Via röntgenkristallografie, Biophysics en functionele testen om de mechanismen van T-cel-receptorherkenning van kankerantigenen bepalen

Summary

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

Abstract

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Introduction

Röntgenkristallografie is en zal blijven, een zeer krachtige techniek om de aard van ligand-receptor interacties begrijpen. Door visualiseren deze interacties in atomic detail, niet alleen is het mogelijk om de moleculaire mechanismen van vele biologische processen verspreiden, maar het is ook mogelijk de contacten interfaces voor therapeutisch voordeel direct kan wijzigen. In combinatie met technieken zoals oppervlakte plasmon resonantie en isothermische titratie calorimetrie (om maar een paar), dergelijke modificaties kunnen vervolgens worden geanalyseerd om de biofysisch directe invloed op bindingsaffiniteit, interactie kinetiek en thermodynamica beoordelen. Tenslotte door het functioneel experimenten relevante celtypes, een gedetailleerd beeld van de moleculaire en functionele effecten van wijzigingen aan receptor-ligand interacties kunnen worden afgeleid, waardoor specifieke mechanistische informatie. Overall, dit soort werkwijzen atomaire resolutie beeld zodat het ontmoedigen ling van hoe biologische systemen werken, met bijbehorende gevolgen voor diagnostische en therapeutische vooruitgang.

Ons laboratorium gebruikt routinematig deze technieken de receptoren die menselijke T-cel immuniteit tegen pathogenen en kanker bemiddelen in auto-immuniteit bestuderen en tijdens transplantatie. Hier richten we ons op de humane CD8 ⁺ T-celreactie op kanker, gemedieerd door een interactie tussen de T-celreceptor (TCR) en humaan leukocyt antigeen (HLA) -beperkte tumor afgeleide peptiden (Phla). Dit is belangrijk omdat, hoewel CD8 ⁺ T-cellen kunnen richten op kankercellen, hebben wij en anderen eerder aangetoond dat anti-kanker TCRs suboptimaal binden aan hun verwante Phla ^{1, 2.} Zo hebben veel laboratoria geprobeerd wijziging in van de TCR ^{3, 4, 5} of peptide ligand ^6,class = "xref"> ^{7, 8} om de immunogeniteit te verhogen en gerichter kankercellen. Maar deze benaderingen niet altijd effectief en kunnen ernstige bijwerkingen, zoals off-target toxiciteit ^{4, 9, 10} hebben. Verder onderzoek verkennen van de moleculaire mechanismen die T-cel herkenning van kanker antigenen regelen wezenlijk belang zijn voor deze tekortkomingen te overwinnen.

In deze studie hebben we ons gericht op de responsen tegen autologe melanoomcellen door CD8 ⁺ T-cellen specifiek voor een fragment van de melanocyt differentiatie antigeen glycoproteïne 100 (gp100), gp100 _280-288, gepresenteerd door HLA-A * 0201 (de meest -expressed menselijk Phla klasse I). Dit antigen heeft een uitgebreid bestudeerd doelwit voor melanoom immuuntherapie geweest en is ontwikkeld als een zogenaamde "heteroclitic" peptide waarin een alanine vervangt valinevoor anker positie 9 tot Phla stabiliteit ¹¹ te verbeteren. Deze aanpak werd toegepast om de inductie van melanoom-reactieve CTLs in vitro verhogen en is met succes gebruikt in klinische studies ^12. Echter, wijzigingen peptide residuen kunnen onvoorspelbare effecten op T-cel specificiteit aangetoond door de slechte werkzaamheid van de meeste heterolitic peptiden in de kliniek ^{6, 13} hebben. Inderdaad, een heteroclitic vorm van gp100 _280-288, waarin peptiderest Glu3 werd vervangen door Ala, opgeheven erkenning door een polyklonale populatie van _280-288 gp100-specifieke T-cellen ^{14, 15.} We hebben eerder aangetoond dat zelfs kleine veranderingen in peptide ankerresten aanzienlijk kan veranderen T-cel herkenning op onvoorspelbare wijze ^{6, 16.} Zo is de studie concentreerde zich op te bouwening een gedetailleerder beeld van hoe CD8 ⁺ T-cellen herkennen gp100 en hoe wijzigingen van de interactie tussen TCR en Phla zou deze functie beïnvloeden.

Hier genereerden wij zeer zuivere, oplosbare vormen van twee TCR specifiek voor gp100 _280-288 door HLA-A * 0201 (A2-YLE), evenals natuurlijke en veranderde vormen van Phla. Deze reagentia werden gebruikt voor eiwitkristallen genereren om het ternaire atoomstructuur van een mens TCR in complex met de heteroclitic vorm van A2-YLE, en twee van de mutante pHLAs in geligeerde vorm. Vervolgens gebruikten een peptide scanning aanpak het effect van peptide substituenten aan TCR's tonen door het uitvoeren van een grondige biofysische experimenten. Tenslotte, genereerden we een genetisch gemodificeerde CD8 + T-cellijn, geherprogrammeerd één van de A2-YLE specifieke TCR's tot expressie, om functionele experimenten van de biologische effecten van de verschillende peptidemodificaties testen. Deze gegevens tonen aan dat zelfs Modicaties residuen die buiten de TCR bindende motief peptide kan onvoorspelbaar domino-effect op de aangrenzende peptide residuen die teniet TCR binden en T-cel herkenning te hebben. Onze bevindingen vormen het eerste voorbeeld van de structurele onderliggende mechanismen van T-cel herkenning van deze belangrijke therapeutische doel voor melanoma.

Protocol

1. eiwitexpressie

1. Voeg genconstructen voor de productie van oplosbare TCRs en pHLAs, zoals eerder in detail beschreven ^{17, 18.} Ontwerp elk construct met een 5 'BamH1 en een 3' EcoR1 restrictieplaats voor insertie in de vector pGMT7.
2. E. coli Rosetta (DE3) pLysS met pGMT7-afgeleide plasmide vector die de sequentie coderend voor het eiwit van belang door het incuberen van 1 pi van 50-200 ng / ul plasmide met 5 pi van E. coli gedurende 5 minuten bij 4 ° C , 2 min bij 42 ° C en 5 minuten bij 4 ° C en uitplaat nacht bij 37 ° C op een LB-agarplaat aangevuld met 50 mg / l carbenicilline.
3. Pick individuele kolonies en groeien bij 37 ° C en 220 rpm in 30 ml TYP medium (16 g / l trypton, 16 g / l gistextract en 5 g / l HK ₂ O ₄₎ aangevuld met 100 uM carbenicilline totdat de suspensie bereikt een optisch density (OD ₆₀₀₎ tussen 0,4 en 0,6.
4. Induceren eiwitproductie in een 5 ml aliquot door invoering 0,5 mM isopropyl-β-D-1 (IPTG) gedurende 3 uur. Houd 20 pl suspensie met en zonder inductie van natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE) analyse en vlekken op de gel.
5. Voeg starterculturen aan 1 liter TYP gesupplementeerd met 100 uM carbenicilline en groeien cellen zoals hierboven beschreven in stap 1,3 totdat de suspensie een OD ₆₀₀ tussen 0,4 en 0,6 bereikt.
6. Induceren eiwitexpressie gedurende 3 uur met 0,5 mM IPTG. Centrifugeer de cellen gedurende 20 minuten bij 3000 xg en giet het supernatant voorzichtig.
7. Los het pellet in 40 ml lysisbuffer (10 mM Tris, pH 8,1, 10 mM magnesiumchloride, _MgCl2, 150 mM NaCl en 10% glycerol), ultrasone trillingen op ijs gedurende 30 minuten bij 60% vermogen onder toepassing van een 2 s interval en incubeer bij kamertemperatuur (KT) gedurende 30 min met 0,1 g / l DNase.
8. Behandel de suspensioen dat de eiwitten in de vorm van inclusielichamen (IB) met 100 ml wasbuffer (0,5% Triton X-100; 50 mM Tris, pH 8,1, 100 mM NaCl en 10 mM EDTA).
9. Centrifugeer het monster gedurende 20 minuten bij 4 ° C en 8000 x g en giet het supernatant voorzichtig. Resuspendeer de pellet in 100 ml resuspensie buffer (50 mM Tris, pH 8,1, 100 mM NaCl en 10 mM EDTA, pH 8,1), centrifuge zoals voorheen bij 8000 xg en giet het supernatant voorzichtig.
10. Tenslotte los de pellet in 10 ml guanidine buffer (6 M guanidine, 50 mM Tris, pH 8,1, 2 mM EDTA, pH 8,1, en 100 mM NaCl) en meet de eiwitconcentratie bij 280 nm met een spectrofotometer.

2. Phla en TCR hervouwing

1. Voor de Phla refolds, meng 30 mg van HLA-A2 (of HLA-A2 met een biotine label) IB, 30 mg β2m IB en 4 mg van peptide gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een waterbad in een eindvolume van 6 ml guanidine buffer gesupplementeerd met 10 mM dithiothreitol(DTT).
2. Initiëren proteïne hervouwing door verdunning van het voorgaande mengsel in 1 L van een voorgekoeld HLA opvouwen buffer (50 mM Tris, pH 8,1, 400 mM L-arginine, 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM cysteamine en 4 mM cystamine).
3. Laat de HLA hervouwen roeren bij 4 ° C gedurende 3 uur en breng deze in een 12,4 kDa MWCO (molecuulgewicht cut-off) dialysebuis en dialyze tweemaal gedurende 24 h tegen 20 liter 10 mM Tris, pH 8,1.
4. Voor de TCR refolds, meng 30 mg TCR α-keten IB en 30 mg TCR β keten IB gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een waterbad in 6 ml guanidine buffer gesupplementeerd met 10 mM DTT.
5. Initiëren proteïne hervouwing door verdunning van het gedenatureerde TCR mengsel in 1 L van een voorgekoeld TCR opvouwen buffer (50 mM Tris, pH 8,1, 2,5 M ureum, 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM cysteamine en 4 mM cystamine) voor 3 h.
6. Breng het opvouwen in een 12,4 kDa MWCO dialysebuis en dialyze tweemaal gedurende 24 h tegen 20 liter 10 mM Tris, pH 8,1.
7. Filter zowel de Phla of TCR refjarigen met een 0,45 urn membraanfilter voor de zuiveringsstappen.

3. Zuivering door Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)

1. Laad de gefilterde opvouwen preparaat (Phla of TCR) op een 7,9 ml, 50 urn anionenwisselaar kolom vooraf geëquilibreerd met 20 ml 10 mM Tris, pH 8,1 op een flexibele en intuïtieve chromatografiesysteem.
2. Elueer het eiwit op 5 ml / min met een zoutgradiënt (0-500 mM NaCI in 10 mM Tris, pH 8,1, over 8 kolomvolumes) en laat 1 ml fracties.
3. Analyseer de fracties overeenkomend met het gewenste eiwit door SDS-PAGE, bundelen de fracties samen met het eiwit van belang en concentreer ze naar 500 pl met 10-kDa MWCO 20 of 10 kDa MWCO 4 door centrifugatie gedurende 20 minuten bij 4000 xg , gooi de doorstroming.
4. Laad de geconcentreerde eiwit voorbereidingen in een 2 ml injectie lus naar een 24 ml size exclusion chromatografie kolom vooraf in evenwicht gebracht met de appropriate elutiebuffer: fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), HBS (10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA en 0,005% surfactant) of kristal buffer (10 mM Tris, pH 8,1, en 10 mM NaCl ).
5. Elueer het eiwit met een debiet van 0,5 ml / min via 1 kolomvolume; laat 1 mL fracties die het gewenste eiwit bevestigd door SDS-PAGE.
   Opmerking: Deze methoden zijn gebruikt om oplosbare PMEL17 TCR en gp100 TCRs, evenals alle in deze studie gebruikte pHLAs genereren: HLA-A * 0201 met YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 7A), of YLEPGPVAA (A2-YLE-8A).

4. Surface Plasmon Resonance (SPR) Analyse

1. Voer-equilibrium binding analyse of thermodynamische analyse met behulp van een moleculaire interactie analysesysteem uitgerust met een CM5 sensorchip ^19.
2. Activeer de CM5 chip door fgende een 1: 1 mengsel van 100 mM N-hydroxysuccinimide (NHS) en 400 mM 1-ethyl-3- (3-dimethylpropyl) -carboiimide (EDC) gedurende 10 min bij een stroomsnelheid van 10 pl / min en bij 25 ° C.
3. Load ongeveer 5000 respons eenheden (RU) van streptavidine (110 pl 200 ug / ml in 10 mM acetaat, pH 4,5) door covalente koppeling van het chip oppervlak in vier stroom-cellen en gebruik 100 pl 1 M ethanolamine hydrochloride deactiveren resterende reactieve groepen.
4. Paar 500-600 RU van Phla op ~ 1 uM in commerciële buffer (geleverd door de fabrikant), aan de CM5 sensor chip met een lage stroomsnelheid van 10 pl / min om een ​​gelijkmatige verdeling op het chip oppervlak te verkrijgen.
5. Verzadigen chip oppervlak met 1 mM biotine in commerciële buffer (geleverd door de fabrikant) gedurende 60 s.
6. Injecteer tien seriële verdunningen van oplosbare TCRs via desbetreffende stroom-cellen bij een hoog debiet van 30 ul / min bij 25 ° C.
7. Bereken de-equilibrium bindingsconstante(K _D (E)) waarden met behulp van een niet-lineaire curve fit (y = (P1X) / (P2 + x)) ^20.
   LET OP: y = reactie units, x = analist concentratie, P1 = r _max, P2 = K _D.
8. Voer kinetiek analyse uitgaande van een 1: 1 Langmuir binding en passen bij de gegevens met behulp van een globale-fit-algoritme in het softwarepakket ^2.
9. Uitvoeren thermodynamica experimenten door herhaling van deze werkwijze op de volgende temperaturen: 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C en 30 ° C ^19.
10. Gebruik de _KD-waarden bepaald door SPR bij verschillende temperaturen tot Ag berekenen ° met behulp van de standaard thermodynamische vergelijking (Ag ° = -RTlnK _D) ^19.
    LET OP: R = gasconstante, T = temperatuur in K, ln = natuurlijke log.
11. Bereken de thermodynamische parameters volgens de Gibbs-Helmholtz vergelijking (Ag ° = AH - TΔS °) ^19.
12. Plot de binding vrije energieën, Ag ° (Ag ° = -RTlnK _D) tegen temperatuur (K) met behulp van een niet-lineaire regressie om de drie-parameter vergelijking passen (y = AH + ΔCp * (x-298) -x * ΔS- x * ΔCp * ln (x / 298)) ^19.
    LET OP: y = temperatuur in K, x = Ag °.

5. Isotherme Titratie Calorimetrie (ITC)

1. Voeren ITC experimenten met een isothermische titratie calorimeter. Injecteren 30 uM Phla in de caloriemeter cel en de belasting 210 uM oplosbare TCR in de spuit. Gebruik de volgende voorwaarden buffer: 20 mM Hepes (pH 7,4) bevattende 150 mM NaCl.
2. Voer 20 TCR injecties, elk van een 2 pl volume. Bereken AH en K _D met behulp van analytische software.

6. Kristallisatie, Diffraction Data Collection, en verfijning van modellen

1. Voeren kristallisatie proeven met een kristallisatie-robot.
2. Grow kristallen door vapof diffusie bij 18 ° C via de zittende druppel techniek in een 96-wells plaat met een reservoir bevattende 60 pl kristallisatie buffer (moederloog) ^21.
3. Concentreer het oplosbare Phla tot ongeveer 10 mg / ml (0,2 mM) in kristallijne buffer door het draaien bij 3000 xg in een 10-kDa molecuulgewicht cut-off centrifugale concentrator.
4. Voor de co-complexe structuren, meng de TCR en Phla op een 1: 1 molaire verhouding tot een eiwitoplossing bij ongeveer 10 mg / ml (0,1 mM) te verkrijgen.
5. Voeg 200 nL van Phla alleen, of 1: 1 molaire mengverhouding van TCR en Phla tot 200 nL van elk reservoir oplossing uit de kristallisatie-scherm met een kristallisatie robot en scoren voor kristallen onder een microscoop na 24 uur, 48 uur, 72 h, en dan een keer per week.
6. Harvest enkele kristallen door ze handmatig montage in cryo-lussen onder een microscoop en cryo-koelen hen door onderdompeling en ze op te slaan in vloeibare stikstof (100 K).
   LET OP: Het laden van kristallen duurt een beetje pracTice, en beslissen welke kristallen goed genoeg is voor het verzamelen van gegevens wordt geleverd met ervaring. Als vuistregel geldt, hoe groter en regelmatiger de kristallen, hoe beter.
7. Gegevens verzamelen in een stroom stikstofgas bij 100 K.
   LET OP: Deze gegevens werden verkregen op de Diamond Light Source (DLS) nationale synchrotron wetenschap faciliteit in het Verenigd Koninkrijk.
8. Analyseer de gegevens die door het schatten van de reflectie intensiteiten met xia2 met behulp van zowel MOSFLM ²² en XDS pakketten ^23, en vervolgens de schaal van de data met SCALA of doelloos ²⁴ en de CCP4 pakket ^25.
9. Het oplossen van de structuren met moleculaire vervanging met behulp van PHASER ^26.
10. Pas het model met KOET ²⁷ en verfijnen van het model met REFMAC5 ^28.
11. Bereid grafische voorstellingen met PyMOL ^29.
12. Bereken de contacten die met behulp van de "contact"programma in het CCP4-pakket. Gebruik een 4 een cut-off voor van der Waals contacten en een 3,4 een cut-off voor waterstofbruggen en zout bruggen.
13. Bereken oppervlak complementariteit met behulp van het programma "SC" in de CCP4 pakket.
14. Bereken de kruisingshoek van het TCR-complex Phla, zoals beschreven ^30.
    LET OP: Voor deze studie werden de reflectie data en laatste model coördinaten neergelegd bij de VOB database (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-YLE-3A PDB: 5EU4 en A2 -YLE-5A PDB: 5EU5).

Results

Volgens de hierboven beschreven werkwijzen, genereerden we oplosbare TCR (Tabel 1) en Phla moleculen wordt grondig moleculaire analyse van gp100 _280-288 herkenning door CD8 ⁺ T-cellen. Een gemodificeerde E. coli expressiesysteem gebruikt werd om onoplosbare IB genereren voor elke afzonderlijke keten van zowel TCR's (α en β-ketens) en pHLAs (α-keten en β2m). Deze methode heeft het voordeel dat het relatief goedkoop en makkelijk op te zetten en genereert grote opbrengsten van eiwit (100-500 mg / l cultuur). Ook de onoplosbare eiwitten zijn zeer stabiel indien bewaard bij -80 ° C. Vervolgens gebruikten een gevestigde opnieuw vouwen en zuiveringstechniek functionele homogeen oplosbare eiwitten te genereren. Deze werkwijze is nuttig om eiwitten biofysische structurele en cellulaire experimenten en reagentia die kunnen worden gebruikt voor diagnose of therapie.

Hier gebruikten we deze eiwitten alanine scan mutagenese experimenten in de peptide hoofdketen en geëvalueerd TCR bindingsaffiniteit via oppervlakte plasmon resonantie (SPR) experimenten (Tabel 2). Deze test toonde waarin resten in het peptide waren het meest belangrijk zijn voor TCR binden. Hoge-resolutie analyses van bindingsaffiniteiten gebruik van deze techniek zijn zeer nuttig voor het bepalen van biologische mechanismen die eiwit-eiwit interacties regelen, en voor het analyseren van de bindingsaffiniteit van therapeutische moleculen.

Vervolgens gekristalliseerd een melanoom-specifieke oplosbare TCR (PMEL17 TCR) in complex met een gemodificeerde tumor-afgeleide Phla (A2-YLE-9V) de binding modus bij atomaire resolutie (figuren 1 en 2 en Tabel 3) onderzocht. Deze experimenten directe visualisatie van de bindingsinterface tussen twee moleculen, providing belangrijke informatie over de onderliggende beginselen van de interactie. We voerden een verdere thermodynamische analyse van de interactie met beide SPR en ITC, waaruit de energetische bijdragen die nodig binding (figuur 3). Deze analyses werden verder ondersteund door een hoge-resolutie beschrijving van de voetafdruk contact tussen de twee eiwitten (Figuur 4 en Tabel 4).

Vervolgens hebben we opgelost de structuur van geligeerde Phla moleculen, de presentatie van gemuteerde vormen van het peptide, waaruit blijkt dat een moleculaire schakelaar zou kunnen verklaren waarom bepaalde mutaties ingetrokken TCR binding (figuur 5).

Over het algemeen, deze technieken verschaft nieuwe gegevens waaruit het mechanisme uit te leggen hoe T-cellen herkennen een melanoom afgeleide antigen dat is een belangrijk doelwit voor anti-kanker therapeutica. Meer in het algemeen, deze techniekenkan worden gebruikt voor vrijwel elke receptor-ligand interactie te onderzoeken, blootleggen nieuwe biologische mechanismen die kunnen worden gericht voor nieuwe therapeutische vooruitgang.

Figuur 1: Dichtheid Plot Analysis. De linkerkolom toont weglaten kaarten waarin het model bij afwezigheid van het peptide werd verfijnd. Verschil dichtheid is vormgegeven op 3,0 sigma, zijn positieve contouren in het groen, en de negatieve contouren zijn rood. De rechterkolom toont de waargenomen kaart op 1,0 sigma (weergegeven als een grijze mesh rond stok voorstellingen van de eiwitketens) na het daaropvolgende verfijning met behulp van automatische niet-kristallografische symmetrie beperkingen door REFMAC5 toegepast. (A) Het model voor PMEL17 TCR-A2-YLE-9V de TCR CDR3 lussen blauw gekleurde (α-keten) en oranje (β keten) en het peptide in groen. (B) Het model voor A2-YLE methet peptide gekleurd donkergroen. (C) Het model voor A2-YLE-3A met het peptide oranje gekleurd (voor A2-YLE-3A, waren er 2 moleculen in de asymmetrische eenheid, maar deze waren vrijwel identiek in termen van weglaten en dichtheid kaarten, dus alleen kopiëren 1 is hier afgebeeld). (D) Het model voor A2-YLE-5A met het peptide gekleurde roze. Met toestemming overgenomen uit referentie ^31. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Overzicht van de PMEL17 TCR in complex met A2-YLE-9V. (A) Cartoon voorstelling van de PMEL17 TCR-A2-YLE-9V complex. De TCR is zwart gekleurd; TCR CDR lussen worden getoond (rood, CDR1α, donkergroen, CDR2α, blauw, CDR3α, geel, CDR1β, aqua, CDR2 ^6 ;; orange, CDR3β); en het HLA-A * 0201 is weergegeven in grijs. De YLE-9V peptide wordt vertegenwoordigd door groene sticks. (B) Surface en plak voorstellingen van residuen van de PMEL17 TCR CDR-lussen (kleurcode als in A), die contact opnemen met de A2-YLE oppervlak (A2, grijs, YLE-9V, groen sticks). De zwarte diagonale lijn geeft de kruisingshoek van de TCR ten opzichte van de lengteas van de YLEPGPVTV peptide (46,15 °). (C) Neem een voetafdruk van de PMEL17 TCR op de A2-YLE-9V oppervlak (A2, grijs); paars en groen (oppervlak en stokken) geven de HLA-A * 0201 en YLE residuen respectievelijk benaderd door de gp100 TCR. Cut-off van 3,4 Å voor waterstofbruggen en 4 A voor van der Waals contacten. Overgenomen met toestemming van referentie 31. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Thermodynamische analyse van de PMEL17 TCR-A2-YLE interactie. (A) PMEL17 TCR-equilibrium binding reacties op A2-YLE op 5, 12, 18, 25 en 37 ° C in negen tot tien TCR seriële verdunningen. SPR ruwe en vaste gegevens (als 1: 1 Langmuir binding) getoond in de inzet van elke curve en werden gebruikt voor K _berekenen en _Koff waarden een integrale fit-algoritme (BIAevaluation 3.1). De tabel toont-equilibrium binding (K _D (E)) en kinetische-bindende constanten (K _D (K) = K _uit / K _aan) bij elke temperatuur. Het evenwicht bindingsconstante (K _D, uM) werden waarden berekend met behulp van een niet-lineaire fit (y = (P1X) / (P2 + x)). (B) De thermodynamische parameters werden berekend volgens de Gibbs-Helmholtz vergelijking (Ag ° AH = ° - TΔS °). De binding vrije energieën, Ag ° (Ag ° = -RTlnK _D) werden uitgezet tegen temperatuur (K) met behulp van een niet-lineaire regressie om de drie-parameter vergelijking passen (y = AH ° + ΔCp ° * (x-298) -x * AS ° -x * ΔCp ° * ln (x / 298)). Enthalpie (AH °) en entropie (TΔS °) bij 298 K (25 ° C) getoond in kcal / mol en werden berekend door niet-lineaire regressie van de temperatuur (K) uitgezet tegen de vrije energie (Ag °). (C) Isotherme calorimetrische titratie (ITC) metingen van de PMEL17 TCR-A2-YLE interactie. Enthalpie (AH °) en entropie (TΔS °) bij 298 K (25 ° C) getoond in kcal / mol. Met toestemming overgenomen uit referentie ^31. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ong> Figuur 4: De PMEL17 CDR Loops Focus op Peptide Residuen Pro4, Val7 en Thr8. (A) Schematische weergave van de contacten tussen de YLE-9V peptide en PMEL17 lus CDR residuen (kleurcodering in figuur 2A). De getallen onder aan het paneel tonen de totale contacten tussen TCR en het peptide. (B) De contacten tussen de PMEL17 TCR en de YLE-9V peptide (groen sticks) met de van der Waals contacten (zwarte stippellijnen) en waterstofbruggen (rode stippellijnen), gemaakt door de TCR CDR3α (blauw), CDR1β (geel) , CDR2β (aqua), en CDR3β (oranje) loops. In het onderste paneel is een close-up van de contacten tussen YLE Pro4, Val7 en Thr8, respectievelijk, en TCR CDR loop residuen (stokken kleurcodering zoals in figuur 1A). Cut-off van 3,4 Å voor waterstofbruggen en 4 A voor van der Waals contacten. Met toestemming overgenomen uit referentie ^31.rge.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Conformatieveranderingen Vergelijking van YLE, YLE-3A en A2-YLE-5A peptiden gepresenteerd door HLA-A * 0201. (A), YLE (donkergroen sticks) en YLE-3A (oranje sticks) peptide uitlijning door overlapping van HLA-A * 0201 α1 helix (grijs cartoon). Boxed residuen geven de mutatie van Glu3 in een alanine. De inzetstukken laten zien hoe de Glu3Ala vervanging veroorzaakt een verschuiving in de stand (zwarte pijl) van de buurman residu Pro4 in de A2-YLE-3A structuur ten opzichte van de A2-YLE structuur. (B), YLE (donkergroen sticks) en YLE-5A (roze sticks) peptide uitlijning door overlapping van HLA-A * 0201 α1 helix (grijs cartoon). De boxed residuen geven de mutatie van glycine 5 in een alanine. Overgenomen met toestemming van de hand ^{31. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.}

TCR	CDR1α	CDR2α	CDR3α	CDR1β	CDR1β	CDR1β
PMEL17	DSAIYN	IQSSQRE	CAVLSSGGSNYKLTFG	SGHTA	FQGTGA	CASSFIGGTDTQYFG
gp100	TSINN	IRSNERE	CATDGDTPLVFG	LNHDA	SQIVND	CASSIGGPYEQYFG
MPD	KALYS	LLKGGEQ	CGTETNTGNQFYFG	SGHDY	FNNNVP	CASSLGRYNEQFFG
296	DSASNY	IRSNVGE	CAASTSGGTSYGKLTFG	MNHEY	SMNVEV	CASSLGSSYEQYFG

Tabel 1: Aanpassing van TCR CDR3 regio's van PMEL17, gp100, MPD en 296 gp100-specifieke TCRs. Met toestemming overgenomen uit referentie ^31.

peptidesequentie	peptide	PMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3 Affinity K D	gp100 TCR TRAV17 TRBV19 Affischap K D
YLEPGPVTA	YLE	7,6 ± 2 micrometer	26,5 ± 2,3 uM
YLEPGPVT V	YLE-9V	6,3 ± 1,2 uM	21,9 ± 2,4 uM
Een LEPGPVTA	YLE-1A	15,9 ± 4,1 uM	60,6 ± 5,4 uM
YL A PGPVTA	YLE-3A	geen bindende	geen bindende
YLE Een GPVTA	YLE-4A	19,7 ± 1,3 uM	144,1 ± 7,8 uM
YLEP Een PVTA	YLE-5A	> 1 mM	> 1mM
YLEPG Een VTA	YLE-6A	11,4 ± 2,7 uM	954,9 ± 97,8 uM
YLEPGP Een TA	YLE-7A	31,1 ± 4 uM	102,0 ± 9,2 uM
YLEPGPV A A	YLE-8A	38,1 ± 7,4 uM	121,0 ± 7,5 uM

Tabel 2: Affinity Analyse _(KD) van PMEL17 TCR en gp100 TCR aan gp100 _280-288 peptide varianten. Met toestemming overgenomen uit referentie ^31.

parameters	PMEL17 TCR-A2-YLE-9V	A2-YLE	A2-YLE-3A	A2-YLE-5A
PDB code </ Strong>	5EU6	5EU3	5EU4	5EU5
dataset statistieken
Space groep	P1	P1 21 1	P1	P1 21 1
Unit cel parameters (A)	a = 45,52, b = 54,41, c = 112,12, a = 85,0 °, b = 81,6 °, g = 72,6 °	a = 52,81, b = 80,37, c = 56,06, b = 112,8 °	a = 56,08, b = 57,63, c = 79,93, a = 90,0 °, b = 89,8 °, g = 63,8 °	a = 56,33, b = 79,64, c = 57,74, b = 116,2 °
stralingsbron	DIAMOND I03	DIAMOND I03	DIAMOND I02	DIAMOND I02
Golflengte (A)	0,9763	0,9999	0,9763	0,9763
measuresolutie rood range (A)	51,87-2,02	45,25-1,97	43,39-2,12	43,42-1,54
Outer Resolutie Shell (A)	2,07-2,02	2,02-1,97	2,18-2,12	1,58-154
reflectie waargenomen	128.191 (8955)	99.442 (7056)	99.386 (7463)	244.577 (17.745)
unieke reflecties	64.983 (4785)	30.103 (2249)	49.667 (3636)	67.308 (4962)
Volledigheid (%)	97,7 (96,7)	98,5 (99,3)	97,4 (96,7)	99,6 (99,9)
Veelheid	2,0 (1,9)	3.3 (3.1)	2,0 (2,1)	3,6 (3,6)
I / Sigma (I)	5,5 (1,9)	7,2 (1,9)	6,7 (20,3)	13 (2,3)
Rpim (%)	5,7 (39,8)	8,8 (44,7)	8,7 (41,6)	4,5 (35,4)
R merge (%)	7,8 (39,6)	9,8 (50,2)	8,7 (41,6)	5,0 (53,2)
verfijning statistieken
Resolutie (A)	2.02	1.97	2.12	1.54
Geen reflecties gebruikt	61.688	28557	47.153	63875
Geen reflectie in Rfree set	3294	1526	2514	3406
R kri (geen cut-off) (%)	18.1	19.7	17.2	17.0
R gratis	22.2	25.5	210,1	20.1
Kwadratische gemiddelde afwijking van de ideale geometrie
Bond lengtes (A)	0,018 (0,019) *	0,019 (0,019) *	0.021 (0.019) *	0,018 (0,019) *
Bond hoeken (°)	1.964 (1.939) *	1.961 (1.926) *	2.067 (1.927) *	1.914 (1.936) *
Overall coördineren fout (A)	0,122	0,153	0,147	0,055
Ramachandran Statistieken
meest begunstigde	791 (96%)	371 (98%)	749 (99%)	384 (98%)
toegestaan	32 (4%)	6 (2%)	10 (1%)	5 (1%)
uitschieters	2 (0%)	3 (1%)	1 (0%)	2 (0%)

Tabel 3: Vermindering en Verfijning Statistiek (moleculaire vervanging). Met toestemming overgenomen uit referentie ^31. De waarden tussen haakjes zijn voor de hoogste resolutie schelp.

HLA / peptide residuen	TCR residu	No. VDW (≤4Å)	No. H-obligaties (≤3.4Å)
Gly62	αGly98	3
	αSer99	1
Arg65	αSer99	2
Arg65 O	αAsn100 Nδ2	2	1
Arg65 NH1	βAsp58 Oδ2		1
	βSer59	8
Lys66	αGly98	1
	αSer99	4
	αAsn100	4
Ala69	αAsn100	2
	βAla56	2
Gln72 Nε2	βGln51 O	3	1
	βGly54	7
	βAla55	1
Thr73	βGln51	1
Val76	βGln51	3
	βGly52	2
Lys146	βPhe97	3
	βIle98	3
Ala150	βIle98	1
	βAsp102	3
Val152	βIle98	1
Glu154	αTyr32	1
Gln155 N	αTyr32 OH	4	1
Gln155 Oε1	βThr101 N	10	1
Tyr1 OH	αGly97 O	1	1
	αGly98	1
	αSer96	1
Glu3	αTyr101	1
Pro4	αSer96	1
	αSer99	1
	αAsn100	4
Pro4 O	αTyr101 N	14	1
Gly5	αTyr101	3
	βGly100	2
Val7	βIle98	7
	βGly99	2
	βGly100	2
Thr8	βThr31	5
	βGln51	1
	βPhe97	1
Thr8 N	βIle98 O	6	1

Tabel 4: PMEL17 TCR-A2-YLE-9V Contact tafel. Met toestemming overgenomen uit referentie ^31.

Discussion

De hier geschetste protocollen bieden een kader voor de moleculaire en cellulaire ontleding van T-cel responsen in het kader van een ziekte bij de mens. Hoewel kanker was het doel van dit onderzoek hebben we zeer soortgelijke processen voor T-celreacties op virussen ^{32, 33, 34, 35,} onderzoeken ^{36, 37} en bij auto-immuniteit ^{38, 39, 40.} Verder hebben we deze technieken breder de moleculaire principes die T-cel antigen herkenning ^{2, 19, 41, 42} beheersen begrijpen. Inderdaad, de onvoorspelbaarheid van wijzigingen residuen peptide, zelfs diebuiten de van de TCR contactresten, impacts T-cel herkenning heeft belangrijke implicaties voor het ontwerp van heteroclitic peptiden. Deze bevindingen hebben rechtstreeks bijgedragen aan de ontwikkeling van nieuwe T-celtherapie, waaronder peptide vaccins ^{6, 43} en kunstmatig hoge affiniteit TCR's ^{3, 4, 5, 20, 44,} alsmede verbeterde diagnostische ^{45, 46, 47.}

Kritische stappen in het protocol
Het genereren van een zeer zuiver, functioneel eiwit essentieel voor al de in dit document aangegeven methoden.

Wijzigingen en het oplossen van problemen
Moeilijkheden bij het genereren van zeer zuivere eiwitten hebben vaak betrekking op de expressie van zeer-Pure, onoplosbare IB van de E. coli expressiesysteem. Gewoonlijk modificeren van de expressie protocol (bijvoorbeeld het induceren van verschillende optische dichtheden, met verschillende E. coli-stammen, of verschillende media formaties) lost deze problemen.

Beperkingen van de techniek
Deze technieken oplosbare eiwitmoleculen (TCR en Phla) die normaal tot expressie worden gebracht op het celoppervlak. Aldus is het belangrijk dat structurele / biofysische bevindingen komen overeen met cellulaire benaderingen biologische betekenis bevestigen.

Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / alternatieve methoden
Met behulp van röntgenkristallografie en biofysica onderbouwd door de functionele analyse hebben wij en anderen aangetoond dat TCR specifiek zijn voor kanker epitopen algemeen gekenmerkt door lage bindingsaffiniteiten ^48. Deze lage TCR affiniteit kan helpen verklaren waarom T-cellen are nature niet effectief in clearing kanker. Hoge-resolutie atoomstructuren van complexen tussen anti-kanker TCRs en verwante tumorantigenen beginnen de moleculaire basis voor deze zwakke affiniteit tonen. Bovendien zijn deze studies zijn nuttig voor het bepalen van de mechanismen die de therapeutische interventies om dit probleem te overwinnen grondslag liggen, zaaien toekomstige verbeteringen ^16. In dit onderzoek onderzochten we de eerste structuur van een natuurlijk voorkomend αβTCR in complex met een gp100 HLA-A * 0201-beperkte epitoop melanoom. De structuur, in combinatie met een diepgaand biofysische onderzoek bleek de totale bindingsmodus van de interactie. Wij ontdekt ook een onverwachte moleculaire schakelaar, die zich in een gemuteerde vorm van het peptide, dat ingetrokken TCR binding (bepaald met oppervlakte plasmon resonantie) en CD8 ⁺ T-cel herkenning (functionele experimenten). Was het alleen mogelijk om dit nieuwe mechanisme van HLA antigen Presentat tonenover het gebruik van hoge-resolutie methoden beschreven.

Toekomstige toepassingen of aanwijzingen na het beheersen van deze techniek
Overall, onze resultaten tonen het vermogen van röntgenkristallografie en biofysische werkwijzen in combinatie met krachtige functionele analyses. Met behulp van deze benaderingen kan men ontleden precieze moleculaire mechanismen die T-cel antigen herkenning regelen. Inderdaad is het ook mogelijk om deze benadering te gebruiken om de structuur van geligeerde TCRs lossen, zien hoe conformatieveranderingen een rol kan spelen tijdens antigen discriminatie ^{49, 50, 51.} Een beter begrip van de zeer complexe en dynamische karakter dat TCR-Phla interacties ten grondslag ligt heeft ook duidelijke implicaties voor therapie design. In staat zijn om direct te 'zien' de moleculen die worden therapeutisch gericht zijn, evenals het effect dat wijzigingen hebben op antigen recognition, zal duidelijk verbeteren van de ontwikkeling van deze geneesmiddelen voor de toekomst. In deze studie tonen we aan dat zelfs veranderingen in een enkel peptide residu dat niet sterk wordt aangegrepen door een TCR onvoorspelbaar structurele wijzigingen van andere resten in de HLA-gebonden peptide, die op zijn beurt verandert dramatisch T-cel herkenning kan uitzenden. Een meer volledig begrip van de moleculaire mechanismen toegepast tijdens T-cel-antigeen herkenning zal grote voordelen bij het ontwerpen toekomstige therapieën voor een breed spectrum van menselijke ziekten.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
S.O.C. media	Invitrogen
Orbi-Safe New Orbit incubator	Sanyo
carbenicillin	Sigma
IPTG	Fisher
Quick Coomassie Stain SafeStain	Generon
Legend RT centrifuge	Sorvall
Tris	Fisher
magnesium chloride	Arcos
NaCl	Fisher
glycerol	Sigma-Aldrich
Sonopuls HD 2070	Bandelin
DNAse	Fisher
Triton	Sigma-Aldrich
EDTA	Fisher
guanidine	Fisher
NanoDrop ND1000	Thermo
Peptides	Peptide Protein Research
dithiothreitol	Sigma-Aldrich
L-arginine	SAFC
cysteamine	Fisher
cystamine	Fisher
dialysis tubing	Sigma-Aldrich
urea	Sigma-Aldrich
Metricel 0.45 μm membrane filter	Pall
POROS 10/100 HQ	Applied biosystems
ÄKTA pure FPLC system	GE Healthcare Life Sciences
10 kDa MWCO Vivaspin 20	Sartorius
10 kDa MWCO Vivaspin 4	Sartorius
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare Life Sciences
Phosphate Buffer Saline	Oxoid
BIAcore buffer HBS	GE Healthcare Life Sciences
Biotinylation kit	Avidity
BIAcore T200	GE Healthcare Life Sciences
CM5 chip coupling kit	GE Healthcare Life Sciences
streptavidin	Sigma-Aldrich
Microcal VP-ITC	GE Healthcare Life Sciences
Hepes	Sigma-Aldrich
Gryphon crystallisation robot	Art Robbins Instruments
Intelli-plate	Art Robbins Instruments
Crystallisation screens and reagents	Molecular Dimensions
75 cm2 flask	Greiner Bio-One
0.22 μm filters	Miller-GP, Millipore
Ultra-Clear ultracentrifuge tube	Beckman Coulter
Optima L-100 XP with SW28 rotor	Beckman Coulter
CD8 microbeads	Miltenyi Biotec
anti-CD3/CD28 Dynabeads	Invitrogen
anti-PE microbeads	Miltenyi Biotec
CK medium, PHA	Alere Ltd
anti-TCRVβ mAb	BD
dasatinib	Axon
MIP-1β and TNFα ELISA	R&D Systems
51Cr	PerkinElmer
1450 Microbeta counter	PerkinElmer