Abstract
烧伤感染仍是发病率和死亡率的重要原因。多药耐药（MDR）细菌的日益兴起，导致了传统抗生素治疗的频繁故障。替代治疗迫切需要解决MDR细菌。
一个创新的非抗生素的办法，抗菌蓝光（ABL），已经显示出对MDR感染的有前途的有效性。 ABL的作用机制尚不清楚。它通常假设在细菌中天然存在的内源性光敏发色团（ 例如 ，无铁卟啉，黄素， 等 ）由ABL，这反过来又产生细胞毒性活性氧类（ROS）通过光化学方法激发。
不同于另一基于光的抗菌方法中，抗微生物光动力学疗法（APDT），ABL疗法不需要外源photosensitiz的参与呃。所有它需要生效是蓝色光的照射;因此，它是简单和廉价的。 ABL的受体是在细菌中内源性细胞的光敏剂，而不是DNA。因此，ABL被认为是少得多基因毒性对宿主细胞不是紫外线C（UVC）照射，这直接导致在宿主细胞中的DNA损伤。
在本文中，我们提出了一个协议，以评估ABL治疗的烧伤损伤的小鼠模型MDR 鲍曼不动杆菌感染的效果。通过使用生物发光的工程菌株，我们能够无创监测感染的实时程度在活的动物。这种技术也用于监测动物感染的空间分布的有效工具。
Introduction
烧伤感染，这是因为皮肤的热损伤的频传，继续成为发病率和死亡率1的一个重要原因。烧伤感染的管理已经通过多药耐药性（MDR）的细菌菌株2的增加出现了进一步的损害，由于大量使用抗生素。一个重要的MDR革兰阴性菌是鲍曼不动杆菌 ，这是已知的与最近的战斗创伤相关联且几乎所有可用的抗生素耐药3。生物膜的损伤灶的存在已经报告了4，5，被认为是加剧耐受抗生素和宿主防御6，7，引起持续感染的8，9。因此，有一种压力机，加工摹需要替代治疗的发展。在最近公布的国家战略打击抗生素耐药细菌 ，替代疗法，抗生素的发展已注意到由美国10政府的作用。
光为基础的抗菌剂的方法，由名称所指示的，需要与或不与其它药剂的光照射。这些方法包括抗微生物光动力学疗法（APDT），紫外线C（UVC）照射，和抗微生物蓝光（ABL）。在以前的研究中，他们已经杀死MDR菌株11，12，13显示出可喜的成效。在这三种光为基础的方法，ABL已吸引近几年越来越多的关注，由于无需使用光敏剂14的其固有的抗菌性能。在COMPARISON到APDT，ABL仅涉及使用光的，而需要APDT光和光敏剂的组合。因此，ABL是简单且廉价的14。相比于UVC，ABL被认为是细胞毒性和遗传毒性对宿主细胞15要少得多。
此协议的目的是研究ABL对小鼠模型引起MDR 鲍曼不动杆菌烧伤感染的治疗功效。我们用生物发光致病细菌培养烧伤感染，允许的实时细菌负荷的无创监测的新的小鼠模型。相比，体液/组织提取和随后的镀敷和菌落计数16传统的方法，这种技术提供了精确的结果。组织取样的过程中可能引入的实验误差的另一个来源。由于细菌的发光强度成线性比例的受文者积水细菌CFU 17，我们可以直接测量光照射一定剂量后的细菌的存活。通过监测在活的动物中实时接收光处理中的细菌负荷，的细菌杀死动力学可使用小鼠的显著减少数量来表征。
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Protocol
1.细菌培养的制备
- 添加7.5毫升脑心浸液（BHI）培养基中至50mL离心管中。种子鲍曼不动杆菌细胞在BHI培养基，然后孵育鲍曼不动杆菌培养在轨道培养箱（37℃）18小时。
- 离心细胞的培养物在3,500×g下5分钟，除去上清液，并在磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤小球。
- 重悬在新鲜的PBS中的细菌颗粒和彻底吸管的悬浮液。
- 收集100μL的细菌悬浮液，并使用新鲜的PBS作1:10稀释。
- 转移稀释到1.5mL半微量比色杯，并测量在600nm（OD 600 nm）的波长的光密度（OD）。
- 根据稀释的测量OD 600nm的值与稀释倍数（10）计算原始（未稀释的）悬浮液的OD 600纳米在PBS中。
- 调整日在PBSë原始悬浮液至OD 600纳米 = 0.6（对应于10 8 CFU / mL的细胞密度）。
通过生物发光甲导致了烧伤感染的2小鼠模型。 鲍曼不动杆菌
- 年龄7-8周，体重17〜19克使用成年雌性BALB / c小鼠。允许小鼠实验开始前适应环境实验室条件至少3天。保持在12小时光照/黑暗周期的小鼠的21℃室温下，给他们的食物和水随意 。
- 麻醉小鼠用氯胺酮 - 赛拉嗪混合物的腹膜内注射（100mg / kg的 - 20毫克/千克）。轻轻触摸每只小鼠用棉签的睑;不存在所述眼睑反射的暗示适当的麻醉深度。盖鼠标眼睛兽医药膏，以防止干燥眼睛在麻醉过程中。
- 剃须背面的小鼠用5揭露尽可能多的皮肤尽可能0刀理发器。
- 放置在35毫米培养皿中的小鼠的腹部下方的盖，以保持他们的背部在相对水平的位置。
- 使用10" ×10" ，220 VAC热板在250毫升烧杯（80％满）烧开水。直到达到与水热平衡浸入黄铜块（1 1cm×1cm的横截面）放入烧杯中。热平衡通常需要<5分钟，并通过在烧杯中的水的再沸腾指示。
- 在此之前创建烧伤，辖先发制人镇痛药（为0.1mg / kg的丁丙诺啡的皮下注射），用于缓解疼痛。
- 先发制人镇痛药10分钟后，轻轻按下加热黄铜块对小鼠为7秒背面的剃毛区以诱导烧伤创面。
注：为避免热损伤到工作人员，在执行烧录程序时戴上热防护手套。 - 管理通过subcutaneou 0.5毫升的无菌盐水的注射液，以防止脱水。
- 五分钟后的热损伤的诱导，接种含有5×10 6 CFU的PBS细菌悬浮液的50微升到使用移液管的小鼠烫伤。通过在皮肤上的锯齿形运动移动无菌棉签涂抹在灼伤等分在过火面积尽可能均匀地分布在细菌细胞。
- 细菌接种后，立即进行生物发光成像的感染的烧伤，如第4说明。
- 放置小鼠上的水加热外科床（37℃，回收区），直到小鼠已经完全从麻醉中恢复。房子与在生物安全等级-2动物室的每笼5只的最大数量的小鼠。
- 施用镇痛药（0.1mg / kg的丁丙诺啡的皮下注射），每天两次对烧伤后的前三天。
3.抗菌蓝色光疗法对于A＆＃160; 杆菌感染小鼠
- 在细菌接种后24个小时开始ABL治疗。
- 使用的发光二极管（LED），其具有用于照射ABL 415nm处的峰值发射。安装在一个散热片上的LED，以防止对小鼠18所照射的区域的热效应。固定LED与夹子连接器的光学支承杆，以允许LED以向上和向下移动。
- 打开电源/能量计和按波长按钮选择415纳米。重置电源/能量计减去背景（环境光）。
- 将电源/电能表右侧的LED下。穿蓝色光护目镜。开启LED光并调整LED孔（即来自LED会聚的光的透镜）和功率/能量计的光传感器（2厘米直径）之间的距离，使得光斑覆盖的整个区域光传感器。
- 仔细调节LED驱动器和记录鲍威的阅读R /电能表。根据读取计算的辐照度：辐照度=读数（W）/面积（cm 2）。通过调整LED驱动器调节LED 100毫瓦/厘米2的辐照度。
- 关闭LED。测量LED孔和功率/能量计的光传感器之间的距离。
- 麻醉小鼠用氯胺酮 - 赛拉嗪混合物的腹膜内注射（100mg / kg的 - 20毫克/千克）。不存在所述眼睑反射的暗示适当的麻醉深度。
- 随机划分小鼠成ABL治疗组（n = 10）和未处理的对照组（n = 10）。
- 对于ABL处理组，覆盖小鼠的眼睛用铝箔以避免过度暴露于光。将鼠标烧伤直属LED，用鼠标腹部下方的35毫米陪替氏培养皿的盖子，以保持他们的背部在水平位置。
- 在一个正方形皮氏二取代，在步骤3.5，用鼠标提到的功率/能量计SH。调整鼠标回的位置处，如步骤所讨论的LED孔和鼠标烧伤的表面之间的距离是等于LED孔和电源/能量计的光传感器（水平之间的高度3.5）。
- 以100mW / cm 2的辐照度照射感染的烧伤。递送ABL在剂量72焦耳/厘米2，直到360达到焦耳/ cm 2的总剂量（ 例如 ，0，72，144，216，288和360焦耳/厘米2）。各光剂量后，执行生物发光成像的小鼠，如第4所讨论的。
- 对于未处理的对照组，执行鼠标烧伤生物发光成像，如第4所讨论的，使用如用于ABL处理组相同的时间间隔。
- 小鼠的恢复之前，放置在水加热手术床上的小鼠以防止热量散失和低温。观察活动和老鼠，直到复苏的眼睑反射。后日小鼠电子回收，安置他们2-3个笼子。
- ABL治疗后，执行生物发光成像，如第4对第3天所讨论的，每日然后隔天以监测感染的小鼠的时间生物负担。
4.感染的生物发光成像小鼠
- 图像使用低光成像系统，其包括增强型电荷耦合器件照相机，摄像机控制器，一个样品室，以及图像处理器19中的小鼠。
- 麻醉小鼠用氯胺酮 - 赛拉嗪混合物的腹膜内注射（100mg / kg的 - 20毫克/千克）。轻触用棉签小鼠的眼睑;不存在所述眼睑反射的暗示适当的麻醉深度。
- 启动实时成像软件。在显示的控制面板，单击初始化。等到温度框的颜色变为绿色，表明阶段的温度在试样腔室已经达到了37℃。
- 放置在成像系统的样本腔室中的阶段（37℃）的小鼠中，与直接在相机下的感染的烧伤。
注：当烧伤变得干燥细菌的生物发光可以降低。因此，建议在成像之前润泽用PBS小鼠烧伤。 - 在控制面板中，把一个对号旁边的“发光”。选择“自动曝光”，使成像的曝光时间将通过基于生物发光强度的活体成像软件进行优化。
- 从“查看现场的”下拉列表中选择“C”。选择“扫描中间范围”选项，让软件判断焦距。将一个复选标记旁边为叠加。
- 点击“获取”来捕捉图像。在“编辑图像标签”框中，单击“确定”; “图像窗口”和“收费调色板”将出现。
- 设置自动选择自动ROI参数。
- 量化生物发光强度为相对发光单位（的RLU）和伪彩色尺度从粉红（最强烈）到蓝色（至少激烈）19，20显示生物发光。
- 计算在不同的基于生物发光强度分析的时间点在小鼠烧伤细菌的存活分数。在给定时间点的细菌的存活分数=在该时间点测量到的生物发光强度/生物发光强度ABL曝光17前右测量。
5.小鼠安乐死
- 是该实验的终点为如下：（a）如由生物发光损失作为通过成像确定的感染的分辨率; （B）系统的感染的发生通过生物发光的传播烧成以外如所指示一个;在比较的≥15％体重（c）中损失到正常年龄匹配的小鼠中，或从疼痛和痛苦由缺乏响应于手动刺激，不动，一个不能吃或喝所指示的痛苦。在研究过程中，如果我们遇到这样的情况，我们不确定鼠标是否已经完全达到了奄奄一息的状态，根据我们的定义所概述，和/或我们是不确定的，如果我们需要安乐死它的情况，我们会联系CCM兽医人员行动计划; （d）中，否则将小鼠研究开始后30天被安乐死。
- 重新定位到小鼠关闭笼子专门为安乐死和通过递送二氧化碳安乐死的小鼠（CO 2）的压缩气体进入笼中。
- 打开CO 2罐或稳压阀以启动气体的流动。验证读取调节器根据刊登的单元的指令正确的PSI（磅每平方英寸），并调整重新根据需要gulator到正确的PSI，通常不高于5磅。
- 慢慢填写。流速应置换每分钟腔室/笼体积的不超过30％（对于典型的鼠笼，〜2L /分钟;对于鼠笼，〜7.5升/分钟）。
- 等待约3-5分钟为动物停止移动或呼吸;眼睛应该是固定和扩张。关闭CO 2罐或调节阀，停止CO 2的流动。
- 确保心脏没有摸着拇指和食指之间的胸口跳动。确保有通过触摸眼球没有眨眼反射。
- 如果有一个心跳或眨眼反射，重复安乐死过程或使用剪刀来打开胸腔以创建气胸（动物必须是非响应于脚趾捏之前执行此过程）。
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Representative Results
我们使用的是鲍曼不动杆菌菌株是MDR临床分离株，如先前12,17报道。该菌株是由luxCDABE歌剧11的转染由生物发光。 图1A示出了从代表性小鼠连续细菌发光图像烧伤感染5×10 6 鲍曼不动杆菌 ，并在细菌接种后24个小时暴露于单个ABL曝光。有代表性的小鼠皮肤的组织切片的革兰氏染色标本烧（在24小时后收获的接种）证明鲍曼不动杆菌生物膜的感染性烧伤（ 图1B）的表面上的存在。 如图1A所示，发光细菌几乎360焦耳/ cm 2的曝光ABL被递送（在照射60分钟后根除为100mW / cm 2）的辐照度。 图1C是从感染有5×10 6 鲍曼不动杆菌 ，并在24个小时细菌接种后（N = 10）用ABL处理的小鼠烧伤的平均细菌发光的剂量-反应曲线。为了实现3-登录小鼠烧伤10灭活鲍曼不动杆菌 ，约360焦耳/ cm 2的ABL是必需的。鼠标的细菌发光燃烧未曝光到ABL保持期间的时间的等效周期几乎保持不变（数据未显示; P <0.001）。
图1：在受感染小鼠烧伤细菌的灭活ABL。 （A）从代表性小鼠逐次细菌发光图像烧伤感染鲍曼不动杆菌的5×10 6 CFU，并在24暴露于360焦耳/ cm 2的ABL细菌接种后小时。 （B）革兰氏染色的代表性小鼠皮肤烧伤表示在小鼠烧伤鲍曼不动杆菌生物膜（箭头）的存在下的组织切片。皮肤样品在细菌接种后24个小时收获细胞。 （C）小鼠的平均细菌发光的剂量-反应曲线烧伤感染5×10 6 鲍曼不动杆菌 ，并用在细菌接种后24个小时（N = 10）360焦耳/ cm 2的ABL的曝光。酒吧：标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
ABL是用于治疗感染的新方法。由于其作用机制不同于化疗的完全不同，它更是一个理疗。介导抗微生物效果的药剂是蓝色光照射（400-470纳米）。随着蓝光LED的发展，我们获得了进入的MDR感染的有效和简单的基于光抗菌方法。
在这个协议中，我们描述了造成MDR， 鲍曼不动杆菌的生物发光应变烧伤感染的小鼠模型的发展。与使用生物发光的细菌，感染的程度可以是非侵入性地实时监控在通过生物发光成像活体动物。利用细菌的生物发光工程化菌株和低光成像技术的创建用于抗菌治疗期间监控实时的感染的有效技术。这种方法也可以在感染的调查中使用由其他微生物物种以及位于其他网站。除了抗菌方法的疗效评估，这种方法也可以用来跟踪感染的进展。
通过使用该小鼠模型中，我们表明，ABL（415 nm）的成功灭活中建立感染（ 图1A和C）的细菌。之前ABL疗法，在已建立的感染（ 图1B），这是生物膜的特征，观察到细菌的簇。生物膜是更宽容的传统抗生素和宿主防御相比，他们的浮游6,7和经常与持续性感染8，9关联。代表结果在415纳米ABL看好的是生物膜渗透。此外，再加上以前的报告29，30，31，32，我们的结果表明，不管细菌的耐药性轮廓的ABL的有效性仍然存在。
这里描述的协议涉及三个主要步骤：（1）烧伤感染的小鼠模型的发展，（2）ABL疗法，和（3）生物发光成像。在开发烧伤感染的小鼠模型中，我们注意到，有迹象表明影响感染的程度和ABL的后续有效性几个因素：（1）燃烧时间会影响伤口的深度和细菌的增殖。当燃烧时间从3到7秒增加，细菌发光强得多（指示感染的较高程度）在24小时后接种和感染的消除需要高得多的ABL曝光（> 360焦耳/ cm 2的）。 （2）细菌的接种物是对于开发的关键参数˚F感染。较高的细菌接种物通常会导致更高的感染程度，而具有足够低的接种物经常未能开发小鼠稳定感染。在后一种情况下，细菌发光通常会成为细菌接种后不久就检测不到。 （3）细菌和宿主之间的相互作用依赖于细菌种类。我们还用铜绿假单胞菌建立一个感染模型。我们发现，在同等条件下（ 即，燃烧时间和细菌接种），由铜绿假单胞菌引起的感染的进展速度远远超过鲍曼不动杆菌感染，以及败血症总是在小鼠体内48小时接种后25内观察到。
对于ABL治疗的执行，存在需要解决的几个重要的要点：（1）正确光辐照所需的ABL疗法的功效最大化。 （2）燃烧的所述的表面小鼠小号HOULD被作为水平放置越好。故障的烧伤表面适当地定位可影响ABL治疗的功效。 （3）在光曝光，故建议小鼠的眼睛用铝箔进行保护，特别是当使用激光作为光源。 （4）在曝光，应小心监测情况下，它们从麻醉中苏醒的小鼠。在这种情况下，麻醉药的一小笔额外剂量应给予以保持麻醉动物。 （5）两个ABL处理小鼠和未处理小鼠的应放置在加热床下麻醉时，以维持体温。在生物发光成像的过程中，当燃烧变得干燥细菌的生物发光可降低。因此，建议在成像之前润泽用PBS小鼠烧伤。
还有在这个协议所讨论的技术的一些限制：（1）对于EXTE的监测目的感染实时的NT，必须使用生物发光细菌菌株。因此，前一个临床菌株可在动物模型中进行测试，就必须进行遗传由勒克斯CDABE操纵子11的转染改性。 （2）ABL的有效性相关的波长33和细菌物种/株使用34。的蓝光波长，与其它参数一起，应进一步用于灭活不同细菌物种/株进行了优化。 （3）我们只研究了小鼠浅表感染。对于深层感染，ABL的局部递送可能无法到达感染，所以可能需要35间质性光递送。 （4）是成像系统的灵敏度限制，成像深部感染19时尤其如此。其结果是，即使当生物发光的像素被完全消除，有可能仍然是六能细菌细胞剩余，允许发生细菌再生。一个长时间暴露于ABL是消除细菌发光的建议后，为了防止细菌再生。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS | PerkinElmer Inc, Waltham, MA | IVIS Lumina Series III | Pre-clinical in vivo imaging |
| Light-emitting diode LED | VieLight Inc, Toronto, Canada | 415 nm | Light source for illumination |
| Power/energy meter | Thorlabs, Inc., Newton, NJ | PM100D | Light irradiance detector |
| Mouse | Charles River Laboratories, Wilmington, MA | BALB/c | 7-8 weeks age, 17-19 g weight |
| Acinetobacter baumannii | Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX | Clinical isolate | Engineered luminescent strain |
| Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 721016 | 0.9% Sodium Chloride |
| Phosphate Buffered Saline, 1x Solution | Fisher Scientific | BP24384 | A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures |
| Brain Heart Infusion | Fisher Scientific | B11059 | Bacterial culture medium |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | For bacterial suspension centrifuge |
| Benchtop Incubated Orbital Shakers | Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH | Incu-Shaker Mini | For culturing of bacteria |
| Inoculating Loops | Fisher Scientific | 22-363-605 | For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice |
| Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200 µL | Fisher Scientific | 02-707-502 | Pipet Tips |
| Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-220 | For bacterial suspension seperation |
| Brass Block | Small Parts, Inc., Miami, FL | 10 mm by 10 mm | For creation of burns in mice |
| Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves | Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY | PBI83514 | Heat Resistant Gloves |
| Greiner dishes | Sigma-Aldrich Co. LLC | P5112-740EA | 35 mm ×10 mm |
| Corning Digital Hot Plate | Cole-Parmer Instrument Company, LLC | UX-84301-65 | 10" x 10", 220 VAC, for boiling water |
| Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed | E-Z Systems | EZ-211 | Prevents heat loss and hypothermia during surgery |
| Vet ointment | S&K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, Augensalbe | opthalmic ointment to prevent eye dryness |
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