Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In vivo undersøkelse av antimikrobiell blå lysterapi for multidrug-resistent Acinetobacter baumannii Brenninfeksjoner ved bruk av bioluminescens-bildebehandling

Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/54997
Automatic Translation
1,2,3, 1, 1, 4, 1, 1
1Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Medical Oncology, Beijing Institute of Translational Medicine, Chinese Academy of Sciences, 3Cancer Center, Aviation General Hospital, Beijing, 4Infectious Disease Service, Brooke Army Medical Center

Abstract

Brenn infeksjoner fortsette å være en viktig årsak til sykelighet og dødelighet. Den økende veksten av multilegemiddelresistente (MDR) bakterier har ført til hyppige feil av tradisjonelle antibiotika behandlinger. Alternative behandlingsformer er sterkt behov for å takle MDR bakterier.

En innovativ ikke-antibiotiske tilnærmingen, har antimikrobiell blått lys (Abl), vist lovende effektivitet mot MDR-infeksjoner. Virkningsmekanismen av ABL er ennå ikke fullt ut forstått. Det er alminnelig antatt at naturlig forekommende endogene fotosensibiliserende kromoforer i bakterier (f.eks, jernfrie porfyriner, flavins, etc.) blir eksitert ved hjelp av Abl, som i sin tur frembringer cytotoksiske reaktive oksygenarter (ROS) gjennom en fotokjemisk prosess.

I motsetning til en annen lys-baserte antimikrobiell tilnærming, antimikrobiell fotodynamisk terapi (aPDT), abl behandling ikke krever medvirkning av en eksogen photosensitizer. Alt den trenger for å tre i kraft er bestråling av blått lys; Derfor er det enkelt og billig. Abl-reseptorene er de endogene lyssensitiverende cellulære i bakterier, i stedet for DNA. Således er abl antas å være mye mindre genotoksiske vertsceller enn ultrafiolett-C (UVC) bestråling, som direkte fører til DNA-skade i vertsceller.

I denne artikkelen presenterer vi en protokoll for å vurdere effektiviteten av abl-terapi for MDR Acinetobacter baumannii infeksjoner i en musemodell for brannskader. Ved å bruke en konstruert bioluminescent belastning, kunne vi invasivt overvåke omfanget av smitte i sanntid i levende dyr. Denne teknikken er også et effektivt verktøy for å overvåke den romlige fordeling av infeksjoner hos dyr.

Introduction

Burn infeksjoner, som ofte rapportert på grunn av kutane termiske skader, fortsette å være en viktig årsak til sykelighet og dødelighet 1. Styringen av forbrennings infeksjoner er blitt ytterligere svekket av den økende veksten av multilegemiddelresistente (MDR) Bakteriestammene 2 på grunn av den massive bruk av antibiotika. Et viktig MDR Gram-negative bakterier er Acinetobacter baumannii, som er kjent for å være assosiert med siste sår kjempe og er resistente overfor nesten alle tilgjengelige antibiotika 3. Tilstedeværelsen av biofilm på den skadede brennpunktene har blitt rapportert 4, 5 og antas å forverre toleranse overfor antibiotika og vertsforsvar 6, 7, forårsaker vedvarende infeksjoner 8, 9. Derfor er det en pressing behov for utvikling av alternative behandlinger. I den nylig annonserte Nasjonal strategi for bekjempelse av antibiotikaresistente bakterier, har utviklingen av alternative behandlingsformer mot antibiotika blitt bemerket som en handling av regjeringen i USA 10.

Lys-baserte antimikrobielle tilnærminger, som navnet indikerer, krever lys bestråling med eller uten andre midler. Disse metodene inkluderer antimikrobiell fotodynamisk terapi (aPDT), ultrafiolett-C (UVC) bestråling, og antimikrobiell blått lys (ABL). I tidligere studier har de vist lovende effektivitet i å drepe MDR-bakteriestammer 11, 12, 13. Blant de tre lys-baserte tilnærminger, har ABL økt oppmerksomhet de siste årene på grunn av sine iboende antibakterielle egenskaper uten bruk av fotosensitisere 14. i komparativeison til aPDT, ABL bare omfatter bruk av lys, mens aPDT krever en kombinasjon av lys og et fotosensibiliserende middel. Derfor er ABL enkel og rimelig 14. I forhold til UVC er abl antas å være mye mindre cytotoksiske og genotoksiske vertsceller 15.

Målet med denne protokollen er å undersøke effektiviteten av abl for behandling av brann infeksjoner forårsaket av MDR A. baumannii i en musemodell. Vi bruker bioluminescerende patogene bakterier for å utvikle nye musemodeller av brann infeksjoner som gjør at ikke-invasiv overvåkning av bakteriebelastning i sanntid. Sammenlignet med den tradisjonelle metoden for kroppsfluid / vevsprøver og påfølgende platekledning og kolonitelling 16, gir denne teknikken nøyaktige resultater. Prosessen med prøvetagnings kunne innføre en annen kilde til eksperimentelle feil. Siden den bakterielle luminescens intensitet er lineært proporsjonal med tilsvrende bakterie CFU 17, kan vi direkte måle overlevelse av bakterier etter en viss dose av lysbestråling. Ved å overvåke bakteriemengden i levende dyr som mottar lyset behandling i sann tid, kan kinetikken av bakteriedrep karakteriseres ved anvendelse av et betydelig redusert antall mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av bakteriekultur

  1. Legg 7,5 ml hjerne-hjerte-infusjon (BHI) medium til et 50 ml sentrifugerør. Seed A. baumannii cellene i BHI-medium og deretter inkubere A. baumannii kulturen i en inkubator (37 ° C) i 18 timer.
  2. Sentrifuger kulturen av celler ved 3500 x g i 5 minutter, fjern supernatanten, og vask pelletene i fosfat-bufret saltvann (PBS).
  3. Re-suspendere bakteriene pelletene i frisk PBS og grundig pipettere suspensjonen.
  4. Samle 100 pl av bakteriesuspensjonen og foreta en fortynning på 1:10 ved bruk av frisk PBS.
  5. Overfør fortynning til et 1,5 ml semi-mikro-kyvette og måle den optiske tetthet (OD) ved en bølgelengde på 600 nm (OD 600 nm).
  6. Beregn OD 600 nm av den opprinnelige (ufortynnet) suspensjon i PBS i henhold til den målte OD 600 nm verdi av fortynningen og fortynningen (10).
  7. Juster thE opprinnelig suspensjon i PBS til OD 600 nm = 0,6 (tilsvarende en celletetthet på 10 8 CFU / ml).

2. Musemodell for branninfeksjon forårsaket av bioluminescerende A. baumannii

  1. Bruk voksne kvinnelige BALB / c mus i alderen 7-8 uker og veier 17-19 g. Tillat musene å akklimatisere til laboratorieforhold i minst 3 dager før eksperimentets start. Opprettholde musene i en 12 h lys / mørk syklus under en romtemperatur på 21 ° C og gi dem mat og vann ad libitum .
  2. Bedøv musene med en intraperitoneal injeksjon av en ketamin-xylazin-cocktail (100 mg / kg - 20 mg / kg). Rør lett på palpebraen til hver mus med en bomullspinne; Et fravær av palpebralrefleksen antyder en passende bedøvelsesdybde. Dekk musens øyne med vetens salve for å forhindre øynene fra tørrhet under anestesi.
  3. Barber musene på ryggen for å utsette så mye hud som mulig ved å bruke en 50-blad hårklipperen.
  4. Plassere lokket på en 35 mm Petri skål under buken hos musene for å holde ryggen i en forholdsvis vannrett stilling.
  5. Koke vann i et 250 ml begerglass (80% fullstendig) ved å bruke en 10" x 10" , 220 VAC kokeplate. Dyppes en messingblokk (1 cm x 1 cm tverrsnitt) i begerglasset inntil termisk likevekt med vannet er nådd. Varmeutjevning vanligvis tar <5 min og er angitt ved re-koking av vannet i begerglasset.
  6. Før oppretting av brannskader, administrere fortrinns analgetika (en subkutan injeksjon på 0,1 mg / kg buprenorfin) for smertelindring.
  7. Ti minutter etter Fortrinns analgetika, trykke forsiktig oppvarmet messingblokken til det barberte området på baksiden av musene i 7 s for å fremkalle brannsår.
    MERK: For å unngå termisk skade på arbeids personell, slitasje varmebestandige hansker ved den brennende prosedyre.
  8. Administreres 0,5 ml sterilt saltvann gjennom subcutaneous injeksjon for å unngå dehydrering.
  9. Fem minutter etter induksjon av termisk skade, inokuler 50 ul av bakteriesuspensjon inneholdende 5 x 10 CFU 6 i PBS på muse brenner ved hjelp av en pipette. Ved å bevege en steril bomullsdott i et sikk-sakk-bevegelse på huden, smøre aliquoter på de brenner for å fordele bakteriecellene i den brente området så jevnt som mulig.
  10. Umiddelbart etter bakteriell inokulering utføre bioluminescens bildedannelse for de infiserte brannskader, som beskrevet i seksjon 4.
  11. Plasser mus på en vannoppvarmet kirurgisk seng (37 ° C, utvinning område) til musene fullstendig restituert fra anestesi. Hus musene med et maksimalt antall 5 per bur i et biosikkerhetsnivå-2 dyrerom.
  12. Administrere analgetika (subkutan injeksjon av 0,1 mg / kg buprenorfin) to ganger daglig i de første tre dagene etter brannskade.

3. Antimicrobial Blue Light Therapy for A. & #160; baumannii Infeksjon i Mus

  1. Begynn Abl terapi ved 24 timer etter bakterie inokulering.
  2. Bruke et lysemitterende diode (LED) med en toppemisjon ved 415 nm for Abl bestråling. Montere LED på en varmeavleder for å forhindre termiske virkninger på det bestrålte område i mus 18. Fest førte til en optisk bærestav med klips-koblings for å tillate lampen å bevege seg opp og ned.
  3. Slår på strøm / energimåler og trykker på knappen bølgelengde for å velge 415 nm. Tilbakestill den effekt / energimåleren for å subtrahere bakgrunns (omgivende lys).
  4. Sett strøm / energi meter rett under lampen. Slitasje blått-lys-vernebriller. Slå på LED-lys og justere avstanden mellom den LED-åpningen (en linse som konvergerer lyset fra LED) og lyssensoren (2 cm i diameter) av den effekt / energimåleren, slik at lysflekken dekker hele området av lyssensoren.
  5. Nøye justere LED-driver og registrere avlesning av Power / energimåler. Beregn irradians henhold til lesningen: Strålings = Reading (W) / område (cm2). Juster irradians av LED til 100 mW / cm2 ved å justere LED driveren.
  6. Slå av LED. Mål avstanden mellom de LED-åpningen og lyssensoren av kraft / energimåleren.
  7. Bedøve musene med en intraperitoneal injeksjon av en ketaminxylazin cocktail (100 mg / kg - 20 mg / kg). Et fravær av øyelokksrefleksen antyder en bedøvelsesmiddel passende dybde.
  8. Tilfeldig dele musene til et abl-behandlede gruppen (n = 10) og en ubehandlet kontrollgruppe (n = 10).
  9. For Abl-behandlede gruppen, dekker øynene til mus med aluminiumsfolie for å unngå overeksponering for lys. Plasser muse brenner rett under lampen, med lokket av en 35-mm petri skål under musen magen for å holde ryggen i en horisontal stilling.
  10. Erstatte den effekt / energimåleren som er nevnt i trinn 3.5 med en mus på en firkantet petri dish. Juster høyde av musen tilbake til en stilling der avstanden mellom den LED-åpningen og overflaten av mus brenne er lik den som er mellom LED-åpningen og nivået av lyssensoren av kraft / energimåler (som beskrevet i trinn 3.5).
  11. Bestråle de infiserte brannskader ved en bestråling på 100 mW / cm2. Lever Abl i doser på 72 J / cm2, inntil en total dose på 360 J / cm2 er nådd (f.eks, 0, 72, 144, 216, 288 og 360 J / cm2). Etter hver lysdose utføre bioluminescens avbildning for mus, som diskutert i avsnitt 4.
  12. For den ubehandlede kontrollgruppen, utføre bioluminescens avbildning av musebrannskader, som diskutert i seksjon 4, med de samme tidsintervallene som anvendes for abl-behandlede gruppen.
  13. Før utvinning av musene, plassere mus på vannoppvarmet kirurgisk seng for å hindre varmetap og hypotermi. Observere aktivitet og øyelokksrefleksen av musene til bedring. etter the utvinning av musene, huse dem 2-3 per bur.
  14. Etter Abl terapi, utføre bioluminescens avbildning, som diskutert i seksjon 4, daglig i de første 3 dager og deretter annenhver dag for å overvåke den temporale bio-byrden av infeksjoner i mus.

4. Bioluminesens Imaging av infeksjoner i mus

  1. Bilde musene ved hjelp av en lav-lys avbildningssystem som omfatter en forsterket charge-coupled device kamera, et kamera kontroller, et prøvekammer, og en bildeprosessor 19.
  2. Bedøve musene med en intraperitoneal injeksjon av en ketaminxylazin cocktail (100 mg / kg - 20 mg / kg). Så vidt berører palpebral av musene med en bomullspinne; et fravær av øyelokksrefleksen antyder en bedøvelsesmiddel passende dybde.
  3. Starter live bildebehandlingsprogrammer. I kontrollpanelet som vises, klikker Initial. Vent inntil fargen på temperatur boksen blir grønn, noe som indikerer at temperaturen av sceneni prøvekammeret har nådd 37 ° C.
  4. Plasser musene på scenen (37 ° C) i prøvekammeret av det billeddannende system, med de infiserte brannskader direkte under kameraet.
    MERK: bioluminesens av bakterier kan redusere når de brenner bli tørr. Derfor anbefales det å fukte muse brenner med PBS før avbildning.
  5. I kontrollpanelet, sette en hake ved siden av "Luminescence." Velg "Automatisk eksponering", slik at eksponeringstiden for bildediagnostikk vil bli optimalisert av live bildebehandlingsprogrammer basert på bioluminescence intensitet.
  6. Velg "C" fra "Field of View" drop-down listen. Velg "Scan mid range" for å la programvaren bestemme brennvidde. Sett en hake ved siden av overlegg.
  7. Klikk "Acquire" for å ta bildet. I "Rediger bilde Label" boksen, klikk på "OK;" en "Image Window" og "Toll Palette" vises.
  8. Sett Auto ROI parametre for automatisk valg.
  9. Kvantifisere Bioluminescens intensitet som relative luminescens heter (RLU) og vise bioluminescens i en falsk-fargeskala som strekker seg fra rosa (mest intense) til blå (minst intens) 19, 20.
  10. Beregn overlevelsesfraksjonen av bakterier i mus forbrenninger ved varierende tidspunkter, basert på bioluminescens intensitet analyse. Overlevelsen fraksjon av bakterier på et gitt tidspunkt = Bioluminescens intensiteten målt ved det tidspunktet / Bioluminescens intensiteten målt rett før Abl eksponering 17.

5. Avliving av musene

  1. Endepunktene for forsøket er som følger: (a) oppløsning av den infeksjon som vist ved tap av bioluminescens som bestemt ved billeddannelse; (B) forekomst av systematiske infeksjoner som indikert ved spredning av bioluminescens utsiden av den brente eren; (C) tap av ≥15% av kroppsvekten i forhold til normale alderstilpassede mus, eller som lider av smerte og ubehag som indikeres ved mangel på respons til manuell stimulering, ubevegelighet, en manglende evne til å spise eller drikke. I løpet av studien, hvis vi støter på en situasjon der vi er usikre på om en mus har fullt nådd statusen for døende, som skissert av vår definisjon, og / eller vi er usikker på om vi må avlive den, vil vi ta kontakt med en CCM veterinær ansatte for en plan handling; (D) ellers musene blir avlivet 30 dager etter begynnelsen av undersøkelsen.
  2. Flytte musene inn i lukkede bur spesielt for eutanasi og avlive mus ved å tilføre karbondioksyd (CO 2) komprimert gass inn i merdene.
    1. Åpne CO 2 tank eller ventilregulatoren for å igangsette strømmen av gass. Kontroller at regulatoren leser riktig psi (pounds per kvadrattomme) basert på instruksjoner postet av enheten, og juster regulator til riktig psi etter behov, vanligvis ikke høyere enn 5 MPa.
    2. Fyll sakte. Strømningshastigheten skal fortrenge ikke mer enn 30% av kammer / bur volum pr min (for en typisk mus bur, ~ 2 l / min, for en rotte bur, ~ 7,5 l / min).
    3. Vent i omtrent 3-5 minutter for at dyret skal slutte å bevege seg eller å puste; øynene bør være fast og utvidet. Slå av CO2 tank eller reguleringsventilen for å stoppe strømmen av CO2.
    4. Sørg for at hjertet ikke slår av følelsen i brystet mellom tommelen og pekefingeren. Pass på at det ikke er blunkerefleksen ved å berøre øyeeplet.
      1. Hvis det er en hjerteslag eller blunkerefleksen, gjentar eutanasi prosessen eller å bruke saks for å åpne brysthulen for å skape en pneumothorax (dyret må være ikke-respondere på en tå klype før gjennomføring av denne fremgangsmåten).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A. baumannii belastningen som vi brukte er en MDR klinisk isolat, som rapportert tidligere 12, 17. Bakteriestammen ble gjort selvlysende ved transfeksjon av luxCDABE opera 11. Figur 1A viser de suksessive bakteriell luminescens bilder fra en representativ mus brenne infisert med 5 x 10 6 A. baumannii og eksponert til en enkel ABL eksponering ved 24 timer etter bakterie inokulering. En Gram-farging av det histologiske snitt av en representativ musehud brenne prøven (høstet ved 24 timer etter inokulering) viste tilstedeværelse av A. baumannii biofilm på overflaten av infiserte brannskade (figur 1B). Som vist i figur 1A, ble den bakterielle luminescens nesten utryddet etter en eksponering på 360 J / cm2 abl ble levert (60 minutters bestråling veden bestråling på 100 mW / cm2). Figur 1C er den dose-responskurve av det midlere bakteriell luminescens fra mus forbrenninger infisert med 5 x 10 6 A. baumannii og behandlet med Abl ved 24 timer etter bakterie inokulering (n = 10). For å oppnå et 3-log 10 inaktivering av A. baumannii i mus brannsår, omtrent 360 J / cm2 abl var nødvendig. Bakterie luminescens av musen brenner ueksponerte til ABL nesten uforandret under en tilsvarende tidsperiode (data ikke vist, P <0,001).

Figur 1
Figur 1: ABL Inaktivering av bakterier i infiserte mus Burns. (A) Suksessive bakterielle luminescens bilder fra en representativ mus brenne infisert med 5 x 10 6 CFU av A. baumannii og eksponert til 360 J / cm2 ved 24 ablh etter bakteriell inokulering. (B) Gram-farget histologisk snitt av en representativ mus brannsår som viser nærvær av A. baumannii biofilmer (piler) i mus brenne. Huden Prøven ble høstet ved 24 timer etter bakterie inokulering. (C) Dose-responskurven for midlere bakteriell luminescens fra mus brenner infisert med 5 x 10 6 A. baumannii og behandlet med en eksponering på 360 J / cm2 abl ved 24 timer (n = 10) etter bakteriell inokulering. Barer: standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Abl er en ny fremgangsmåte for behandling av infeksjoner. Siden dens virkningsmekanisme er helt forskjellig fra den til kjemoterapi, er det mer av et fysikalsk. Det middel som medierer den antimikrobielle virkning er blått lys bestråling (400-470 nm). Med utviklingen av blå lysdioder, fikk vi tilgang til en effektiv og enkel lys-baserte antimikrobielle tilnærming for MDR infeksjoner.

I denne protokoll har vi beskrevet utviklingen av en musemodell for brann infeksjoner forårsaket av et bioluminescent stamme av MDR, A. baumannii. Med bruk av bioluminescente bakterier, kan graden av infeksjon være en ikke-invasiv overvåkes i sanntid i levende dyr via selvlysende avbildning. Bruken av konstruerte bioluminescerende stammer av bakterier og den svakt lys avbildningsteknikk skaper en effektiv teknikk for overvåkning av infeksjoner i sanntid under antimikrobiell behandling. Denne metoden kan også brukes i undersøkelser av infeksjonerforårsaket av andre mikrobielle arter og plassert på andre steder. Foruten effektmålingen av antimikrobielle nærmer seg, kan denne metoden også brukes til å spore fremdriften for infeksjon.

Ved å bruke denne musemodellen, demonstrerte vi at abl-(415 nm) med hell inaktiverte bakterier i etablerte infeksjoner (figur 1A og C). Før Abl behandling, ble grupper av bakterier observert i de etablerte infeksjoner (figur 1B), som er en funksjon av biofilmer. Biofilmer er mer tolerante overfor tradisjonelle antibiotika og vertsforsvar sammenlignet med sine motparter planktoniske 6, 7 og er ofte forbundet med vedvarende infeksjoner 8, 9. De representative Resultatene er lovende ved at 415-nm ABL biofilm-gjennomtrengende. I tillegg sammen med tidligere rapporter 29,30, 31, 32, våre resultater viser at effektiviteten av Abl vedvarer uavhengig av medikamentresistensprofilen av bakterier.

Protokollen er beskrevet her omfatter tre hovedfremgangsmåter: (1) utvikling av en musemodell for forbrenningsinfeksjoner, (2) abl terapi, og (3) bioluminescens avbildning. Mens utvikle en musemodell av brenne infeksjoner, ble det registrert at det var flere faktorer som påvirker graden av infeksjon og den påfølgende effektiviteten av Abl: (1) Brenntiden påvirker såret dybde og spredning av bakterier. Når den brenntiden ble øket fra 3 til 7 s, bakteriell luminescens var mye sterkere (som indikerer en større grad av infeksjon) ved 24 timer etter inokulering, og utrydde infeksjonen kreves mye høyere ABL eksponeringer (> 360 J / cm2 ). (2) Et inokulum av bakterier er en nøkkelparameter for utvikling of infeksjoner. En høyere bakterieinokulum resulterer vanligvis i en større grad av infeksjon, mens en tilstrekkelig lav inokulum svikter ofte for å utvikle stabile infeksjoner i mus. I sistnevnte tilstand, blir bakteriell luminescens vanligvis ikke målbart snart etter bakteriell inokulering. (3) Den vekselvirkning mellom bakteriene og verter er avhengig av bakteriearter. Vi brukte også P. aeruginosa å utvikle en infeksjon modell. Vi har funnet at, under de samme betingelser (dvs. brennetid og bakterieinokulum), infeksjoner forårsaket av P. aeruginosa kommet mye hurtigere enn A. baumannii infeksjoner, sepsis og ble alltid observert hos mus i løpet av 48 timer etter inokulering 25.

For utførelsen av Abl terapi, er det flere viktige punkter som må tas opp: (1) Riktig lys irradians er nødvendig for den maksimerte effekt av Abl terapi. (2) Overflaten av brenningen i mus should plasseres så horisontalt som mulig. En unnlatelse av å hensiktsmessig plassere brennflaten kan kompromittere virkningen av Abl terapi. (3) I løpet av lyseksponering, er det foreslått at øynene til musene være beskyttet med aluminiumsfolie, særlig når en laser brukes som lyskilden. (4) I løpet av lyseksponering, bør man sørge for å overvåke musene i tilfelle de våkne fra bedøvelsen. I dette tilfellet bør en liten ekstra dose av bedøvelse administreres for å holde dyrene bedøvet. (5) både abl-behandlede mus og ubehandlede mus bør plasseres på en varme seng for å holde kroppstemperaturen når under anestesi. Under prosessen med bioluminescens avbildning kan Bioluminescens av bakterier avta når de brenner blir tørre. Derfor anbefales det å fukte muse brenner med PBS før avbildning.

Det er også noen begrensninger av de teknikker som omtales i denne protokollen: (1) For det formål å overvåke den extent av infeksjon i sann tid, bioluminiserende må bakteriestammer anvendes. Derfor, før en klinisk belastning kan bli testet i dyremodellen, det må være genetisk modifisert ved transfeksjon av lux operon CDABE 11. (2) Effektiviteten av ABL er relatert til bølgelengdene 33 og bakteriearter /-stammer som 34 benyttes. De blå bølgelengder, sammen med andre parametere, bør optimaliseres ytterligere for inaktivering av forskjellige bakteriearter / stammer. (3) Vi undersøkte overflateinfeksjoner hos mus. For dype infeksjoner, kan det topisk avlevering av Abl ikke være i stand til å nå de infeksjoner, så interstitiell lette levering kan være nødvendig 35. (4) Det er en følsomhet og begrensning av det billeddannende system, særlig når avbildning av dype infeksjoner 19. Som et resultat, selv når bildeelementer i Bioluminescens er fullstendig eliminert, kan det likevel være VIMulige bakterielle celler gjenstår, slik at bakteriell gjenvekst kan forekomme. En utvidet eksponering for aBL anbefales etter eliminering av bakteriell luminescens for å forhindre bakteriell gjenvekst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IVIS  PerkinElmer Inc, Waltham, MA IVIS Lumina Series III Pre-clinical in vivo imaging
Light-emitting diode LED VieLight Inc, Toronto, Canada  415 nm Light source for illumination
Power/energy meter Thorlabs, Inc., Newton, NJ PM100D Light irradiance detector
Mouse  Charles River Laboratories, Wilmington, MA BALB/c 7-8 weeks age, 17-19 g weight
Acinetobacter baumannii  Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX Clinical isolate Engineered luminescent strain
Insulin Syringes Fisher Scientific 14-826-79 BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection
Sodium Chloride Fisher Scientific 721016 0.9% Sodium Chloride
Phosphate Buffered Saline, 1x Solution Fisher Scientific BP24384  A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures
Brain Heart Infusion Fisher Scientific B11059 Bacterial culture medium
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-70C For bacterial suspension centrifuge
Benchtop Incubated Orbital Shakers Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH  Incu-Shaker Mini For culturing of bacteria
Inoculating Loops Fisher Scientific 22-363-605   For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice
Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200 µL Fisher Scientific 02-707-502 Pipet Tips
Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge Fisher Scientific 75-004-220 For bacterial suspension seperation
Brass Block Small Parts, Inc., Miami, FL 10 mm by 10 mm  For creation of burns in mice
Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY PBI83514  Heat Resistant Gloves
Greiner dishes Sigma-Aldrich Co. LLC P5112-740EA 35 mm ×10 mm
Corning Digital Hot Plate Cole-Parmer Instrument Company, LLC UX-84301-65 10" x 10", 220 VAC, for boiling water 
Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed E-Z Systems EZ-211 Prevents heat loss and hypothermia during surgery
Vet ointment S&K Pharma, GmbH Kerato Biciron 5%, Augensalbe opthalmic ointment to prevent eye dryness

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibran, N. S. Summary of the 2012 ABA Burn Quality Consensus conference. J Burn Care Res. 34 (4), 361-385 (2013).
  2. Sommer, R., Joachim, I., Wagner, S., Titz, A. New approaches to control infections: anti-biofilm strategies against gram-negative bacteria. Chimia (Aarau). 67 (4), 286-290 (2013).
  3. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev. 21 (3), 538-582 (2008).
  4. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  5. Schaber, J. A. Pseudomonas aeruginosa forms biofilms in acute infection independent of cell-to-cell signaling. Infect Immun. 75 (8), 3715-3721 (2007).
  6. Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int J Antimicrob Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
  7. Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiol Mol Biol Rev. 78 (3), 510-543 (2014).
  8. Akers, K. S. Biofilms and persistent wound infections in United States military trauma patients: a case-control analysis. BMC Infect Dis. 14, 190 (2014).
  9. Burmolle, M., et al. Biofilms in chronic infections - a matter of opportunity - monospecies biofilms in multispecies infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 59 (3), 324-336 (2010).
  10. National strategy on combating antibiotic-resistant bacteria. , https://www.whitehouse.gov/sites/default/files/docs/carb_national_strategy.pdf (2014).
  11. Dai, T. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3929-3934 (2009).
  12. Zhang, Y. Antimicrobial blue light therapy for multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infection in a mouse burn model: implications for prophylaxis and treatment of combat-related wound infections. J Infect Dis. 209 (12), 1963-1971 (2014).
  13. Dai, T., et al. Ultraviolet C light for Acinetobacter baumannii wound infections in mice: potential use for battlefield wound decontamination? J Trauma Acute Care Surg. 73 (3), 661-667 (2012).
  14. Dai, T. Blue light for infectious diseases: Propionibacterium acnes, Helicobacter pylori, and beyond? Drug Resist Updat. 15 (4), 223-236 (2012).
  15. Yin, R. Light based anti-infectives: ultraviolet C irradiation, photodynamic therapy, blue light, and beyond. Curr Opin Pharmacol. 13 (5), 731-762 (2013).
  16. Haisma, E. M. Inflammatory and antimicrobial responses to methicillin-resistant Staphylococcus aureus in an in vitro wound infection model. PLoS One. 8 (12), e82800 (2013).
  17. Wang, Y. Antimicrobial Blue Light Inactivation of Gram-Negative Pathogens in Biofilms: In Vitro and In Vivo Studies. J Infect Dis. 213 (9), 1380-1387 (2016).
  18. Chen, D., Shen, Y., Huang, Z., Li, B., Xie, S. Light-Emitting Diode-Based Illumination System for In Vitro Photodynamic Therapy. Int J Photoenergy. 2012 (2), (2012).
  19. Demidova, T. N., Gad, F., Zahra, T., Francis, K. P., Hamblin, M. R. Monitoring photodynamic therapy of localized infections by bioluminescence imaging of genetically engineered bacteria. J Photochem Photobiol B. 81 (1), 15-25 (2005).
  20. Hamblin, M. R., Zahra, T., Contag, C. H., McManus, A. T., Hasan, T. Optical monitoring and treatment of potentially lethal wound infections in vivo. J Infect Dis. 187 (11), 1717-1725 (2003).
  21. Rowan, M. P. Burn wound healing and treatment: review and advancements. Critical Care. 19, 243 (2015).
  22. Marx, D. E., Barillo, D. J. Silver in medicine: The basic science. Burns. 40 (Supplement 1), S9-S18 (2014).
  23. Heyneman, A., Hoeksema, H., Vandekerckhove, D., Pirayesh, A., Monstrey, S. The role of silver sulphadiazine in the conservative treatment of partial thickness burn wounds: A systematic review. Burns. 42 (7), 1377-1386 (2016).
  24. Roberts, J. A. Individualised antibiotic dosing for patients who are critically ill: challenges and potential solutions. Lancet Infect Dis. 14 (6), 498-509 (2014).
  25. Dai, T. Blue light eliminates community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in infected mouse skin abrasions. Photomed Laser Surg. 31 (11), 531-538 (2013).
  26. Uppu, D. S. Amide side chain amphiphilic polymers disrupt surface established bacterial bio-films and protect mice from chronic Acinetobacter baumannii infection. Biomaterials. 74, 131-143 (2016).
  27. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  28. Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2015).
  29. Song, H. H. Phototoxic effect of blue light on the planktonic and biofilm state of anaerobic periodontal pathogens. J Periodontal Implant Sci. 43 (2), 72-78 (2013).
  30. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Viana, M. S., Meira, G. A. In vitro effectiveness of 455-nm blue LED to reduce the load of Staphylococcus aureus and Candida albicans biofilms in compact bone tissue. Lasers Med Sci. 31 (1), 27-32 (2015).
  31. Guffey, J. S., Wilborn, J. In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm blue light. Photomed Laser Surg. 24 (6), 684-688 (2006).
  32. Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro. Photomed Laser Surg. 27 (2), 221-226 (2009).
  33. Bumah, V. V., Masson-Meyers, D. S., Cashin, S. E., Enwemeka, C. S. Wavelength and bacterial density influence the bactericidal effect of blue light on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Photomed Laser Surg. 31 (11), 547-553 (2013).
  34. Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. Inactivation of bacterial pathogens following exposure to light from a 405-nanometer light-emitting diode array. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 1932-1937 (2009).
  35. Kim, M. Optical lens-microneedle array for percutaneous light delivery. Biomedical Optics Express. 7 (1o), 4220-4227 (2016).

Tags

Immunologi antimikrobielle blått lys multiresistens, Brannsår musemodell infeksjon bioluminescens avbildning
<em>In vivo</em> undersøkelse av antimikrobiell blå lysterapi for multidrug-resistent <em>Acinetobacter baumannii</em> Brenninfeksjoner ved bruk av bioluminescens-bildebehandling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Harrington, O. D., Wang,… More

Wang, Y., Harrington, O. D., Wang, Y., Murray, C. K., Hamblin, M. R., Dai, T. In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (122), e54997, doi:10.3791/54997 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter