Abstract
感染症は、罹患率と死亡率の重要な原因であり続けて焼きます。多剤耐性（MDR）細菌の増加出現は、従来の抗生物質治療の頻繁な故障につながっています。代替治療薬が緊急MDR細菌に取り組むために必要とされています。
革新的な非抗生物質のアプローチは、抗菌青色光（ABL）は、MDR感染に対する有望な効果を示しました。 ABLの作用のメカニズムはまだよく理解されていません。一般的に（ 例えば 、鉄を含まポルフィリン、フラビンなど ） が順番に光化学プロセスを経て、細胞傷害性活性酸素種（ROS）を生成ABLによって励起されて自然に細菌における内因性光増感発色団を発生すると仮定されています。
別の光系抗菌アプローチとは異なり、抗菌光線力学療法（APDT）は、ABLの治療は、外因性photosensitizの関与を必要としませんえー。それを有効にする必要があるすべては、青色光の照射です。そのため、それが簡単で安価です。 ABL受容体は、細菌における内因性細胞増感ではなく、DNAです。したがって、ABLは、直接宿主細胞におけるDNA損傷を引き起こす紫外線C（UVC）照射、より宿主細胞にはるかに少ない遺伝毒性であると考えられています。
本稿では、火傷のマウスモデルにおけるMDR アシネトバクターバウマニ感染症のためのABL療法の有効性を評価するためのプロトコルを提示します。設計生物発光菌株を使用することにより、我々は、非侵襲的に生きている動物で、リアルタイムでの感染の程度をモニターすることができました。この技術はまた、動物における感染の空間分布を監視するための有効なツールです。
Introduction
頻繁にあるため、皮膚熱傷の報告されたバーン感染は、罹患率と死亡率1の重要な原因であり続けます。火傷感染症の管理はさらにによる抗生物質の大規模な使用に多剤耐性（MDR）菌株2の増加出現によって侵害されています。一つの重要なMDRグラム陰性菌の最近の戦いの傷と関連することが知られており、ほぼすべての利用可能な抗生物質に耐性3ですアシネトバクターバウマニ 、です。負傷病巣におけるバイオフィルムの存在は5,4が報告されており、持続感染8,9を引き起こし、抗生物質および宿主防御6,7に対する耐性を悪化させると考えられています。したがって、pressinがありますグラム代替治療の開発のために必要。 抗生物質耐性菌と闘うための最近発表された国家戦略では、抗生物質に代わる治療法の開発は、米国10の政府によるアクションとして注目されています。
光系抗菌アプローチ、名前によって示されるように、または他の薬剤なしで光照射を必要とします。これらのアプローチは、抗菌光線力学療法（APDT）、紫外線C（UVC）照射、および抗菌青色光（ABL）が挙げられます。以前の研究では、彼らはMDR菌株11、12、13を殺すに有望な有効性を示しています。 3つの光ベースのアプローチの中で、ABLは、光増感剤14を使用せずにその固有の抗菌特性により近年注目を高め集めています。比較例でAPDT光と光増感剤の組み合わせを必要とするAPDTにISON、ABLのみ、光の使用を含みます。したがって、ABLは、簡単で14安価です。 UVCと比較して、ABLは、はるかに少ない細胞毒性および細胞15をホストする遺伝毒性であると考えられています。
このプロトコルの目的は、マウスモデルにおいて、MDRのA.のバウマニによって引き起こされる熱傷感染症の治療のためのABLの有効性を検討することです。私たちは、リアルタイムで細菌負荷の非侵襲的な監視を可能火傷感染症の新しいマウスモデルを開発するために生物発光病原性細菌を使用しています。体液/組織サンプリング及びその後のメッキ及びコロニーが16カウントの従来の方法に比べて、この技術は、正確な結果を提供します。組織サンプリングのプロセスは、実験誤差の別のソースをもたらす可能性があります。細菌の発光強度はcorresに直線的に比例するので、細菌CFU 17滞水、我々が直接光照射の特定の投与後の細菌の生存率を測定することができます。リアルタイムで光治療を受けて生きている動物に細菌負荷を監視することにより、細菌殺害の動態は、マウスの大幅に削減された数を使用して特徴付けることができます。
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Protocol
細菌培養物の調製
- ブレインハートインフュージョン（BHI）50mLの遠心管に培地7.5 mLを加え。シードのA.バウマンニの BHI培地中の細胞、その後は18時間オービタルインキュベーター（37℃）でのA.バウマンニ培養物をインキュベートします。
- 遠心機で5分間3,500×gでの細胞の培養、上清を除去し、そしてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中でペレットを洗浄します。
- 新鮮なPBS中の細菌ペレットを再懸濁し、完全に懸濁液をピペット。
- 細菌懸濁液100μLを収集し、新鮮なPBSを使用して1:10希釈を作ります。
- 1.5mLのセミミクロキュベットに希釈を移し、600nmで（OD 600 nm）の波長での光学密度（OD）を測定します。
- 希釈の測定OD 600nmの値と希釈係数（10）に従ってPBSで元の（未希釈）懸濁液のOD 600-NMを算出します。
- 目の調整600 nmでの ODまでPBSで電子オリジナルサスペンション= 0.6（10 8 CFU / mlの細胞密度に相当します）。
生物発光Aによって引き起こさバーン感染の2マウスモデル。 バウマニ
- 7-8週齢の大人の雌のBALB / cマウスを使用し、17〜19グラムの重量を量ります。マウスは、実験の開始前に少なくとも3日間実験室条件に順応できるようにします。 21℃の室温下で12時間の明/暗サイクルでマウスを維持し、それらを食物および水を自由に与えます。
- ケタミン - キシラジンのカクテル（ - を20mg / kgでは100mg / kg）を腹腔内注射でマウスを麻酔。軽く綿棒で各マウスの眼瞼に触れます。眼瞼反射の欠如は、適切な麻酔深度を示唆しています。麻酔中の乾燥から目を防ぐために、獣医軟膏でマウスの目をカバーしています。
- 5を使用して、できるだけ多くの肌を露出するように背面にマウスを剃ります0-刃バリカン。
- 比較的水平位置に背中を保持するために、マウスの腹部下に35 ム・ペトリ皿の蓋を置きます。
- 250mLのビーカー（80％フル）で沸騰水10" ×10" 、220 VACのホットプレートを使用して。水との熱平衡に達するまで、ビーカーに真鍮ブロック（1センチメートルX 1cmの断面）を浸します。熱平衡は、通常<5分を取り、ビーカー中の水の再沸騰によって示されています。
- 火傷を作成する前に、痛みの軽減のための先制鎮痛薬（0.1mgの/ kgのブプレノルフィンの皮下注射）を管理します。
- 10分先制鎮痛薬の後、優しく火傷を誘導するために7秒のためのマウスの背中の毛を剃った領域に加熱された真鍮製のブロックを押してください。
注：燃焼手順を実行する際に作業者に熱傷を避けるためには、熱耐性の手袋を着用してください。 - subcutaneouを通して滅菌生理食塩水を0.5mLを投与sの脱水を防ぐために注入。
- 熱損傷の誘導後5分、ピペットを用いて、マウス熱傷にPBS中の5×10 6 CFUを含む細菌懸濁液の50μLを接種します。皮膚上のジグザグ運動に滅菌綿棒を移動させることにより、できるだけ均等に焼け領域に細菌細胞を分配するために火傷にアリコートを汚します。
- セクション4で説明したように直ちに細菌接種後、感染熱傷のための生物発光イメージングを行います。
- マウスが完全に麻酔から回復されるまで、水加熱外科用ベッド（37°C、リカバリ領域）上にマウスを置きます。ハウスバイオセーフティーレベル2の動物室でケージあたり5の最大数を持つマウス。
- 熱傷損傷後の最初の3日間1日2回の鎮痛剤（0.1ミリグラム/ kgのブプレノルフィンの皮下注射）を管理します。
。＆＃3.抗菌ブルーライトセラピー160;マウスにおけるバウマニ感染
- 細菌接種後24時間でABL治療を開始します。
- ABL照射に415nmのピーク発光を有する発光ダイオード（LED）を使用します。マウス18に照射領域への熱影響を防止するために、ヒートシンク上にLEDを取り付けます。 LEDが上下に移動することを可能にするクリップコネクタ付き光支持ロッドにLEDを固定します。
- パワー/エネルギーメータをオンにして、415nmの波長を選択するためにボタンを押してください。バックグラウンド（周囲光）を減算するための電力/エネルギーメータをリセットします。
- 右のLEDの下に電源/電力計を置きます。青色光、保護メガネを着用してください。 LEDライトをオンにし、光スポットが全体の領域をカバーするようにパワー/エネルギーメータのLED開口部（LEDからの光を収束レンズ）および光センサ（直径2cm）との間の距離を調整します光センサー。
- ポウの読書を慎重にチューニングするLEDドライバおよび記録R /エネルギーメータ。読み出しに係る放射照度を計算する：放射照度=レディング（W）/面積（cm 2）で。 LEDドライバを調整することにより、100ミリワット/ cm 2で、LEDの照度を調整します。
- LEDをオフにします。 LED開口及びパワー/エネルギーメータの光センサとの間の距離を測定します。
- ケタミン - キシラジンのカクテル（ - を20mg / kgでは100mg / kg）を腹腔内注射でマウスを麻酔。眼瞼反射の欠如は、適切な麻酔深度を示唆しています。
- ランダムABL処置群（n = 10）および未処理の対照群（n = 10）にマウスを分けます。
- ABL処置群について、光に露出オーバーを避けるために、アルミ箔を用いたマウスの目を覆います。水平位置で背中を維持するために、マウスの腹部下に35 mmのペトリ皿の蓋を、直接LEDの下でマウス熱傷を置きます。
- 正方形ペトリディ上にマウスを工程3.5に記載された電力/エネルギーメーターを交換SH。バックステップで説明したようにLED開口とマウス熱傷の表面との間の距離がLED開口及びパワー/エネルギーメータ（の光センサのレベルとの間に等しい位置にマウスの高さを調整3.5）。
- 100 mWの/ cm 2の照度で感染した火傷を照射します。 360 J / cm 2の総線量（ 例えば 、0、72、144、216、288及び360 J / cm 2で ）に達するまで、72 J / cm 2の用量でABLを送達します。各光投与後、セクション4で説明したように、マウスでの生物発光イメージングを行います。
- セクション4で説明したように、未処理の対照群のために、ABL処置群に用いたものと同じ時間間隔を使用して、マウス熱傷の生物発光イメージングを行います。
- マウスの回復前に、熱損失と低体温症を防ぐために水を加熱された手術用ベッドの上にマウスを置きます。回復までの活動とマウスの眼瞼反射を観察します。目の後マウスのE回復、家ケージ当たりそれら2-3。
- マウスにおける感染の時間生物の負担を監視するために日おきに、最初の3日間毎日、セクション4で議論したようにABLの治療後、生物発光イメージングを行います。
マウスにおける感染症の4生物発光イメージング
- 画像増強電荷結合素子カメラ、カメラコントローラ、試料室、および画像処理部19を含む低光イメージングシステムを使用してマウス。
- ケタミン - キシラジンのカクテル（ - を20mg / kgでは100mg / kg）を腹腔内注射でマウスを麻酔。軽く綿棒でマウスの眼瞼に触れます。眼瞼反射の欠如は、適切な麻酔深度を示唆しています。
- ライブイメージングソフトウェアを起動します。表示されたコントロールパネルで、[初期化]をクリックします。温度ボックスの色は、ステージの温度を示し、緑色に変わるまで待ちます試料室中で37℃に達しました。
- 直接カメラの下で感染熱傷と、撮像システムの標本チャンバ内のステージ（37°C）にマウスを置き。
注：火傷がドライになったときに細菌の生物発光が減少する可能性があります。したがって、イメージングの前にPBSで、マウスの火傷に潤いを与えることをお勧めします。 - コントロールパネルで、次のチェックマークを入れて「発光。」イメージングのための露光時間は生物発光強度に基づいて、ライブイメージングソフトウェアによって最適化されるように、「自動露出」を選択します。
- 「フィールドビューの」ドロップダウンリストから「C」を選択します。ソフトウェアは、焦点距離を決定させるための「スキャンミッドレンジ」オプションを選択します。次のオーバーレイにチェックマークを入れてください。
- 画像をキャプチャするために、「取得」をクリックしてください。 「イメージの編集ラベル」ボックスで、「OK。」をクリック「画像ウィンドウ」と「有料パレット」が表示されます。
- 自動選択のための自動ROIパラメータを設定します。
- 相対発光量（RLU）として生物発光強度を定量化し、（最も強い）ピンクからブルー（最も強い）19、20までの範囲の偽色スケールで生物発光を表示します。
- 生物発光強度の分析に基づいて時点を変化させるでマウス熱傷における細菌の生存割合を計算します。所与の時点での細菌の生存フラクション=右ABL露光17の前に測定されたその時点/生物発光強度で測定した生物発光強度。
マウスの5安楽死
- 次のように実験のエンドポイントは、次のとおり感染の（a）の解像度を撮像することによって決定されるように生物発光の損失によって証明されるように。 （b）は、焼けの外側に生物発光の広がりによって示される系統的感染の発生とされていますA; （C）正常年齢適合マウスと比較して≥15％の体重喪失、または手動刺激、不動、食べる又は飲むことができないことに対する応答の欠如によって示されるように痛みや苦痛から苦しみ。研究期間中、私たちは私たちの定義で説明したようにマウスが完全に、瀕死の状態に達している、および/または、我々はそれを安楽死させる必要がある場合には不明な点があるかどうかわからないような状況が発生した場合、我々はCCM獣医スタッフに連絡します行動計画のために、 （d）は、そうでないマウスは30日、研究の開始後に安楽死させます。
- 具体的には安楽死のための閉鎖ケージにマウスを移動し、ケージに二酸化炭素（CO 2）圧縮ガスを供給することにより、マウスを安楽死させます。
- ガスの流れを開始するためにCO 2タンクやバルブレギュレータを開きます。レギュレータ部が掲示する指示に基づいて、正しいPSI（平方インチ当たりのポンド）を読み取ることを確認し、再調整必要に応じて、典型的にはより高い5よりPSIとして正しいPSIにgulator。
- ゆっくりと記入してください。 （;ラットケージのため、〜7.5リットル/分の典型的なマウスケージのための、約2リットル/分）の流量は毎分チャンバ/ケージボリュームのない30％以下を置換すべきです。
- 移動や呼吸を止めるために動物のために約3〜5分待ちます。目が固定され、拡張されるべきです。 CO 2の流れを止めるためにCO 2のタンクやレギュレータバルブをオフにします。
- 心は親指と人差し指の間に胸を感じによって暴行されていないことを確認してください。眼球に触れることによって何の瞬目反射がないことを確認してください。
- ハートビートまたは点滅反射がある場合は、安楽死のプロセスを繰り返すか、気胸を（動物は、この手順を実行する前につま先のピンチに非応答でなければなりません）を作成するために胸腔を開くためにハサミを使用しています。
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Representative Results
以前に12、17報告したように、我々は使用のA.バウマニ株は、MDR臨床分離株です。細菌株はluxCDABEオペラ 11のトランスフェクションによって生物発光を作りました。 図1Aは、代表的なマウスからの連続した細菌のルミネセンス画像が5×10 6 のA.バウマンニで感染燃焼および細菌接種後24時間で単ABL露光にさらさ示します。代表的なマウス皮膚火傷標本の組織学的切片のグラム染色は、（24時間接種後に採取）感染熱傷（ 図1B）の表面上のA.バウマンニバイオフィルムの存在を実証しました。 図1Aに示されるように、細菌の発光はほとんどABLは、（送達照射の60分にあった360 J / cm 2の露光後に根絶しました100mW / cm 2）の放射照度。 図1Cは、5×10 6 のA.バウマンニに感染し、細菌接種後（N = 10）24時間でABLで処置したマウスの火傷からの平均細菌発光の用量反応曲線です。マウス熱傷でのA.バウマンニの3-log 10の不活性化を達成するために、約360 J / cm 2のABLが必要でした。マウスの細菌の発光は、ABLの未露光燃焼（データは示されていない; P <0.001）時間の等価期間中ほとんど変化しないままでした。
図1：感染マウスバーンズ中の細菌のABL不活性化。代表的なマウスからの（A）連続細菌発光画像は、A。バウマニの5×10 6 CFUを感染させ、24で360 J / cm 2のABLにさらさ熱傷細菌接種後の時間。 （B）マウス熱傷でのA.バウマンニバイオフィルム（矢印）の存在を示す代表的なマウス皮膚火傷のグラム染色した組織切片。皮膚サンプルを、細菌接種後24時間で採取しました。マウスの平均細菌発光（C）用量応答曲線は、5×10 6 のA.バウマンニに感染し、細菌接種の24時間後（N = 10）で360 J / cm 2でABLの暴露で処理燃えます。バー：標準偏差。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ABLは、感染症を治療するための新規な方法です。その作用機序は、化学療法とは全く異なっているので、それは理学療法の詳細です。抗菌効果を媒介する薬剤は、青色光照射（400から470 nm）です。青色LEDの開発により、我々は、MDR感染症のための効果的かつシンプルな光系抗菌アプローチへのアクセスを得ました。
このプロトコルでは、我々は、MDR、 のA.バウマニの生物発光歪みによる火傷感染症のマウスモデルの開発を記載しています。生物発光バクテリアを使用することで、感染の程度は、非侵襲的生物発光イメージングを経由して生きている動物でリアルタイムに監視することができます。細菌の遺伝子操作生物発光株と低光イメージング技術の使用は、抗菌治療中にリアルタイムで感染症を監視するための効率的な技術を作成します。この方法は、感染症の調査に使用することができます他の微生物種によって引き起こされると、他の部位に位置。抗菌アプローチの有効性評価に加えて、この方法はまた、感染の進行を追跡するために使用することができます。
このマウスモデルを用いて、我々は、ABL（415 nm）は正常に確立された感染症（ 図1AおよびC）中の細菌を不活性化することを実証しました。 ABL療法の前、細菌のクラスターは、バイオフィルムの特徴である確立された感染（ 図1B）で観察されました。バイオフィルムは、従来の抗生物質とそのプランクトンカウンターパート6,7に比べて宿主防御のより寛容であり、頻繁に持続感染8、9と関連しています。代表的な結果は、415-nmのABLに期待されている生物膜貫通あります。また、一緒に以前の報告29と、30、31、32、我々の結果は、ABLの有効性に関係なく、細菌の薬剤耐性プロファイルの持続することを示しています。
火傷感染症のマウスモデルの（1）開発、（2）ABL療法、および（3）生物発光イメージング：ここで説明するプロトコルは、3つの主要な手順を含みます。 （1）燃焼時間は、傷の深さと細菌の増殖に影響を与えます。火傷感染症のマウスモデルを開発している間、私たちは、感染の程度やABLのその後の効果に影響を与えるいくつかの要因があったことを指摘しました。焼成時間は、3~7秒から増加した場合、細菌の発光がはるかに強かった（感染のより高い程度を示す）24時間接種後に、感染に必要な非常に高いABL曝露（の根絶> 360 J / cm 2の）。 （2）細菌の接種材料は、開発Oのために重要なパラメータでありますF感染症。十分に低い接種物が頻繁にマウスでの安定した感染症を開発するために失敗しながら、高い細菌接種は通常、感染の高い範囲になります。後者の状態では、発光細菌は通常、細菌の接種後すぐに検出不可能になります。 （3）細菌と宿主との間の相互作用は、細菌種に依存します。我々はまた、感染モデルを開発するために緑膿菌を使用しました。私たちは、同じ条件の下で（ すなわち、時間や細菌接種を焼く）、 緑膿菌によって引き起こされる感染症はA.のbaumanniiの感染症よりもはるかに急速に進行することを見出し、および敗血症は常に48時間の接種後25以内にマウスで観察されました。
（1）適切な光放射照度が、ABL療法の最大効果のために必要である：ABL療法の実行のために、対処する必要があるいくつかの重要な点があります。 （2）マウスのバーンインの表面をhouldはできるだけ水平に配置されます。適切に燃焼面を配置する失敗はABL治療の有効性を損なう可能性があります。 （3）露光中に、マウスの目はレーザを光源として使用する場合は特に、アルミホイルで保護することが示唆されています。 （4）露光時には、注意は、それらが麻酔から目覚めた場合にマウスをモニターするために取られるべきです。この場合、麻酔薬の小さな追加の投与量は、麻酔した動物を維持するために投与されなければなりません。 （5）ABL処置マウスおよび未処置マウスの両方は場合麻酔下、体温を維持するために加熱ベッド上に配置されるべきです。火傷が乾燥になったときに生物発光イメージングのプロセスの間に、細菌の生物発光は減少する可能性があります。したがって、イメージングの前にPBSで、マウスの火傷に潤いを与えることをお勧めします。
このプロトコルで説明した技術のいくつかの制限があります：（1）エクステのモニタリングのためにリアルタイムでの感染のNTは、生物発光細菌の菌株を使用する必要があります。臨床株は、動物モデルで試験することができる前に、したがって、それは遺伝的にルクスCDABEオペロン 11のトランスフェクションによって変更する必要があります。 （2）ABLの有効性は、波長33及び細菌種/使用した菌株34に関係しています。青色波長は、一緒に他のパラメータを用いて、さらに異なる細菌種/菌株を不活性化するために最適化されなければなりません。 （3）私たちは、マウスのみで表面的な感染症を調べました。根深い感染症、ABLの局所送達は、感染症に到達することができないかもしれないので、間質光配信は35を必要としてもよいです。 （4）深い感染19を撮像する場合は特に、撮像システムの感度限界があります。結果として、生物発光の画素が完全に除去された場合でも、依然としてVIがあるかもしれません可能な細菌細胞、細菌の再増殖が発生することができ、残りの。 ABLへの長時間の曝露は、細菌の再増殖を防ぐために、発光細菌の除去後に推奨されます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS | PerkinElmer Inc, Waltham, MA | IVIS Lumina Series III | Pre-clinical in vivo imaging |
| Light-emitting diode LED | VieLight Inc, Toronto, Canada | 415 nm | Light source for illumination |
| Power/energy meter | Thorlabs, Inc., Newton, NJ | PM100D | Light irradiance detector |
| Mouse | Charles River Laboratories, Wilmington, MA | BALB/c | 7-8 weeks age, 17-19 g weight |
| Acinetobacter baumannii | Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX | Clinical isolate | Engineered luminescent strain |
| Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 721016 | 0.9% Sodium Chloride |
| Phosphate Buffered Saline, 1x Solution | Fisher Scientific | BP24384 | A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures |
| Brain Heart Infusion | Fisher Scientific | B11059 | Bacterial culture medium |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | For bacterial suspension centrifuge |
| Benchtop Incubated Orbital Shakers | Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH | Incu-Shaker Mini | For culturing of bacteria |
| Inoculating Loops | Fisher Scientific | 22-363-605 | For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice |
| Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200 µL | Fisher Scientific | 02-707-502 | Pipet Tips |
| Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-220 | For bacterial suspension seperation |
| Brass Block | Small Parts, Inc., Miami, FL | 10 mm by 10 mm | For creation of burns in mice |
| Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves | Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY | PBI83514 | Heat Resistant Gloves |
| Greiner dishes | Sigma-Aldrich Co. LLC | P5112-740EA | 35 mm ×10 mm |
| Corning Digital Hot Plate | Cole-Parmer Instrument Company, LLC | UX-84301-65 | 10" x 10", 220 VAC, for boiling water |
| Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed | E-Z Systems | EZ-211 | Prevents heat loss and hypothermia during surgery |
| Vet ointment | S&K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, Augensalbe | opthalmic ointment to prevent eye dryness |
References
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