1 = г макс, P2 = K D. - Провести анализ кинетики в предположении , 1: 1 Ленгмюра связывания и согласуется с данными с использованием глобальной посадки алгоритма в программном пакете 2.
- Выполните эксперименты термодинамики, повторяя этот метод при следующих температурах: 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C и 30 ° C 19.
- Используйте значения K D определяются ОПИ при различных температурах для расчета ΔG ° с использованием стандартного термодинамического уравнения (ΔG ° = -RTlnK D) 19.
Примечание: R = газовая постоянная, Т = температура в К, п = натуральный логарифм. - Расчет термодинамических параметров в соответствии с уравнением Гиббса-Гельмгольца (ΔG ° = & Dgr ; H - TΔS °) 19. Участок связывания свободных энергий, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK D) в зависимости от температуры (K) с использованием нелинейной регрессии , чтобы соответствовать уравнению трехпараметрическую (у = + & Dgr ; H ΔCp * (х-298) -х * ΔS- х * ΔCp * п (х / 298)) 19.
Примечание: у = температура в К, х = ΔG °.
5. Изотермический Титрование калориметрия (ITC)
- Провести эксперименты ИТЦ с использованием изотермический калориметр титрования. Вводят 30 мкМ pHLA в ячейку калориметра и нагрузки 210 мкМ растворимого TCR в шприц. Используйте следующие условия буфер: 20 мМ HEPES (рН 7,4), содержащем 150 мМ NaCl.
- Выполните 20 TCR инъекций, каждый из объема 2 мкл. Вычислить и K ; H D с помощью аналитического программного обеспечения.
6. Кристаллизация, дифракция сбора данных, и модель Доработка
- Провести испытания кристаллизации с использованием кристаллизации робота.
- Вырастить кристаллы от VAPили диффузии при 18 ° С с помощью сидящей техники микрокапель в 96-луночный планшет с резервуаром , содержащим 60 мкл буфера для кристаллизации (маточного раствора) 21.
- Концентрат растворимый pHLA до приблизительно 10 мг / мл (0,2 мМ) в кристаллическом буфере центрифугированием при 3000 х г в 10-кДа, молекулярная масса отсечки центробежном концентраторе.
- Для совместного сложной структуры, смешивают TCR и pHLA в соотношении 1: 1 молярной для получения раствора белка приблизительно 10 мг / мл (0,1 мМ).
- Добавить 200 нл pHLA в одиночку, или 1: 1 мольное отношение смесь TCR и pHLA, до 200 нл каждого резервуара раствора с экрана кристаллизации с использованием смеси дл кристаллизации робота и счет для кристаллов под микроскопом через 24 ч, 48 ч, 72 ч, а затем один раз в неделю.
- Урожай монокристаллы вручную монтировать их в крио-петли под микроскопом и крио-охладить их, погружая и хранить их в жидком азоте (100 K).
Примечание: Загрузка кристаллов занимает немного пракведливости, и решить, какие кристаллы достаточно хороши для сбора данных приходит с опытом. Как правило, чем больше и регулярного кристалла, тем лучше. - Сбор данных в потоке газообразного азота при 100 К.
Примечание: Эти данные были приобретены в Алмазном источник света (DLS) национальный синхротронного Научный центр в Великобритании. - Анализ данных с помощью оценки интенсивности отражения с использованием xia2 как MOSFLM 22 и XDS пакеты 23, а затем масштабировать данные с SCALA или бесцельного 24 и пакет CCP4 25.
- Решить структуры с молекулярной замены с использованием PHASER 26.
- Отрегулируйте модель с голеностопом 27 и уточнить модель с REFMAC5 28.
- Подготовка графического представления с PyMOL 29.
- Вычислить контакты с помощью "контакт"Программа в пакете CCP4. Используйте 4 отсечка для ван-дер-ваальсовых контактов и 3.4 отсечка для водородных связей и солевых мостиков.
- Вычислить поверхностную комплементарность с помощью программы "SC" в пакете CCP4.
- Вычислить угол пересечения комплекса TCR-pHLA, как описано 30.
Примечание: Для этого исследования, данные отражения и конечные координаты модели были сданы на хранение в базе данных PDB (PMEL17 TCR-A2-YLE-9В PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-YLE-3A PDB: 5EU4, и А2 -YLE-5A PDB: 5EU5).
Representative Results
Используя описанные выше методы, мы сгенерировали растворимый TCR (Таблица 1) и молекул pHLA для проведения углубленного анализа молекулярных распознавания gp100 280-288 по CD8 + Т - клеток. Модифицированная система экспрессии E.coli , была использована для создания нерастворимый IBs для каждой отдельной цепи как ТКО (а, р) и цепей pHLAs (α цепи и β2m). Этот метод имеет то преимущество, что он относительно дешевый и простой в настройке и генерирует большие урожаи белка (100-500 мг / л культуры). Кроме того, нерастворимые белки обладают высокой стабильностью при хранении при температуре -80 ° С. Затем мы использовали хорошо изученного рефолдинга и очистки техники для создания функциональных, однородная, растворимые белки. Этот метод полезен для генерации белков для биофизических, структурных и клеточных экспериментов, а также реагенты, которые могут быть использованы для диагностики или терапии.
(таблица 2). Этот анализ показал, в которых остатки пептида являются наиболее важными для связывания TCR. С высокой разрешающей способностью анализа аффинности связывания с использованием данной методики являются чрезвычайно полезными для определения биологических механизмов, которые контролируют белок-белковых взаимодействий, а также для анализа аффинности связывания терапевтических молекул.
Затем мы кристаллизуется меланома-специфический растворимый TCR (PMEL17 TCR) в комплексе с модифицированной опухолью производного pHLA (А2-YLE-9В) для исследования связывания режима с атомным разрешением (рисунки 1 и 2 и таблица 3). Эти эксперименты дают прямой визуализации связывания интерфейса между двумя молекулами, providinг ключевой информации о базовых принципах, регулирующих взаимодействие. Кроме того , мы провели термодинамический анализ взаимодействия с использованием как SPR и МТЦ, открывая энергетические вклады, позволившие связывание (Рисунки 3). Эти анализы были дополнительно подтверждается описанием высокого разрешения контактного следа между этими двумя белками (рисунок 4 и таблица 4).
Затем мы решали структуры unligated молекул pHLA, представляя мутированные формы пептида, показывая , что молекулярный переключатель может объяснить , почему некоторые мутации отменялись TCR связывания (Рисунки 5).
В целом, эти методы предложены новые данные, демонстрирующие механизм, объясняющий, как Т-клетки распознают меланома происхождения антиген, который является важной мишенью для противораковых терапевтических средств. В более широком смысле, эти методыможет быть использован для изучения практически любого взаимодействия рецептор-лиганд, обнажая новые биологические механизмы, которые могли бы быть направлены на новые терапевтические достижения.
Рисунок 1: Плотность Анализ участка. Слева показывает столбец опускаем карты, в которых модель была усовершенствована в отсутствие пептида. Плотность разница оконтурено на уровне 3,0 сигма, положительные контуры показаны зеленым цветом, а отрицательные контуры красного цвета. Правая колонка показывает наблюдаемую карту на 1,0 сигма (показан в виде серой сетки вокруг рукояти представлений белковых цепей) после последующего уточнения с помощью автоматических некристаллографические ограничители симметрии, применяемые REFMAC5. (A) Модель для PMEL17 TCR-A2-YLE-9В с ТКР CDR3 петли окрашены в синий цвет (α цепь) и оранжевый (β цепи) и пептид в зеленый цвет. (B) модель A2-YLE спептид окрашен темно-зеленый цвет. (C) модель A2-YLE-3A с пептидной окрашен в оранжевый цвет (для А2-YLE-3A, были 2 молекулы в асимметричном единицы, но они были практически идентичны с точки зрения опускаем и плотности карт, поэтому только копия 1 показан здесь). (D) модель A2-YLE-5A с пептидной окрашены в розовый цвет. Печатается с разрешения автора из ссылки 31. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Обзор PMEL17 TCR в комплексе с A2-YLE-9В. (A) Мультфильм представление комплекса PMEL17 TCR-A2-YLE-9В. ТКР окрашен в черный цвет; петли TCR CDR показаны (красный, CDR1α, темно-зеленый, CDR2α, синий, CDR3α, желтый, CDR1β, аква, CDR2 ^6 ;; оранжевый, CDR3β); и HLA-A * 0201 изображен в сером цвете. YLE-9В пептид представлен зелеными палочками. (B) поверхности и торчат представления остатков PMEL17 TCR CDR петли (цветные , как и в A) , которые контактируют с A2-YLE поверхность (А2, серый; YLE-9В, зеленые палочки). Черный диагональная линия указывает на угол пересечения ТКР по отношению к длинной оси YLEPGPVTV пептида (46,15 °). (C) Контактная след от PMEL17 TCR на поверхности А2-YLE-9В (A2, серый); фиолетовый и зеленый (поверхность и палочки) указывают на HLA-A * 0201 и YLE остатки, соответственно, связался с gp100 TCR. Отсечке 3,4 Å для водородных связей и 4 Å для ван-дер-ваальсовых контактов. Печатается с разрешения Reference 31. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Термодинамический анализ PMEL17 TCR-A2-YLE взаимодействия. (A) PMEL17 TCR равновесного связывания ответов на A2-YLE в 5, 12, 18, 25 и 37 ° С в девяти до десяти TCR серийных разведений. SPR сырье и подогнанные данные (предполагается , что 1: 1 связывания Ленгмюра) показаны на вставке каждой кривой и использовали для расчета K на K и выключения значений с использованием глобальной посадки алгоритм (BIAevaluation 3.1). В таблице показано , равновесие-связывающим (K D (Е)) и кинетической константы связывания (K D (K) = K выкл / К на) при каждой температуре. Равновесные константы связывания (K D, микроны) значения были рассчитаны с использованием нелинейного подгонке (у = (P1x) / (P2 + х)). Были вычислены (б) термодинамические параметры в соответствии с уравнением Гиббса-Гельмгольца (ΔG ° = & Dgr ; H ° - TΔS °). Связующие свободные энергии, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK D), наносили на график в зависимости от температуры (K) с использованием нелинейной регрессии , чтобы соответствовать уравнению трехпараметрическую (у = & Dgr ; H ° + ΔCp ° * (х-298) -x * -x ° Dgr ; S * ΔCp ° * п (х / 298)). Энтальпию (& Dgr; H & deg;) и энтропия (TΔS °) при 298 К (25 ° C) приведены в ккал / моль, и были рассчитаны с помощью нелинейной регрессии температура (K) в виде зависимости от свободной энергии (ΔG °). Измерения (C) изотермический Калориметрический титрование (ITC) для TCR-A2-YLE взаимодействия PMEL17. Энтальпию (& Dgr; H & deg;) и энтропия (TΔS °) при 298 К (25 ° C) приведены в ккал / моль. Печатается с разрешения автора из ссылки 31. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Конформационный Сравнение стоимости акций YLE, YLE-3А, и А2-YLE-5A Пептиды Представлено HLA-A * 0201. (A) YLE (темно - зеленые палочки) и YLE-3A (оранжевые палочки) пептид выравнивание по наложению HLA-A * 0201 α1 спиралью (серый мультфильм). Коробочные остатки указывают мутации Glu 3 в аланин. Вставки показывают, как замена Glu3Ala вызывает сдвиг в положении (черная стрелка) от соседа остатков pro4 в структуре A2-YLE-3A по сравнению с A2-YLE структуры. (B) YLE (темно - зеленые палочки) и YLE-5A (розовые палочки) пептид выравнивание по наложению HLA-A * 0201 α1 спиралью (серый мультфильм). В штучной упаковке остатки указывают мутации глицин 5 в аланин. Печатается с разрешения ссылки
| TCR | CDR1α | CDR2α | CDR3α | CDR1β | CDR1β | CDR1β |
| PMEL17 | DSAIYN | IQSSQRE | CAVLSSGGSNYKLTFG | SGHTA | FQGTGA | CASSFIGGTDTQYFG |
| gp100 | TSINN | IRSNERE | CATDGDTPLVFG | LNHDA | SQIVND | CASSIGGPYEQYFG |
| Калыс | LLKGGEQ | CGTETNTGNQFYFG | SGHDY | FNNNVP | CASSLGRYNEQFFG | |
| 296 | DSASNY | IRSNVGE | CAASTSGGTSYGKLTFG | MNHEY | SMNVEV | CASSLGSSYEQYFG |
Таблица 1: Выравнивание TCR CDR3 регионов PMEL17, gp100, MPD и 296 gp100 специфические ТКО. Печатается с разрешения автора из ссылки 31.
| пептидной последовательности | пептид | PMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3 Affinity K D | gp100 TCR TRAV17 TRBV19 Affiщество K D | ||||
| YLEPGPVTA | YLE | 7,6 ± 2 мкМ | 26.5 ± 2,3 мкМ | ||||
| YLEPGPVT V | YLE-9В | 6,3 ± 1,2 мкМ | 21,9 ± 2,4 мкМ | ||||
| LEPGPVTA | YLE-1A | 15,9 ± 4,1 мкМ | 60,6 ± 5,4 мкМ | ||||
| YL PGPVTA | YLE-3A | Нет привязки | Нет привязки | ||||
| YLE GPVTA | YLE-4A | 19,7 ± 1,3 мкМ | 144.1 ± 7,8 мкМ | ||||
| YLEP PVTA | YLE-5A | > 1 мМ | > 1mM | ||||
| YLEPG VTA | YLE-6A | 11,4 ± 2,7 мкМ | 954.9 ± 97,8 мкмоль | YLEPGP ТА | YLE-7A | 31,1 ± 4 мкМ | 102,0 ± 9,2 мкМ |
| YLEPGPV A A | YLE-8A | 38,1 ± 7,4 мкМ | 121,0 ± 7,5 мкМ |
Таблица 2: Анализ Affinity (K D) из PMEL17 TCR и gp100 TCR для gp100 280-288 вариантов пептида. Печатается с разрешения автора из ссылки 31.
| параметры | PMEL17 TCR-A2-YLE-9В | A2-YLE | A2-YLE-3A | A2-YLE-5A |
| PDB код </ Сильный> | 5EU6 | 5EU3 | 5EU4 | 5EU5 |
| статистика набора данных | ||||
| Пространственная группа | P1 | P1 21 1 | P1 | P1 21 1 |
| Параметры элементарной ячейки (A) | а = 45,52, Ъ = 54,41, с = 112,12, а = 85,0 °, б = 81,6 °, г = 72,6 ° | а = 52,81, Ъ = 80,37, с = 56,06, Ъ = 112,8 ° | а = 56,08, Ъ = 57,63, с = 79,93, а = 90,0 °, б = 89,8 °, г = 63,8 ° | а = 56,33, Ъ = 79,64, с = 57,74, Ъ = 116,2 ° |
| источник излучения | DIAMOND I03 | DIAMOND I03 | DIAMOND I02 | DIAMOND I02 |
| Длина волны (Å) | 0,9763 | 0,9999 | 0,9763 | 0,9763 |
| колбыДиапазон красного разрешение (Å) | 51.87 - 2.02 | 45.25 - 1.97 | 43.39 - 2.12 | 43.42 - 1.54 |
| Внешний Разрешение Shell (Å) | 2,07 - 2,02 | 2,02 - 1,97 | 2.18 - 2.12 | 1,58 - 154 |
| Отражение наблюдается | 128191 (8955) | 99442 (7056) | 99386 (7463) | 244577 (17745) |
| Уникальная система отражений | 64983 (4785) | 30103 (2249) | 49667 (3636) | 67308 (4962) |
| Полнота (%) | 97,7 (96,7) | 98,5 (99,3) | 97,4 (96,7) | 99,6 (99,9) |
| множественность | 2,0 (1,9) | 3,3 (3,1) | 2,0 (2,1) | 3,6 (3,6) |
| Я / Сигма (I), | 5.5 (1.9) | 7.2 (1.9) | 6.7 (2.3) | 13 (2,3) |
| Rpim (%) | 5,7 (39,8) | 8,8 (44,7) | 8,7 (41,6) | 4,5 (35,4) |
| R слияния (%) | 7,8 (39,6) | 9.8 (50.2) | 8,7 (41,6) | 5,0 (53,2) |
| статистика Масштабирующие | ||||
| Разрешение (Å) | 2,02 | 1,97 | 2.12 | 1,54 |
| Нет отражений, использованных | 61688 | 28557 | 47153 | 63875 |
| Нет отражения в Rfree наборе | 3294 | 1526 | 2514 | 3406 |
| R крист (без отключения) (%) | 18,1 | 19,7 | 17,2 | 17,0 |
| R бесплатно | 22,2 | 25.5 | 21.1 | 20,1 |
| Среднеквадратичное отклонение от идеальной геометрии | ||||
| Длины связей (A) | 0,018 (0,019) * | 0,019 (0,019) * | 0,021 (0,019) * | 0,018 (0,019) * |
| валентных углов (°) | 1,964 (1,939) * | 1,961 (1,926) * | 2,067 (1,927) * | 1,914 (1,936) * |
| Общая ошибка координат (A) | 0,122 | 0,153 | 0,147 | 0,055 |
| Рамачандрану Статистика | ||||
| наибольшего благоприятствования | 791 (96%) | 371 (98%) | 749 (99%) | 384 (98%) |
| Позволил | 32 (4%) | 6 (2%) | 10 (1%) | 5 (1%) |
| Выпадающие | 2 (0%) | 3 (1%) | 1 (0%) | 2 (0%) |
Таблица 3: Снижение данных и уточнение статистики (молекулярная замена). Печатается с разрешения автора из ссылки 31. Значения в скобках приведены для самого высокого разрешения оболочки.
| HLA / пептидный остаток | TCR остаток | Нет . Ван дер Ваальса (≤4Å) | Нет . Н-связи (≤3.4Å) |
| Gly62 | αGly98 | 3 | |
| αSer99 | 1 | ||
| Arg65 | αSer99 | 2 | |
| Arg65 O | αAsn100 Nδ2 | 2 | 1 |
| Arg65 NH1 | βAsp58 Oδ2 | 1 | |
| βSer59 | 8 | ||
| Lys66 | αGly98 | 1 | |
| αSer99 | 4 | ||
| αAsn100 | 4 | ||
| Ala69 | αAsn100 | 2 | |
| βAla56 | 2 | ||
| Gln72 Nε2 | βGln51 O | 3 | 1 |
| βGly54 | 7 | ||
| βAla55 | 1 | ||
| Thr73 | βGln51 | 1 | |
| Val76 | βGln51 | 3 | |
| βGly52 | 2 | ||
| Lys146 | βPhe97 | 3 | |
| βIle98 | 3 | ||
| Ala150 | βIle98 | 1 | |
| βAsp102 | 3 | ||
| Val152 | βIle98 | 1 | |
| Glu154 | αTyr32 | 1 | |
| Gln155 N | αTyr32 OH | 4 | 1 |
| Gln155 Oε1 | βThr101 N | 10 | 1 | αGly97 O | 1 | 1 |
| αGly98 | 1 | ||
| αSer96 | 1 | ||
| Glu 3 | αTyr101 | 1 | |
| Pro4 | αSer96 | 1 | |
| αSer99 | 1 | ||
| αAsn100 | 4 | ||
| Pro4 O | αTyr101 N | 14 | 1 |
| Gly5 | αTyr101 | 3 | |
| βGly100 | 2 | ||
| Val7 | βIle98 | 7 | |
| βGly99 | 2 | ||
| βGly100 | 2 | ||
| Thr8 | βThr31 | 5 | |
| βGln51 | 1 | ||
| βPhe97 | 1 | ||
| Thr8 N | βIle98 O | 6 | 1 |
Таблица 4: PMEL17 TCR-A2-YLE-9В Контактная Таблица. Печатается с разрешения автора из ссылки 31.
Discussion
Протоколы, описанные здесь, обеспечивают основу для молекулярного и клеточного рассечения Т-клеточных реакций в контексте любого заболевания человека. Хотя рак был главным предметом данного исследования, мы использовали очень схожие подходы для исследования Т-клеточного ответа на вирусы 32, 33, 34, 35, 36, 37 и 38 во время аутоиммунитете, 39, 40. Кроме того, мы использовали эти методы в более широком смысле , чтобы понять молекулярные принципы , которые регулируют признание Т-клеточный антиген 2, 19, 41, 42. Действительно, непредсказуемый характер изменений к пептидным остатков, даже те,Внешняя часть контактных остатков TCR, распознавание воздействия Т-клеток имеет важное значение для проектирования гетероклитический пептидов. Эти данные непосредственно способствовали разработке новых Т-клеточной терапии, в том числе пептидных вакцин 6, 43 и искусственных высоким сродством ТКР 3, 4, 5, 20, 44, а также усиленных диагностики 45, 46, 47.
Критические шаги в рамках протокола
Поколение с высокой степенью чистоты, функционального белка имеет важное значение для всех методов, описанных в этой статье.
Модификации и устранение неисправностей
Трудности в создании высокочистого белка часто относятся к выражению высоко- чистой, нерастворимый IBs из системы экспрессии палочки E.. Как правило, изменение протокола экспрессии (например, побуждая при различных оптических плотностей, с использованием различных штаммов E.coli, или с использованием различных образований средств массовой информации) решает эти вопросы.
Ограничения метода
Эти методы используют растворимые белковые молекулы (TCR и pHLA), которые обычно представлены на поверхности клеток. Таким образом, важно обеспечить, чтобы структурные / биофизические данные согласуются с результатами клеточных подходов к подтверждающими биологическое значение.
Значение метода в отношении существующих / альтернативных методов
Благодаря использованию рентгеновской кристаллографии и биофизики обосновываться путем функционального анализа, мы и другие показали , что ТКО специфичные для рака эпитопы , как правило , характеризуются низкой аффинностью связывания 48. Такое низкое сродство TCR может помочь объяснить, почему Т-клетки аре, естественно, не эффективны при очистке рака. С высокой разрешающей способностью атомных структур комплексов между противораковыми ТКР и родственными опухолевых антигенов начинают выявить молекулярную основу этого слабого сродства. Кроме того, эти исследования полезны для определения механизмов, лежащих в основе терапевтических вмешательств , направленных на преодоление этой проблемы, высева будущих улучшений 16. В данном исследовании мы рассмотрели первую структуру природной αβTCR в комплексе с gp100 HLA-A * 0201-ограниченной меланомой эпитопов. Структура, в сочетании с биофизической детальным осмотром, показал общий режим связывания взаимодействия. Мы также обнаружили неожиданный молекулярный переключатель, который произошел в мутантной форме пептида, который аннулировал TCR связывания (оцениваемые с использованием поверхностного плазмонного резонанса) и CD8 Т-клеточного распознавания + (функциональные эксперименты). Это было возможно только продемонстрировать этот новый механизм HLA антигена presentatiна использовании методов высокого разрешения, описанных.
Будущие приложения или направления после освоения этой техники
В целом, полученные нами результаты показывают, мощность рентгеновской кристаллографии и биофизических методов в сочетании с надежными функционального анализа. С помощью этих подходов, можно рассекать из точных молекулярных механизмов, которые регулируют распознавание антигена Т-клеток. В самом деле, можно также использовать этот подход для решения структуры unligated ТКР, демонстрируя , как конформационные изменения могут играть определенную роль в процессе антигена дискриминации 49, 50, 51. Лучшее понимание весьма сложной и динамичной природы, лежащей в основе TCR-pHLA взаимодействий также имеет очевидные последствия для дизайна терапии. Будучи в состоянии непосредственно "видеть" молекулы, которые в настоящее время терапевтически целевых, а также к тому, что модификации на антиген recognitioп, будет явно улучшить развитие этих лекарственных средств в будущем. В этом исследовании мы показали, что даже изменения в одном пептидный остаток, который не сильно зацепляется TCR может непредсказуемо передавать структурные изменения в других остатков в HLA-пептид, связанный, который, в свою очередь, приводит к изменению резко Т-клеточного распознавания. Более полное понимание молекулярных механизмов, используемых в процессе распознавания антигена Т-клеток будет чрезвычайно полезным при разработке будущих методов лечения для широкого спектра заболеваний человека.
Acknowledgments
BM поддерживается студенчества Cancer Research UK PhD. AG поддерживается студенчества Life Science Research Network Уэльс PhD. VB поддерживается студенчества Cancer Research Wales PhD. DKC является Wellcome Trust Исследование развития карьеры сотрудник (WT095767). АКС является Wellcome Trust Следователь. ГХМ финансируется за счет совместной Life Science Research Network Уэльского и Tenovus рака Care PhD студенчества. Мы благодарим сотрудников по алмазам Источник света для обеспечения удобства и поддержки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S.O.C. media | Invitrogen | ||
| Orbi-Safe New Orbit incubator | Sanyo | ||
| carbenicillin | Sigma | ||
| IPTG | Fisher | ||
| Quick Coomassie Stain SafeStain | Generon | ||
| Legend RT centrifuge | Sorvall | ||
| Tris | Fisher | ||
| magnesium chloride | Arcos | ||
| NaCl | Fisher | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | ||
| Sonopuls HD 2070 | Bandelin | ||
| DNAse | Fisher | ||
| Triton | Sigma-Aldrich | ||
| EDTA | Fisher | ||
| guanidine | Fisher | ||
| NanoDrop ND1000 | Thermo | ||
| Peptides | Peptide Protein Research | ||
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | ||
| L-arginine | SAFC | ||
| cysteamine | Fisher | ||
| cystamine | Fisher | ||
| dialysis tubing | Sigma-Aldrich | ||
| urea | Sigma-Aldrich | ||
| Metricel 0.45 μm membrane filter | Pall | ||
| POROS 10/100 HQ | Applied biosystems | ||
| ÄKTA pure FPLC system | GE Healthcare Life Sciences | ||
| 10 kDa MWCO Vivaspin 20 | Sartorius | ||
| 10 kDa MWCO Vivaspin 4 | Sartorius | ||
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Phosphate Buffer Saline | Oxoid | ||
| BIAcore buffer HBS | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Biotinylation kit | Avidity | ||
| BIAcore T200 | GE Healthcare Life Sciences | ||
| CM5 chip coupling kit | GE Healthcare Life Sciences | ||
| streptavidin | Sigma-Aldrich | ||
| Microcal VP-ITC | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | ||
| Gryphon crystallisation robot | Art Robbins Instruments | ||
| Intelli-plate | Art Robbins Instruments | ||
| Crystallisation screens and reagents | Molecular Dimensions | ||
| 75 cm2 flask | Greiner Bio-One | ||
| 0.22 μm filters | Miller-GP, Millipore | ||
| Ultra-Clear ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | ||
| Optima L-100 XP with SW28 rotor | Beckman Coulter | ||
| CD8 microbeads | Miltenyi Biotec | ||
| anti-CD3/CD28 Dynabeads | Invitrogen | ||
| anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | ||
| CK medium, PHA | Alere Ltd | ||
| anti-TCRVβ mAb | BD | ||
| dasatinib | Axon | ||
| MIP-1β and TNFα ELISA | R&D Systems | ||
| 51Cr | PerkinElmer | ||
| 1450 Microbeta counter | PerkinElmer |
References
- Aleksic, M., Liddy, N., et al. Different affinity windows for virus and cancer-specific T-cell receptors: implications for therapeutic strategies. European journal of immunology. 42 (12), 3174-3179 (2012).
- Cole, D. K., Pumphrey, N. J., et al. Human TCR-binding affinity is governed by MHC class restriction. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 178 (9), 5727-5734 (2007).
- Cole, D. K., Sami, M., et al. Increased Peptide Contacts Govern High Affinity Binding of a Modified TCR Whilst Maintaining a Native pMHC Docking Mode. Frontiers in immunology. 4 (JUN), 168 (2013).
- Raman, M. C. C., Rizkallah, P. J., et al. Direct molecular mimicry enables off-target cardiovascular toxicity by an enhanced affinity TCR designed for cancer immunotherapy. Scientific reports. 6, 18851 (2016).
- Liddy, N., Bossi, G., et al. Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing. Nature medicine. 18 (6), 980-987 (2012).
- Cole, D. K., Edwards, E. S. J., et al. Modification of MHC anchor residues generates heteroclitic peptides that alter TCR binding and T cell recognition. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 185 (4), 2600-2610 (2010).
- Parkhurst, M. R., Salgaller, M. L., et al. Improved induction of melanoma-reactive CTL with peptides from the melanoma antigen gp100 modified at HLA-A*0201-binding residues. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 157 (6), 2539-2548 (1996).
- Salgaller, M. L., Marincola, F. M., Cormier, J. N., Rosenberg, S. A. Immunization against epitopes in the human melanoma antigen gp100 following patient immunization with synthetic peptides. Cancer research. 56 (20), 4749-4757 (1996).
- Cameron, B. J., Gerry, A. B., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science translational medicine. 5 (197), 197ra103 (2013).
- Linette, G. P., Stadtmauer, E. A., et al. Cardiovascular toxicity and titin cross-reactivity of affinity-enhanced T cells in myeloma and melanoma. Blood. 122 (6), 863-871 (2013).
- Miles, K. M., Miles, J. J., Madura, F., Sewell, A. K., Cole, D. K. Real time detection of peptide-MHC dissociation reveals that improvement of primary MHC-binding residues can have a minimal, or no, effect on stability. Molecular immunology. 48 (4), 728-732 (2011).
- Lesterhuis, W. J., Schreibelt, G., et al. Wild-type and modified gp100 peptide-pulsed dendritic cell vaccination of advanced melanoma patients can lead to long-term clinical responses independent of the peptide used. Cancer immunology, immunotherapy CII. 60 (2), 249-260 (2011).
- Speiser, D. E., Baumgaertner, P., et al. Unmodified self antigen triggers human CD8 T cells with stronger tumor reactivity than altered antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (10), 3849-3854 (2008).
- Schaft, N., Willemsen, R. A., et al. Peptide fine specificity of anti-glycoprotein 100 CTL is preserved following transfer of engineered TCR alpha beta genes into primary human T lymphocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 170 (4), 2186-2194 (2003).
- Schaft, N., Coccoris, M., et al. An Altered gp100 Peptide Ligand with Decreased Binding by TCR and CD8α Dissects T Cell Cytotoxicity from Production of Cytokines and Activation of NFAT. Frontiers in immunology. 4 (SEP), 270 (2013).
- Madura, F., Rizkallah, P. J., et al. Structural basis for ineffective T-cell responses to MHC anchor residue-improved "heteroclitic" peptides. European journal of immunology. 45 (2), 584-591 (2015).
- Boulter, J. M., Glick, M., et al. Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics. Protein engineering. 16 (9), 707-711 (2003).
- Garboczi, D. N., Utz, U., et al. Assembly, specific binding, and crystallization of a human TCR-alphabeta with an antigenic Tax peptide from human T lymphotropic virus type 1 and the class I MHC molecule HLA-A2. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 157 (12), 5403-5410 (1996).
- Madura, F., Rizkallah, P. J., et al. T-cell receptor specificity maintained by altered thermodynamics. Journal of Biological Chemistry. 288 (26), 18766-18775 (2013).
- Cole, D. K., Rizkallah, P. J., et al. Computational design and crystal structure of an enhanced affinity mutant human CD8 alphaalpha coreceptor. Proteins: Structure, Function and Genetics. 67 (1), 65-74 (2007).
- Benvenuti, M., Mangani, S. Crystallization of soluble proteins in vapor diffusion for x-ray crystallography. Nature protocols. 2 (7), 1633-1651 (2007).
- Leslie, A. G. W., Powell, H. R., et al. Automation of the collection and processing of X-ray diffraction data - a generic approach. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (11), 1924-1928 (2002).
- Kabsch, W.
- Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
- Bailey, S. N. Collaborative Computational Project, N. 4. The CCP4 suite: Programs for protein crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (5), 760-763 (1994).
- McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J.
- Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 60 (12 I), 2126-2132 (2004).
- Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 53 (3), 240-255 (1997).
- DeLano, W. L. The PyMOL Molecular Graphics System. Schrödinger LLC. 1, Available from: http://www.pymol.org (2000).
- Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How Tcrs Bind Mhcs, Peptides, and Coreceptors. Annual Review of Immunology. 24 (1), 419-466 (2006).
- Bianchi, V., Bulek, A., et al. A Molecular Switch Abrogates Glycoprotein 100 (gp100) T-cell Receptor (TCR) Targeting of a Human Melanoma Antigen. Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8951-8959 (2016).
- Matthews, P. C., Koyanagi, M., et al. Differential clade-specific HLA-B*3501 association with HIV-1 disease outcome is linked to immunogenicity of a single Gag epitope. Journal of virology. 86 (23), 12643-12654 (2012).
- Gostick, E., Cole, D. K., et al. Functional and biophysical characterization of an HLA-A* 6801-restricted HIV-specific T cell receptor. European Journal of Immunology. 37 (2), 479-486 (2007).
- Miles, J. J., Bulek, A. M., et al. Genetic and structural basis for selection of a ubiquitous T cell receptor deployed in Epstein-Barr virus infection. PLoS Pathogens. 6 (11), e1001198 (2010).
- Holland, C. J., Rizkallah, P. J., et al. Minimal conformational plasticity enables TCR cross-reactivity to different MHC class II heterodimers. Scientific reports. 2, 629 (2012).
- Kløverpris, H. N., Cole, D. K., et al. A molecular switch in immunodominant HIV-1-specific CD8 T-cell epitopes shapes differential HLA-restricted escape. Retrovirology. 12, 20 (2015).
- Motozono, C., Kuse, N., et al. Molecular Basis of a Dominant T Cell Response to an HIV Reverse Transcriptase 8-mer Epitope Presented by the Protective Allele HLA-B*51:01. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 192 (7), 3428-3434 (2014).
- Motozono, C., Pearson, J. A., et al. Distortion of the major histocompatibility complex class i binding groove to accommodate an insulin-derived 10-mer peptide. Journal of Biological Chemistry. 290 (31), 18924-18933 (2015).
- Cole, D. K., Bulek, A. M., et al. Hotspot autoimmune T cell receptor binding underlies pathogen and insulin peptide cross-reactivity. The Journal of clinical investigation. , (2016).
- Bulek, A. M., Cole, D. K., et al. Structural basis for the killing of human beta cells by CD8(+) T cells in type 1 diabetes. Nature immunology. 13 (3), 283-289 (2012).
- Ekeruche-Makinde, J., Clement, M., et al. T-cell receptor-optimized peptide skewing of the T-cell repertoire can enhance antigen targeting. Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37269-37281 (2012).
- Cole, D. K., Miles, K. M., et al. T-cell Receptor (TCR)-peptide specificity overrides affinity-enhancing TCR-major histocompatibility complex interactions. Journal of Biological Chemistry. 289 (2), 628-638 (2014).
- Cole, D. K., Gallagher, K., et al. Modification of the carboxy-terminal flanking region of a universal influenza epitope alters CD4+ T-cell repertoire selection. Nature communications. 3, 665 (2012).
- Varela-Rohena, A., Molloy, P. E., et al. Control of HIV-1 immune escape by CD8 T cells expressing enhanced T-cell receptor. Nature medicine. 14 (12), 1390-1395 (2008).
- Holland, C. J., Dolton, G., et al. Enhanced Detection of Antigen-Specific CD4+ T Cells Using Altered Peptide Flanking Residue Peptide-MHC Class II Multimers. The Journal of Immunology. 195 (12), 5827-5836 (2015).
- Wooldridge, L., Clement, M., et al. MHC class I molecules with Superenhanced CD8 binding properties bypass the requirement for cognate TCR recognition and nonspecifically activate CTLs. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 184 (7), 3357-3366 (2010).
- Laugel, B., Den Berg, H. A. V. an, et al. Different T cell receptor affinity thresholds and CD8 coreceptor dependence govern cytotoxic T lymphocyte activation and tetramer binding properties. Journal of Biological Chemistry. 282 (33), 23799-23810 (2007).
- Bridgeman, J. S., Sewell, A. K., Miles, J. J., Price, D. A., Cole, D. K. Structural and biophysical determinants of αβ T-cell antigen recognition. Immunology. 135 (1), 9-18 (2012).
- Willcox, B. E., Gao, G. F., et al. TCR binding to peptide-MHC stabilizes a flexible recognition interface. Immunity. 10 (3), 357-365 (1999).
- Borbulevych, O. Y., Piepenbrink, K. H., Baker, B. M. Conformational melding permits a conserved binding geometry in TCR recognition of foreign and self molecular mimics. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 186 (5), 2950-2958 (2011).
- Armstrong, K. M., Piepenbrink, K. H., Baker, B. M. Conformational changes and flexibility in T-cell receptor recognition of peptide-MHC complexes. The Biochemical journal. 415 (2), 183-196 (2008).
