Introduction
Lärande bygger på bildandet av minne spår och deras underhåll. Det är allmänt accepterat att en bakomliggande mekanismen kan representera en aktivitetsberoende bildandet av nya och / eller omfördelning av befintliga synaptiska kontakter mellan nervceller. På molekylär nivå har olika proteinmodifieringar, subcellulära relocalizations och förändringar i omsättningen av synaptiska proteiner har beskrivits 1-4 (Lamprecht, 2004 # 8). De flesta studier hittills fokuserat på utvalda proteiner snarare än på den globala men komplexa synaptiska Proteome komposition. Föreliggande tillvägagångssätt gör en opartisk screening för synaptiska Proteome förändringar i mus hjärnregioner efter en inlärningsexperiment. Den är lämplig för att göra time-point osjälvständiga molekylära ögonblicksbilder av lärande-inducerad omorganisation av den synaptiska arkitektur. Den beskrivna arbetsflödet kräver en särskild lagarbete av olika specialister i djurens beteende, proteinbiokemi, masspektrometri och Biolnformatics.
Den valda lärande paradigm, dvs. frekvensmodulerade tonen diskriminering (FMTD), är en väl karakteriserad auditiv diskriminering uppgift i gnagare 5. Lärande och långtidsminnet bildning i denna buss rutan Go / No-Go-uppgift innebär mekanismer beroende på ökad kortikal dopaminsignaler och proteinsyntes. Följaktligen senaste proteomik studier på gerbiler och möss avslöjade dopamin- och lärande-inducerad plast omdisponeringar av synaptiska komponenter i kortikal, men också i mer basala hjärnregioner som förmodligen interagerar under FMTD inlärning och minne 6-8. Detta visar att minnesbildning innebär ett komplext samspel av olika områden i hjärnan och därmed kan differentiellt regleras inom dessa områden på proteomet nivå. Därför är dissekering av utvalda kortikala och subkortikala mus hjärnregioner som ingår i arbetsflödet.
Vidare tillförlitlig characterizatiom även av svaga förändringar i synaptiska proteinsammansättning kräver en anrikning av pre-och postsynaptiska fack snarare än analys av homogen eller råa membranfraktioner 9. Därför framställning av synaptosomer med utnyttjande etablerade protokoll före proteomik analys beskrivs i syfte att höja nivån upptäckt och det dynamiska omfånget för synaps specifika proteiner 10,11.
En viktig förutsättning för att använda etikettfria högupplösande masspektrometri för kvantitativa ändamål är en hög grad av likhet av proteinprover. Som ganska små förändringar i synaptiska proteinsammansättning förväntas inträffa efter lärande, en etikett-fri strategi kommer att vara lämpligt att jämföra motsvarande proteinprover som erhållits från utbildade och naiva möss. Alternativt sjukdomsspecifika etikett strategier proteiner / peptider med hjälp av stabila isotoper (t.ex. TMT, iTRAQ, ICPL och SILAC) samt MS2-baserade etikett fri quantification (LIETAG) är användbara, men de är dyrare än den valda etiketten fria metod eller behöver speciell massa hårdvara spektrometrisk.
Eftersom proteomik visningar ofta ger komplexa datamängder, är bioinformatik behandling rekommenderas för lämplig tolkning av data. Ytterligare meta-analyser kan stödja en bättre förståelse av potentiella molekylära mekanismerna bakom paradigm relaterade förändringar och identifiering av berörda viktiga cellulära processer och signalvägar. Lämpliga metoder beskrivs också nedan.
Protocol
Alla förfaranden, inklusive djurförsök har utförts i enlighet med bestämmelserna i den tyska lagen, respektive EU-regler och NIH riktlinjer och har godkänts av den etiska kommittén för Landesverwaltungsamt Sachsen / Anhalt (42502-2-1102 IFN).
1. Auditory Learning
- Lärande Auditory diskriminering i skytteltrafik rutan (FMTD paradigm) Obs: Använd alltid handskar vid hantering mössen.
- Hus C57BL6 / J-möss i grupper om tre eller fyra med fri tillgång till mat pellets och kranvatten i klar polykarbonat burar. Upprätthålla en 12 timmar ljus: mörker-cykel i djuranläggningen. Om djur tas emot från en annan labb eller från ett företag att minst en veckas acklimatisering och bosatte sig i.
- Utför en transferlåda träningspass per dag.
- Ta musen från sitt hem bur i djuranläggningen och placera den i ett svagt upplyst transferlåda i en ljudisolerade kammare.
- Använd en helt datorstyrd lärande schema för lärande auditiv diskriminering. Börja med en tillvänjningsperiod på tre minuter av tystnad, och sedan starta träningspasset.
- Använd sekvenser av stigande ton (4-8 kHz, CS +) som Go-stimulus under Go-prövningar: Djuret måste korsa hindret inom 6 sekunder av tonen presentation (rätt svar, slå). Straffa en miss av en mild fot-chock av 50 - 300 iA, levereras via gallergolvet av skytteln rutan.
- Använd sekvenser av fallande ton (8-4 kHz, CS-) som No-Go-stimulus under no-go-prövningar: Djuret måste stanna kvar i nuvarande utrymme skytteln rutan under 6 sekunder av tonen presentation. Straffa en falsklarm av en mild fot-chock av 50 - 300 iA, levereras via gallergolvet av skytteln rutan.
- Använd intertrial intervall av 20 5 sek.
- Utför 30 Go-prövningar och 30 no-go-försök per session i en pseudo-randomiserad ordning, så att en session består av 60 försök och varar ca 25 min.
- Sätt utbildad djuret tillbaka till sin hemma bur i djuranläggningen.
- hjärnan dissektion
- Avliva djuret vid önskad tidpunkt efter ett önskat antal träningspass med hjälp av halsdislokation (t.ex. 24 timmar efter slutförandet av den första sessionen). Decapitate djuret.
- Snabbt dissekera hjärnan via följande steg: Skär först huden och sedan skallen med raka sax längs Sutura sagittalis. Helt ta bort de delar av benet som täcker hjärnvävnaden med hjälp av starka pincett. Ta ut hjärnan med en spattle.
- För dissekering, placera hjärna på en petriskål fylld med is. Dissekera hörselbarken, frontala cortex, striatum och hippocampus under ett stereomikroskop under användning av en skalpell och en nål.
- Lokalisera hörselbarken med hjälp av visuella landmärken på hjärnansurface såsom blodkärl och formen på ytan (Bregma -2,06 till -3,4, storleks rostrocaudal 2 mm, dorsoventral 1,3 mm) och bilateralt dissekera som en rektangulär vävnadsblock med tjockleken av hjärnbarken.
- Dissekera frontala cortex som en hjärna skiva mellan bregma 3,56 och 1,54 med hjälp av chiasma Opticum som ett landmärke och exklusive vävnad från bulbus olfactorius.
- Dissekera striatum som en hjärna skiva mellan bregma 1,54 och 0,5 och försiktigt bort kortikal vävnad.
- Dissekera hippocampus genom att fastställa hjärnan med nålen genom lillhjärnan och avlindning cortex börjar vid nackloben.
- Stöt frysa dissekerade hjärnprover i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C.
2. Beredning av synaptosomer eller alternativt en Postsynaptisk densitet (PSD) berikad fraktion
OBS: Under alla förfaranden, hålla prover och buffertar vid 0-4 ° C.Buffertar innehåller nyligen utspädd cocktails proteashämmare för att förhindra proteolytisk nedbrytning av proteiner. Om proteinfosforylering studeras också, cocktails fosfatasinhibitor måste läggas. Alla g-värdena anges som g (genomsnitt) i hela protokollet.
- Framställning av en rå membranfraktion (figur 3A)
- Överföring dissekerade hjärnvävnad i en homogenisering kärl innehållande 1 ml iskall buffert A (5 mM HEPES, 320 mM sackaros, pH 7,4) och homogenisera vävnaden vid 900 rpm med 12 slag.
- Centrifugera proverna vid 1000 xg under 10 min. Håll supernatanterna.
- Återhomogenisera pellets på samma villkor i samma volym av homogeniseringsbuffert som tidigare och centrifugera prover igen vid 1000 xg under 10 minuter. Kombinera motsvarande supematanter. Kasta pellets P1, som främst innehåller kärnor och cellrester.
- Snurra de kombinerade supernatanter under 20 minuter vid 12.000 x g. Släng supernasulter eller användning för ytterligare fraktionering 11.
- Resuspendera pellets i samma volym av homogeniseringsbuffert som innan med användning av homogenisator med 6 slag vid 900 rpm och centrifugering vid 12.000 xg under 20 min. Släng supernatanter. Pelletsen P2 representerar råmembranfraktioner.
- Rening av synaptosomer från rå hjärnmembranfraktioner (figur 3A)
OBS: Råhjärnmembranfraktioner kan separeras till myelin, lätta membran, synaptosomer och mitokondrier med hjälp av sackaros densitet steggradient ultracentrifugering. För detta 5 mM Tris / HCl pH 8,1 buffertar innehållande sackaros vid antingen 0,32 M, 1,0 M eller 1,2 M koncentration krävs.- Medan utför centrifugering för att producera P2 fraktioner förbereda sackaros steggradienter i ultracentrifugrör. Börja med 2,5 ml 1,0 M sackarosbuffert och underskiktet med 1,5 ml 1,2 M sackarosbuffert med hjälp av en glas Pasteur pipett.
- Återhomogenisera P2 fraktioneri 0,5 ml 0,32 M sackarosbuffert manuellt med 6 slag och belastning på toppen av gradienten.
- Snurra på 85.000 xg under 2 timmar i en ultracentrifug med hjälp av en svängande hink rotor.
- Kassera den övre 0,32 M sackaros skikt innefattande det material vid gränsytan till den 1,0 M sackarosbuffert (myelin, lätta membran). Samla synaptosomer vid 1,0 / 1,2 M sackarosbuffert gränssnitt. Pelleten i botten av röret innehåller mitokondrier.
- Lägga 0,32 M sackarosbuffert till synaptosomala fraktionen vid förhållandet 1: 1, blanda försiktigt och centrifugera vid 150.000 xg under 1 h. Synaptosomer är i pelleten och kan nu återsuspenderas i en buffert som erfordras för ytterligare bearbetning.
- Framställning av en PSD-anrikad fraktion (figur 3B)
- Homogenisera varje specifik hjärnområdet från ett enda djur i 100 pl extraktionsbuffert (5 mM Tris / HCI pH 8,1, 0,5% Triton X-100) i en 200 pl ultracentrifugrör med en PTFE (polytetrafluoretylen) mortelstötvid 2000 rpm med 12 slag.
- Tillsätt 100 | il extraktionsbuffert, blanda och inkubera under 1 h vid 4 ° C. Centrifugera ner vid 100.000 xg under 1 h och samla supernatanten S1 försiktigt med en 200 | j, l pipett.
- Re-homogenisera pellet P1 i samma rör med 100 | j, l extraktionsbuffert igen med en PTFE-mortelstöt vid 2000 rpm med 12 slag.
- Tillsätt 100 | il extraktionsbuffert och blanda väl med en pipett och snurra vid 100.000 xg under 1 h.
- Kombinera supernatanten S2 med S1 till den lösliga proteinfraktionen. Denna fraktion innehåller cytosoliska proteiner, 0,5% Triton X-100 lösliga membranproteiner och extracellulära matrismolekyler.
- Resuspendera den återstående pelleten i 50 pl 5 mM Tris / HCl pH 8,1. Denna fraktion innehåller PSD, tvättmedel resistenta membran, olösliga cytoskelettala element, mitokondrier och cellrester inklusive kärnor. Det är berikad i PSD som utgör kärnan i postsynaptiska strukturer men också viktiga delar av presynaptiskacytomatrix vid den aktiva zonen. Faktorn för anrikning av PSD är cirka 4 och anrikning av PSD komponenter har visats tidigare. 12
3. Provberedning för masspektrometri
- Lys och prov normalisering
OBS: Prov normalisering om proteinkoncentrationen är ett mycket viktigt steg för att slutligen nå tillförlitliga kvantitativa data även för svaga synaptiska protein uttryck förändringar.- Lös synaptosomer eller PSD-berikade preparat av varje hjärna område hos ett djur i 20-50 pl (beroende på den totala mängden material: för hörselbarken med 5-15 mg vävnad användning 20 pl) av 8 M urea och inkubera på is under en h i ett ultraljudsbad.
- I-gel smälta, lösa synaptosomer direkt i SDS-provbuffert. Noggrant beräkna den laddade belopp för att undvika överbelastning av gelén. Överväga att i detta fall, den höga riklig scaffold proteins kommer att gå förlorade under gelelektrofores och in-gel smälta.
- Späd med 1% av en borttagbar detergent för att säkerställa en slutlig koncentration av 2 M urea. Undvik temperatur högre än 30 ° C för att förhindra protein karbamylering.
- Utföra SDS-PAGE med en alikvot (t.ex. 10 | j, l) av provet enligt standardförfaranden 13,14.
- Fläcka gelén med Coomassie-blått enligt tillverkarens protokoll. Proceduren kombinerar fastställande och färgningssteget med metanol och ättiksyra.
- Bestämma den optiska densiteten för varje prov för hela körfält med en kalibrerad gel scannern i sändningsmod och beräkna den relativa proteinmängden.
- Normalisera proverna enligt dessa beräkningar.
- Split varje prov i två olika delar. Använd en tredjedel för in-gel smälta och två tredjedelar för in-lösning Digest.
- Lös synaptosomer eller PSD-berikade preparat av varje hjärna område hos ett djur i 20-50 pl (beroende på den totala mängden material: för hörselbarken med 5-15 mg vävnad användning 20 pl) av 8 M urea och inkubera på is under en h i ett ultraljudsbad.
- I-gel smälta
- Utföra en andra SDS-PAGE med användning av de koncentrationsjusterade proverna. Stain och kvantifiera gelerna för en andra gång för att kontrollera normalisering kvalitet.
- Skära ut varje spår av ett prov i gelén i olika områden (8 / lane) men exkluderar molekylviktsområdet över 170 kDa. Överför gelstycken i separata rör.
- Skär områden i mindre bitar (ca. 1 x 1 mm) med en vass skalpell för att underlätta in-gel digestion effekt.
- Digest 15
- Tvätta gelstycken flera gånger (beroende på färgningsintensitet) under 10 minuter med 50 - 150 | il av en buffert bestående av 50% acetonitril (ACN) och 50 mM ammonium-vätekarbonat (NH 4 HCO 3).
- Avlägsna supernatanterna. Täck gelstycken med ACN och inkubera vid 20 ° C tills gelstycken blir vita och krympa.
- Avlägsna ACN och rehydrera gelen stycken för femmin med 50 pl av 0,1 M NH 4 HCO 3. Tillsätt samma volym av ACN och inkubera under ytterligare 15 min vid 37 ° C.
- Ta bort och kassera vätska helt. Torka gelen bitar i en vakuumcentrifug.
- Rehydrera gelstycken i 50 | il NH 4 HCO 3 innehållande 10 mM ditiotreitol (DTT) och värme prover för 45 min vid 56 ° C för att reducera cysteinrester.
- Avlägsna supernatanterna och tillsätt 50 | il NH 4 HCO 3 innehållande 55 mM jodacetamid (lAA) under 30 minuter i mörker för att carbamidomethylate reducerade cysteiner.
- Ta bort och kasta all vätska ovanför gelen bitar och tvätta dem två gånger med 50 pl NH 4 HCO 3 och ACN (1: 1) under 10 minuter för att avlägsna eventuella kvarvarande IAA. Torra prover i en vakuumcentrifug.
- För begränsad nedbrytning av proteiner tillsätt 25 mM NH 4 HCO 3 innehållande 12,5 ng / l trypsin. Den erforderliga volymen beror på storleken och mängden av gelén pieces. Inkubera under några minuter och kontrollera om bufferten absorberas. Tillsätt mer buffert vid behov, gel bitar bör helt täckt. Inkubera vid 37 ° C över natten (min. 12 h).
- peptid extraktion
- Overlay gel bitar med 10 - 20 pl 25 mM NH 4 HCO 3 och lägga till samma volym ACN. Inkubera i 10 minuter på is med hjälp av ultraljudsbad. Efteråt bort och samla supernatanter som innehåller de flesta av de genererade peptider.
- Tillsätt 100 | il extraktionsbuffert innehållande 30% ACN / 0,1% trifluorättiksyra (TFA) till gelén bitar. Upprepa inkubation i ett ultraljudsbad och noggrant samla denna supernatant.
- Upprepa de sista extraktionsstegen genom ökning av ACN koncentrationen till 50%. Efter 10 minuter av ultraljudsbad spinn ner och samla supernatanter.
- Kombinera alla tre motsvarande supernatanter av extraktionssteg och torka dem i en vakuumcentrifug. Anteckna detsom ett resultat av den gelseparation de 8 områden per körfält / prov kombineras till ett prov på nytt i detta steg.
- Smälta
- Använd den beräknade mängden (t.ex. 100 pl av en 150 pl lysat, beror på mängden material och den volym som krävs för resuspension av ett prov från ett visst område i hjärnan) av normaliserade prover för att erhålla tillräckligt utgångsmaterial för åtminstone tre tekniska replikat till utföra label-free masspektrometri.
- Tillsätt 2 mM DTT i 25 mM NH 4 HCO 3 och försiktigt virvel provet. Minska proverna under 45 minuter vid 20 ° C.
- Lägg 10 mM IAA att carbamidomethylate cysteinresterna. Blanda och inkubera under 30 minuter i mörker vid 20 ° C.
- Slutligen tillsätts 1 | il av en trypsin stamlösning (1 ug / ul trypsin i 25 mM ättiksyra) och inkubera vid 20 ° C under 12 h.
- Fastfas-extraktion (SPE) -Purification
- Att avlägsna syran klyvbar detergent, justera prover till en slutkoncentration av 1% TFA och inkubera i 1 timme vid 20 ° C.
- Centrifugera proverna vid 16.000 xg i 10 minuter och noggrant samla supernatanter.
- Placera SPE kolonn i ett rack och jämvikt matrisen med 2 ml metanol. Tvätta två gånger med 2 ml av 0,1% TFA i vatten (buffert B).
- Tillsätt 2 ml av buffert B och ladda provet. Tvätta ytterligare tre gånger.
- Eluera peptiderna genom tillsats av 200 | j, l 70% ACN / 0,1% TFA. Upprepa detta steg.
- Pool båda eluat och torka ner dem i en vakuumcentrifug.
- Upplösa peptider som framställts genom in-gel eller in-lösning smälta i 150 pl av 80% ACN / 2,5% TFA (buffert C) och jämvikta ~ 2 mg av TiO 2 pärlor i 50il av buffert C.
- Lägga pärlor till provet och inkubera i en roterande anordning för en timme vid 20 ° C. Efteråt, snurra pärlor ner (16.000 xg, 1 min) och samla supernatanter.
- Tvätta pärlor tre gånger med 100 ul av buffert C genom att försiktigt blanda och spinning ner efter 5 min. Samla supernatanter. Upprepa detta steg tre gånger med 100 pl av 80% ACN / 0,1% TFA, följt av tre tvättningar med 100 pl av 0,1% TFA (utan ACN), respektive.
- Kombinera alla tio supernatanter, torka dem i en vakuumcentrifug och hantera dem som fosfo-peptid utarmade fraktion för ytterligare rening enligt steg 3,5.
- Eluera de bundna fosfor-peptider med 20 pl 400 mM NH4OH / 30% ACN från pärlorna. Upprepa detta steg tre gånger och samla alla supernatanter efter spinning ner pärlorna.
- Kombinera eluaten av in-gel-smälta och av in-lösning sammandrag av ett prov och hantera dem som fosfo-peptide-anrikade fraktionen. Torka dem i en vakuumcentrifug till en slutlig volym av 4 - 8 | il.
- Upplösa de torkade peptiderna i 20 yl 0,1% TFA.
- Jämvikt fast C18 -matris genom att dra 20 ul ACN i spetsen. Tvätta matrisen genom att rita 0,1% TFA i vatten in i spetsen. Upprepa processen tre gånger.
- Sakta ladda surgjord provet i spetsen (upprepa detta steg tre gånger).
- Tvätta C 18 -matris tre gånger med 20 | il 0,1% TFA i vatten och kassera tvättlösningen.
- Eluera peptider från pipettspetsen genom att upprepade gånger (3 gånger) ritning 20 pl 70% ACN / 0,1% TFA och samla denna eluering lösning i ett separat rör.
- Kombinera eluaten hos ett prov och torka dem i en vakuumcentrifug.
4. Proteome Analysis
<p> OBS: Proteome analys utförs på en hybrid med dubbla tryck linjära jonfälla / Orbitrap masspektrometer utrustad med en ultra HPLC. HPLC är sammansatt av en kyld autosampler med en 20 | il injektionsslinga, en binär laddningspump (il flödesområdet), en binär nano flödesseparation pump, en kolonn värmare med två mikroomkopplingsventiler och en avgasnings. Prover först utsattes för en fångst kolonn (t.ex. 100 ^ m x 2 cm) vid en flödeshastighet av 7 | j, l / min följt av separation på en kolonn (t.ex. 75 | j, m x 25 cm) vid 250 nl / min. Separationskolonnens utlopp är direkt kopplad till en belagd Pico emitterspetsen läge i en nano-sprutgränsytan vid masspektrometer jonisering källa.- Nano-vätskekromatografi och tandem masspektrometri
- Upplösa peptidprover i 12 | j, l 2% ACN / 0,1% TFA under minst 30 min. Spinn ner under 15 sekunder och överför 11 | il supernatanten till autosampler flaskor (konisk, minskad diameter).
- Inrätta ett automatiserat system för exempelprogrammet kromatografisk separation och tandem masspektrometri till att kontrollera programvara (t.ex. Xcalibur) enligt följande.
- Använd följande för Temperatur: Autosampler: 5 ° C; Kolonnugn: 45 ° C.
- Använd följande för injektion: Volym: 10 l; Flödeshastighet: 7 | j, l / min (2% ACN, 0,1% TFA); Tid: 8 min; Ventilinställning: trap kolonn - avfall; masspektrum förvärv: off.
- Använd följande för Separation: Flöde: 250 NL / min Ventil inställning: trap kolonn-separationskolonn; mass förvärvs spec: on.
0 min - 100 min: 2% ACN, 0,1% myrsyra - 40% ACN, 0,1% myrsyra
100 min - 105 min: 40% ACN, 0,1% myrsyra - 95% ACN, 0,1% myrsyra
105 min - 109 min: 95% ACN, 0,1% myrsyra
109 min - 120 min: 2% ACN, 0,1% myrsyra - Använd följande för inställningar masspektrometri: Full MS: FTMS; upplösning 60000; m / z intervallet 400 - 2000; FRÖKEN/MS: Linear Iontrap; minsta signaltröskel 500; isolering bredd 2 Da; dynamisk uteslutning tidsinställning 30 sek; ensamma laddade joner uteslutas från urvalsförfarandet; normaliserad kollisionsenergin sätts till 35%, och aktiveringstiden till 10 msek.
OBS: En fullständig MS scan följs av upp till 15 LTQ MS / MS körs med hjälp av kollisions inducerad dissociation (CID) av de mest rikligt detekterade peptidjoner.
- Kör tre tekniska replikat för alla prover.
- Protein identifiering och etikett fri kvantifiering
- Process masspektrometriska rådata mot identifiering protein och etikett fritt kvantifiering utnyttjar en kommersiell programvara svit (t.ex. toppar Studio). I motsats till de flesta andra Proteome programvarupaket använder denna programvara en de novo -sequencing algoritm före proteindatabas anpassningar. Emellertid kan detta steg enkelt ersätts med andra populära programvarupaket.
- användning essrential- inställningar som anges i tabell 2.
- Fosfor-proteomik
OBS: Effektiv och tillförlitlig fosfor-peptid förvärv kräver några viktiga förändringar i proteomik arbetsflöde installationen.- Efter fosfo-peptidanrikningen, aldrig torra prover helt. alltid hålla prover lösta.
OBS: fosfor-esterbindning av fosforylerade treoniner eller seriner är mycket bräcklig. Under kollision-inducerad fragmentering inom jonfällan detta resulterar i en neutral förlust av fosfat. Detta förhindrar varje ytterligare fragmentering av peptiden, vilka i sin tur krävs för identifiering. Tillåten bredbands-aktivering i massinställnings spektrometri kan fragmenteringen av fosfor-peptider även efter en neutral förlust av fosfatgruppen. Den utför en tidsbesparande "pseudo-MS 3". Fosfor-site bestämningen i MS / MS-data kräver en särskild kontroll och utvärdering och kan utföras av fosfor 3.0.
- Efter fosfo-peptidanrikningen, aldrig torra prover helt. alltid hålla prover lösta.
5. Bioinformatics - Meta-Analysis
OBS: Innan du utför funktionell annotering och nätverksanalys, protein listor måste förbehandlas. Först ihop förteckningarna över reglerade proteiner och fosfor-peptider för varje hjärna region separat. Ta sedan bort alla dubbletter UniProt-ID för varje fraktion för att förhindra feltolkningar.
- Singular anrikning analys med GeneCodis 17
- Öppna webbaserade verktyg för GeneCodis (http://genecodis.cnb.csic.es)
- Välj "Mus musculus" såsom organism och "GO Biologisk Process" som annotering.
- Klistra in en lista över UniProt-ID för en viss del. Skicka in och vänta tills analysen utförs. Klicka på "Singular anrikningsanalys av GO Biologisk Process" och visa resultaten.
- Upprepa steg 5.1.3 för de övriga tre fraktioner.
- För att se några överlappningar och korsningar mellan resultatlistorAnvänd ett skriptspråk som Perl eller Python för att filtrera de uppgifter som behövs. Liknande verktyg för en enda analys anrikning är DAVID (https://david.ncifcrf.gov/) och Cytoscape (http://www.cytoscape.org/) med PlugIns BINGO (http://apps.cytoscape.org/ appar / bingo) och ClueGO (http://apps.cytoscape.org/apps/cluego).
- Generera en kraft baserad graf av GeneCodis data med Gephi (https://gephi.org/)
OBS: Data för diagrammen måste tillhandahållas av användaren, antingen i en graf format (.gexf, .graphml, .dot, .gv, .gml) eller senare fallet.- Generera grafen noder
- Hand: Öppna Gephi och klicka på "Data Laboratory". Skapa noder. Klicka på "noder" på vänster för att växla till "noder" bord. Klicka på "Lägg till nod". Skriv in namnet på den Term. Klicka på "OK" / Tryck på Enter.
- Alternativa Spara GeneCodis leda till PC. Öppna .txt med ett kalkylprogram. Ta bort alla rader except från "Item_Details" (termen namn). Ändra header "Item_Details" till "Label". Spara kalkylblad som ".csv". Nu i Gephi, klicka på "Importera kalkylblad". Välj kalkylblad från filhanteraren av Gephi. Klicka på "Nästa". Klicka på "Finish".
- Anslutning noder via kanterna.
- Klicka på "kanter" till vänster för att växla till "kanter" bord. För varje nod (Term): se upp gen namn i andra termer. Om en eller flera gener delas -> skapa kant.
- Klicka på "Lägg till Edge". Välj "Oriktad". Välj källa och målnoden av nedrullningsbara listor. Klicka på "OK" / Tryck på Enter. Om mer än en gen är delad anger överflöd i "Weight" (tabell).
- Force baserad grafisk layout.
- Open Graph datafil, ange graftypen till "icke riktad" eller använda uppgifter som senare fallet, klicka på "Översikt" om inte redan i valdad.
- Ändra storlek noder beroende på det överflöd av sammanlänkningar. Klicka på statistik köra antingen "genomsnittlig grad" (ovägda kanter) eller "Avg. Weighted Degree" (viktade kanter) under "Network översikt". I "Utseende", klicka på "noder", sedan på knappen Storlek, nästa välj "Egenskaper" och ställ in attribut parametern "Avg. Weighted Degree" eller "genomsnittlig grad". Klicka på Verkställ.
- Slutligen: Välj "Force Atlas" i "Layout" och kör; ändra "Repulsion styrka" om noder kolliderar.
- Export till bilden.
- Skärmdump funktion: Klicka på "Översikt", förändring diagram layout, kanttjocklek, etikettstorlek och skalning med menyn längst ner i "Graph" fönster. Klicka på kameran vänstra knappen, och spara bilden.
- Export inslag i "Preview": Klicka på "Preview". Ändra förinställningar för "Standard rak". Ändra inställnings enligt de valda inställningarna och klicka på "SVG / PDF / PNG" för att exportera.
- Generera grafen noder
Representative Results
Figur 1 sammanfattar hela arbetsflödet för kvantitativ synaptiska proteom profilering av mus områden i hjärnan efter att lära auditiv diskriminering. Det börjar med djuret utbildning i en transferlåda. I det i fig 2 exempelvis möss började visa betydande diskriminering FM ton i 4: e träningspass, vilket indikerar effektiv inlärning. Djuren avlivades vid utvalda tidpunkter för hjärnområde dissektion. Den erforderliga anrikningen av synapser kan antingen åstadkommas genom beredning av synaptosomer eller alternativt genom framställning av en PSD-anrikad fraktion, som båda beskrivs i detalj i figur 3. Den PSD-anrikning metod har utvecklats för låga mängder vävnads, t.ex. 1 - 2 hippocampus skivor från råtthjärna 12, 18. Det kräver små rör, PTFE pestles passande till dessa rör, och ett laboratorium borr enhet för att driva mortelstöt.
På grund av det speciella proteinet sammansättningen av synaptosomer, är det rekommenderar att utföra provberedning i två olika men kompletterande sätt. Ställningar av PSD är ofta mycket högmolekylära proteiner som förekommer i hög stökiometri. In-lösning digest är det bästa sättet att extrahera dem effektivt men kan leda till en översampling av den genererade peptidblandningen. In-gel smälta utförs av samma prov parallellt kan utesluta dessa högmolekylära proteiner och gynna analys av proteiner med medelhög och lägre molekylvikt. För en omfattande analys båda typerna av proteolytiska klyvningar rekommenderas.
De olika mängder av vävnader i områden i hjärnan undersöks kräver en justering av den tillförda materialet för bättre jämförelse. Inom de fyra undersökta områden i hjärnan hörselbarken är i allmänhet den begränsande faktumeller. Materialet i alla andra områden i hjärnan bör noga anpassas till mängden hörselbarken efter framställning av synaptosomer eller PSD-berikade fraktioner (se 3.1.1.). Typiska vikter av nylagade hjärnområden från möss är följande: hörselbarken (AC): ~ 50 mg; hippocampus (HIP): ~ 90 mg; striatum (STR): ~ 120 mg och frontala cortex (FC): ~ 100 mg.
PSD-anrikning metod som beskrivs i avsnitt 2.3 tillät identifiering av cirka 1500 olika proteiner och cirka 250 olika fosfor-peptider per hjärnregion på nivån för ett enskilt djur (Tabell 1). Proteomic analys 24 h efter den första träningssessionen visade att 7,3% av de identifierade proteinerna och 5,8% av fosfo-peptider uppvisade signifikant (p <0,05) Kvantitativa förändringar i deras synaptisk expression jämfört med naiva kontroller (tabell 1). En iögonfallande tendens till ned regulaning av synaptiska byggnadsställningar kan peka på en uttalad ombildning av den synaptiska arkitektur under tidiga stadier av FMTD lärande. De allra flesta av de reglerade proteinerna ändrats på ett hjärnregion specifikt sätt, medan endast 22% befanns vara reglerat i två eller flera områden i hjärnan. Sex utvalda exempel visas i Figur 4.
Metaanalys av de komplexa resultat av IPA utgör bevis för den särskilda deltagande / manipulering av följande kanoniska vägar: "clathrin medierad endocytos Signaling", "axonal vägledning Signaling", "Calcium Signaling", "RhoA Signaling", "Notch-signal "" Omvandlingen av Epithelial zonula adhaerens "," glutamatreceptorn Signaling "," GABA-receptorsignalering "," dopamin receptorsignalering "och" Synaptic långsiktig potentiering ".
(Figur 5). I hörselbarken biologiska processer inklusive jontransport, översättning, mRNA transport, transport och lärande protein var märkbar. Analysen av proteinfraktionen av hippocampus upptäcker avsevärt anrikade processer relaterade till jon transport, cellcykeln, översättning, fosforylering och nervsystemets utveckling. I striatum, överrepresenterade biologiska processer inklusive mRNA transport, vesikler-medierad transport, axonogenesis, proteolys, protein transport och endocytos hittades.
Figur 1: Systematisk Workflow för denna metod. Denna siffra sammanfattar schematiskt arbetsflödet med hög upplösning kvantitativ profilering av hjärnområdesspecifik synaptiska proteinsammansättning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Exempel på utföranden av möss i FM Tone Diskriminering Task. Djur visar en ökande takt träffar (blå kurva) och en avtagande takt falsklarm (svart kurva) under träningen. Betydande diskriminering sker från den fjärde sessionen. Felstaplar tillhandahålls som SEM. Klicka här för att se en larGER version av denna siffra.
Figur 3: Beredning av synaptosom och PSD-fraktionen. A: synaptosom preparat. B: PSD-fraktion beredning. Båda siffrorna förklara den detaljerade arbetsflödet för framställning av synaptosomer eller alternativt PSD-anrikade fraktioner från hjärnvävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Vald Kvantitativ proteomik resultat. De relativa synaptiska bestånd av utvalda proteiner jämförs mellan möss trasökte på FMTD uppgift (AV, n = 6) och naiva kontrollmöss (NV, n = 6) 24 timmar efter den första träningspasset. Överflödet värdena beräknades som medianen av de toppytorna för de tre mest intensiva peptider av ett protein. Proteiner med betydande förändringar överflöd (AV / NV, t-test) är markerade i kurvorna: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,005. Felstaplar tillhandahålls som SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Visualisering av biologiska vägar för frontala cortex av GeneCodis / Gephi. Endast betydande termer av Gene ontologi (GO) databas (http://geneontology.org) relaterade till "Biologisk process" med en lägsta protein antal tre Här visas. Noder representerar GO termer, storleken hos noden, linjebredden och antalet anslutningar av en viss nod skildra antalet proteiner, som delar denna GO sikt med andra noder. På grund av den "Force Atlas" metod för Gephi är relaterade noder klustring tätt tillsammans. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| hjärnregion | växelström | FC | HÖFT | 000 "face =" Calibri "size =" 3 "> STR | Σ |
| identifierade proteiner | 1435 | 1758 | 1572 | 1507 | 6272 |
| reglerade proteiner (p <0,05) | 59 | 130 | 162 | 108 | face = "Calibri" size = "3"> 459 |
| ↑ AV / NV | 8 | 4 | 76 | 35 | 123 |
| ↓ AV / NV | 51 | 126 | 86 | 73 | 336 |
| identifierad phosphomoti fs | 197 | 361 | 273 | 278 | 1109 |
| reglerade phosphomotifs (p <0,05) | 8 | 22 | 21 | 14 | 65 |
| ↑ AV / NV | 4 | 00000 "face =" Calibri "size =" 3 "> 17 | 5 | 9 | 35 |
| ↓ AV / NV | 4 | 5 | 16 | 5 | 30 |
Tabell 1: Sammanfattning av ett proteomik Result. Denna tabell sammanfattar en representativ proteomik experiment av utbildade möss (AV, n = 6) 24 timmar efter den första träningspasset i jämförelse med sina naiva kontroller (NV, n = 6). Desumman av 459 reglerade proteiner inkluderar överlappande regler. 283 olika regler bestämdes som hjärnspecifik. I detalj är 57 proteiner regleras i två områden i hjärnan, har 18 protein regler upptäcktes i tre områden i hjärnan och endast två proteiner regleras i alla fyra undersökta områden i hjärnan.
| feltoleranser | |
| prekursor massa (Fouriertransformation masspektrometri) | 10 ppm |
| fragmentjon massa (linjär jonfälla) | 0,6 Da |
| Maximala missade klyvningar per peptid | 3 |
| fasta modifieringar | |
| i-gel-diger prover | Carbamidomethylation av Cystein |
| i-lösning omsatta prover | Methylthiolation av Cystein |
| variabla modifieringar | Oxidation av metionin |
| Deamidations av asparagin och / eller glutamin | |
| Databas | UniProt / spröt |
| taxonomi | mus |
| Statistiska inställningar identifiering-acceptans | |
| de novo genomsnittliga lokala förtroende (ALC) | > 50% |
| Peptid-falskt upptäckt hastighet (FDR, baserat på est. Lock fusion) | <1% |
| Protein signifikans (-10logP, baserat på modifierad T-test) | > 20 |
| unika peptider / protein | ≥ 1 |
| Kvantifiering inställningar: | |
| Peptider som användes för kvantifiering om: | |
| Peptid betydelse (-10logP) | > 30 |
| Peptid identifiering | ≥ 50% av proverna |
| signalkvalitets peptid | > 1 |
| Peptid genomsnittliga område | > 1E5 |
| Peptid retentionstid tolerans | <5 min |
| Normalisering | genom total jonström (TIC) |
Tabell 2: Inställningar för Protein Identification (steg 4.2.2).
Discussion
Studien presenterar en metod arbetsflöde optimerad för en noggrann kvantitativ profilering av synaptiska protein uttryck förändringar under inlärning och minne konsolidering inom olika områden i hjärnan på möss. Installations ger möjlighet att studera proteinuttryck på nivån för ett enda djur trots önskat program på minst tre tekniska replikat per prov för masspektrometrisk analys.
Metodiken tar hänsyn till den särskilda proteinsammansättning av pre- och postsynapsen bestående av högmolekylära ställnings proteiner utan också viktiga förmedlarproteinerna bär medium eller lägre molekylvikt. De in-lösning klyvningar av synaptosomala preparat resulterar i en effektiv produktion och därmed en överrepresentation av byggnadsställning-härledda peptider. Detta, i sin tur, kan undertrycka analys av mindre eller lägre rikliga proteinerna. Den föreslagna beredningen av SDS-PAGE-fraktioner från enalikvot av varje prov kombinerades med en uppslutningsförfarandet parallellt in-gel underlättar analysen av medium och låg abundans proteiner och representerar en mycket rekommenderade kompletterande metod. Efter separat masspektrometrisk tillämpning av alla fraktioner som härrör från ett prov (t.ex. in-lösning smälta i-gel smälta kombinerade Fosfor-berikade fraktioner) motsvarande MS / MS dataset kan kombineras och vidare beräknat för identifiering protein och kvantifiering av toppar programvara eller alternativa populära programpaket.
Alternativt i enskilda fall är in-gel-digestion-härledda fraktioner av ett prov (separat bearbetade gel-områden i ett prov lane) och fraktioner som alstras av in-lösning kokade provet (t.ex. genom jonbyteskromatografi) för masspektrometri kan öka den analytiska djup. Emellertid ökar detta utökade arbetsflöde dramatiskt den tid som krävs för LS-MS / MS datainsamling. för genen av en detaljerad molekylär sekvens av synaptiska protein omlagringar under inlärning och minnesbildning en specificerad tidsförloppet för proteomic profiling krävs. Detta tidsförlopp kan starta omedelbart efter eller även under första träningspasset och täcker en finmaskigt tidsram tills djurens prestation nådde asymptotisk nivå av inlärningskurvan efter ca. 8 - 10 dagars utbildning (se figur 2 för detaljer).
Analysen av fosforylering förändringar i synaptiska proteiner kräver ett särskilt fokus på de valda tidsramar under FMTD lärande. Å ena sidan signaleringskaskader initierar synaptiska protein omflyttningar kända utlösas av proteinfosforyleringar och defosforyleringar förväntas vid mycket tidiga stadier av animaliskt utbildning. Å andra sidan finns det långvariga ändringar av flera fosforylerade synaptiska proteiner som är kända som reglerar anslutning och montering inom synaptic arkitektur 19, 20. De posttranslationella modifieringar förväntas även vid en senare tidpunkt minne konsolidering tid.
De komplexa datamängder som genereras av denna proteomik arbetsflöde kräver bioinformatisk behandling för att identifiera deltagande molekylära vägar och viktiga molekyler. Meta-analys visar betydande överrepresenterade vägar, som spelar en roll i inlärnings- och minnesprocesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 M Empore Solid Phase Extraction- Filter | 3M Bioanalytical Technologies | 4245SD | 7 mm/3 ml |
| Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164564 | 100 µm x 2 cm, C18 |
| Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164569 | 75 µm x 25 cm, C18 |
| Acetic acid | Carl Roth GmbH | 3738.1 | |
| Acetonitrile (ACN) | Carl Roth GmbH | AE70.2 | |
| Acrylamide (30%) | AppliChem | A0951 | |
| Ammonium hydrogen carbonate | Fluka | 9830 | |
| Ammonium hydroxide | Fluka | 44273 | |
| Ammonium persulfate (APS) | AppliChem | A2941 | |
| Biofuge pico | Heraeus GmbH | 75003280 | |
| Blue R-250 | SERVA Electrophoresis GmbH | 17525 | |
| Bromophenol Blue | Pharmacia Biotech | 17132901 | |
| C57BL/6J mice | Charles River | ||
| Cantharidin | Carl Roth GmbH | 3322.1 | |
| Centrifuge tubes for MLS-50 | Beckman Coulter | 344057 | |
| Centrifuge tubes for TLA 100.1 rotor | Beckman Coulter | 343776 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
| Eppendorf 5417R centrifuge | VWR | 22636138 | |
| Eppendorf A-8-11 rotor | VWR | 5407000317 | |
| Formic acid | Fluka | 14265 | |
| GeneCodis | http://genecodis.cnb.csic.es/ | ||
| Gephi | https://gephi.org/ | ||
| Glycerol | AppliChem | A1123 | |
| Glycine | AppliChem | A1067 | |
| HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail | Pierce /Thermo Scientific | 78420 | |
| HEPES Buffer solution | PAA Laboratories GmbH | S11-001 | |
| Homogenization vessel 2 ml | Sartorius AG | 854 2252 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Laboratory drilling drive K-ControlTLC 4957 | Kaltenbach & Vogt GmbH | 182997 | |
| LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2 | Thermo Scientific | ||
| LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Scientific | ||
| Macs-mix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | |
| Magic Scan 4.71 | UMAX | ||
| Methanol | Carl Roth GmbH | AE71.2 | |
| MLS-50 rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| Optima MAX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| PEAKS 7.5 | Bioinformatic Solutions | ||
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
| PhosphoRS 3.1 | IMP/IMBA/GMI | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| Plunger/pestle made of PTFE | Sartorius AG | 854 2651 | |
| PotterS homogenizer | Sartorius AG | 853 3024 | |
| Protease Inhibitor complete mini | Roche | 4693159001 | |
| Quantity One 4.5.1 | BioRad | ||
| RapiGest | Waters | 186002122 | |
| Shuttle box | Coulbourne Instruments | ||
| Sodium dodecylsulfate (SDS) | AppliChem | A1112 | |
| Sodium molybdate | Carl Roth GmbH | 274.2 | |
| Sodium tartrate dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
| SONOREX RK 156 Ultrasonic Bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG | 305 | |
| Soundproof chamber | Industrial Acoustics Company | ||
| Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.2 | |
| Tetramethyl ethylene -1,2-diamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Thermomixer basic | CallMedia | 111000 | |
| Titansphere TiO 5µm | GL Sciences Inc. Japan | 502075000 | |
| TLA 100.1 rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Trifluoro acetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Tris ( hydroxymethyl) aminomethane (TRIS) | AppliChem | A1086 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
| Ultimate 3000 Ultra HPLC | Dionex/Thermo Scientific | ||
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 343776 | |
| Unijet II Refrigerated Aspirator | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
| UNIVAPO 100 H Concentrator Centrifuge | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
| Urea | AppliChem | A1049 | |
| Water (high quality purifed) | Resistivity: > 18.2 MΩ*cm at 25 °C Pyrogens: < 0.02 EU/ml TOC: < 10 ppb | ||
| Xcalibur 3.0.63 | Thermo Scientific | ||
| ZipTipC18 Pipette Tips | MILLIPORE | ZTC18S960 |
References
- Lamprecht, R., LeDoux, J.
- Bingol, B., Schuman, E. M. Synaptic protein degradation by the ubiquitin proteasome system. Curr Opin Neurobiol. 15 (5), 536-541 (2005).
- Richter, J. D., Klann, E. Making synaptic plasticity and memory last: mechanisms of translational regulation. Genes Dev. 23 (1), 1-11 (2009).
- Rosenberg, T., et al. The roles of protein expression in synaptic plasticity and memory consolidation. Front Mol Neurosci. 7, 86 (2014).
- Scheich, H., et al. Behavioral semantics of learning and crossmodal processing in auditory cortex: the semantic processor concept. Hear Res. 271 (1-2), 3-15 (2011).
- Kähne, T., et al. Synaptic proteome changes in mouse brain regions upon auditory discrimination learning. Proteomics. 12 (15-16), 2433-2444 (2012).
- Reichenbach, N., et al. Differential effects of dopamine signalling on long-term memory formation and consolidation in rodent brain. Proteome Sci. 13, 13 (2015).
- Kähne, T., et al. Proteome rearrangements after auditory learning: high-resolution profiling of synapse-enriched protein fractions from mouse brain. J Neurochem. , (2016).
- Li, K., et al. Organelle proteomics of rat synaptic proteins: correlation-profiling by isotope-coded affinity tagging in conjunction with liquid chromatography-tandem mass spectrometry to reveal post-synaptic density specific proteins. J Proteome Res. 4 (3), 725-733 (2005).
- Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities. J Cell Biol. 86 (3), 831-845 (1980).
- Smalla, K. H., Klemmer, P., Wyneken, U. The Cytoskeleton - Imaging, Isolation, and Interaction. Dermietzel, R. , Humana Press. 265-282 (2012).
- Smalla, K. H., et al. The synaptic glycoprotein neuroplastin is involved in long-term potentiation at hippocampal CA1 synapses. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (8), 4327-4332 (2000).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68 (5), 850-858 (1996).
- Thingholm, T. E., Larsen, M. R., Ingrell, C. R., Kassem, M., Jensen, O. N. TiO(2)-based phosphoproteomic analysis of the plasma membrane and the effects of phosphatase inhibitor treatment. J Proteome Res. 7 (8), 3304-3313 (2008).
- Carmona-Saez, P., Chagoyen, M., Tirado, F., Carazo, J. M., Pascual-Montano, A. GENECODIS: a web-based tool for finding significant concurrent annotations in gene lists. Genome Biol. 8 (1), 3 (2007).
- Bonn, S., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. Combinatorial expression of alpha- and gamma-protocadherins alters their presenilin-dependent processing. Mol Cell Biol. 27 (11), 4121-4132 (2007).
- Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain. J Proteome Res. 8 (11), 4966-4982 (2009).
- Li, L., et al. The differential hippocampal phosphoproteome of Apodemus sylvaticus paralleling spatial memory retrieval in the Barnes maze. Behav Brain Res. 264, 126-134 (2014).
