Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kärnmagnetisk resonansspektroskopi för identifiering av flera fosforyleringar av egen Oordnade proteiner

Published: December 27, 2016 doi: 10.3791/55001
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1UMR8576, CNRS, Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS, Lille University
* These authors contributed equally

Introduction

En av de största utmaningarna för hälso- och sjukvård i det 21: a århundradet är neurodegenerativa sjukdomar såsom Alzheimers sjukdom (AD). Tau är en mikrotubuli-associerat protein som stimulerar mikrotubulus (MT) bildning. Tau är lika involverad i flera neurodegenerativa sjukdomar, så kallade tauopatier, varav den mest kända är AD. I dessa sjukdomar, är Tau själv aggregat i parade spiralfilament (PHF) och fann modifierad på många rester av posttranslationella modifieringar (PTMs) såsom fosforylering 1. Fosforylering av tau-protein är inblandad i både reglering av dess fysiologiska funktion av MT stabilisering och patologisk förlust av funktion som kännetecknar AD neuroner.

Dessutom Tau protein, när den integreras i PHF i sjuka neuroner är alltid hyperfosforylerat 2. Till skillnad från normal Tau som innehåller 2-3 fosfatgrupper, det hyperfosforylerade Tau i PHF innehåller 5-9 Phosphate grupper 3. Hyperfosforylering av Tau motsvarar både en ökning med stökiometri på vissa platser och fosforylering av ytterligare platser som kallas patologiska ställen för fosforylering. Det finns dock överlappningen mellan AD och normala vuxna mönster fosforylering, trots kvantitativa skillnader i nivån 4. Hur specifik fosforylering händelser påverkar funktion och dysfunktion i Tau är i stort sett okända. Vi strävar efter att dechiffrera Tau reglering av PTMs på molekylär nivå.

Att fördjupa förståelsen för de molekylära aspekterna av Tau, måste vi ta itu tekniska utmaningar. För det första är Tau en egen oordnad protein (IDP) när isolerades i lösning. Sådana proteiner saknar väldefinierade tredimensionella strukturen under fysiologiska förhållanden och kräver särskilda biofysikaliska metoder för att studera deras funktion (er) och strukturella egenskaper. Tau är ett paradigm för den växande klassen av internflyktingar, som ofta förekommer i samband medpatologier såsom neurodegenerativa sjukdomar, därmed öka intresset för att förstå de molekylära parametrar som ligger bakom deras funktioner. För det andra är karakteriseringen av Tau fosforylering ett analytiskt utmaning, med 80 potentiella fosforyleringsställen längs sekvensen för den längsta 441 aminosyra Tau-isoformen. Ett antal antikroppar har utvecklats mot fosforylerade epitoper av Tau och används för detektion av patologiska Tau i nervceller eller hjärnvävnad. Fosforylering händelser kan ske på åtminstone 20 platser som omfattas av prolin-riktade kinaser, de flesta av dem i närheten inom Proline-rik region. Den kvalitativa (vilka webbplatser?) Och kvantitativa (vilken stökiometri?) Karakterisering är svårt även av de senaste MS-tekniker 5.

NMR-spektroskopi kan användas för att undersöka oordnade proteiner som är mycket dynamiska system består av ensembler av konformerer. Högupplöst NMR-spektroskopi var tillämped att undersöka både struktur och funktion av Tau-proteinet. Dessutom komplexiteten i Tau s fosforylering profil ledde till utvecklingen av molekylära verktyg och nya analysmetoder som använder NMR för identifiering av fosforyleringsställen 6 - 8. NMR som en analysmetod möjliggör identifiering av Tau fosforyleringsställen i ett globalt sätt, visualisering av alla single-site ändringar i ett enda experiment, och kvantifiering av graden av fosfat inkorporering. Denna punkt är viktig eftersom även fosforylering studier på Tau överflöd i litteraturen, de flesta av dem har utförts med antikroppar, vilket ger en hög grad av osäkerhet över hela profilen för fosforylering och därmed den verkliga effekterna av enskilda fosforylering händelser. Rekombinanta kinaser inklusive PKA, Glykogen-syntas kinas 3β (GSK3P), cyklin-beroende kinas 2 / cyklin A (CDK2 / CycA), cyklin-beroende kinas 5 (CDK5) / p25 agerarivator protein, extracellulär-signal-reglerat kinas 2 (ERK2) och mikrotubulus-affinitet reglerande kinas (MARK), vilka visar fosforylering aktivitet mot Tau, kan framställas i en aktiv form. Dessutom är Tau-mutanter som möjliggör för generering av specifika Tau proteinisoformer med välkarakteriserade fosforyleringsställen mönster som används för att dechiffrera fosforyleringen koden Tau. NMR-spektroskopi används sedan för att karakterisera enzymatiskt modifierade Tau prover 6 - 8. Även in vitro fosforylering av Tau är mer utmanande än pseudo-fosforylering såsom genom mutation av utvalda Ser / Thr i glutaminsyra (Glu) rester, har denna metod sina förtjänster. I själva verket kan varken strukturella effekter eller interaktion parametrar fosforylering alltid imiteras av glutaminsyra. Ett exempel är tur motiv observeras runt fosfoserin 202 (pSer202) / fosfotreonin 205 (pThr205), som inte återges med Glu mutationer 9.

in vitro fosforylering av rekombinant ERK2-kinas presenteras. ERK2 aktiveras genom fosforylering av mitogen aktiverat proteinkinas / ERK-kinas (MEK) 10-12. Förutom framställningen av modifierade, isotopinmärkt Tau-protein, är NMR strategi som används för identifiering av PTMs beskrivits.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produktion av 15 N, 13 C-Tau (figur 1)

  1. Omvandla pET15b-Tau rekombinant T7 expressionsplasmid 13,14 i BL21 (DE3) kompetent Escherichia coli bakterieceller 15.
    OBS: det cDNA som kodar för den längsta (441 aminosyrarester) Tau isoformen klonas mellan Ncol- och Xhol-restriktionsställen i pET15b-plasmiden.
    1. Blanda försiktigt 50 pl av kompetenta BL21 (DE3) -celler, som bildar 1-5 x 10 7 kolonier per | j, g av plasmid-DNA, med 100 ng av plasmid-DNA i en 1,5 ml plaströr.
      NOT: Kodon-användnings optimerad bakteriestammar för eukaryot cDNA-expressions inte är nödvändig för att producera humant tau.
    2. Placera cellblandningen på is under 30 min och sedan värmechock för 10 sek vid 42 ° C. Placera röret tillbaka på is i 5 minuter och tillsätt 1 ml rumstemperatur LB (Luria-Bertani) medium. Inkubera den bakteriella suspensionen vid 37 ° C under 30 min under försiktigagitation.
  2. Sprids med användning av en ympning slinga 100 pl cellsuspension jämnt på en agarplatta LB-medium innehållande 100 | ig / ml ampicillin antibiotikum.
  3. Inkubera val av plattan i 15 h vid 37 ° C.
  4. Håll val plattan vid 4 ° C tills vidare till kultur steg, under maximalt 2 veckor ungefär.
    OBS: en glycerolstock bakteriekultur (50% glycerol), lagrad vid -80 ° C, kan framställas för att starta kulturen i ett senare skede.
  5. Tillsätt 1 ml 1 M MgSO 4, 1 ml 100 mM CaCl2, 10 ml 100x MEM vitaminkomplement, en ml 100 mg / ml ampicillin till ett L av autoklaverad M9-salter (6 g Na 2 HPO 4, 3 g KH 2 PO 4 , 0,5 g NaCl).
    OBS: En vit fällning bildas vid tillsats av CaCl2-lösning till de M9-salter som snabbt avleder.
  6. Lösa 300 mg 15 N, 13 C-komplett medium, en g 15NH4CI och 2 g av 13 C 6-glukos i 10 ml av M9-medium. Filtrera-sterilisera isotopen lösningen med en 0,2 ^ m filter, direkt in i M9-medium.
  7. Suspendera med användning av en ympning slinga en koloni av pET15b-Tau transformerade bakterier från markeringen plattan i 20 ml LB-medium kompletterat med 100 | j, g / ml ampicillin.
  8. Inkubera det inokulerade mediet vid 37 ° C under ca 6 h.
  9. Mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD 600) om en ml av en tiofaldig utspädning av bakteriekultur i en plast spektrometer kyvett.
    OBS: Grumlighet av den bakteriella kulturen som motsvarar till OD 600 av 3,0 till 4,0 indikerar att mättnads tillväxtfas uppnås.
  10. Tillsätt 20 ml av den mättade LB-odling till en liter M9 tillväxtmedium kompletterat med ampicillin (100 | ig / ml slutlig koncentration), i 2 L Erlenmeyer plast bafflad odlingskolv.
  11. Placera odlingskolven i en programmerbar inkubator inställd på 10 °C och 50 rpm. Programmera inkubatorn för att växla till 200 rpm och 37 ° C tidigt på morgonen för nästa dag.
  12. Mät OD 600 på 1 ml bakteriekultur i en plast spektrometer kyvett. Tillsätt 400 pl av 1 M IPTG (isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid) stamlösning (förvaras vid -20 ° C) då OD 600 når ett värde av omkring 1,0 för att inducera uttryck av rekombinant protein-Tau.
  13. Fortsätta inkubationen vid 37 ° C under ytterligare 3 h. Samla in bakteriecellerna genom centrifugering vid 5000 x g under 20 min.
  14. Frysa den bakteriella pellet vid -20 ° C. Hålla frysta tills reningssteget, under en längre period om så behövs.

2. Rening av 15 N, 13 C-Tau (Figur 2)

  1. Autoklav katjonbytarmembran (CEX) Rening buffertar vid 121 ° C under 15 psi under 20 min. Förvara buffertar vid 4 ° C.
  2. Tina bakteriecellpellet och återsuspendera grundligt i 45 mlav extraktion CEX En buffert (50 mM NaPi buffert pH 6,5, 1 mM EDTA) nyligen kompletterat med proteashämmare cocktail 1x (1 tablett) och DNAsel (2000 enheter).
  3. Störa de bakteriella celler med användning av en högtryckshomogenisator vid 20.000 psi. 3-4 pass är nödvändigt. Centrifugera vid 20.000 xg under 40 minuter för att avlägsna olösligt material.
  4. Värma bakteriecellextraktet i 15 minuter vid 75 ° C med användning av ett vattenbad.
    OBS: en vit fällning observeras efter några minuter.
  5. Centrifugera vid 15.000 xg under 20 min och hålla supernatanten innehållande det värmestabila Tau-protein.
  6. Förvara vid -20 ° C tills följande reningssteg, om det behövs.
  7. Utföra en katjonbyteskromatografi på en stark CEX-harts packad som en 5 ml bäddkolonn med användning av en snabb protein-vätskekromatografi (FPLC) -system (figur 3 A).
    1. Ställ flödeshastigheten till 2,5 ml / min.
    2. Jämvikt kolumnen i CEX En buffert
    3. Ladda 60-70 ml heated-extrakt innehållande Tau med hjälp av en provpump eller alternativt pump A, beroende på systemet. Samla genomflödet för analys för att verifiera att Tau-protein är ett effektivt sätt att binda till hartset (se 2,8).
    4. Tvätta hartset med CEX En buffert tills absorbansen vid 280 nm är tillbaka till utgångsvärdet.
    5. Eluera Tau från kolonnen med användning av en tre-stegs NaCl-gradient erhålls genom en gradvis ökning av CEX B-buffert (CEX En buffert med 1 M NaCl). Programmera FPLC enligt följande: första steg av gradienten till 25% CEX B-buffert i 10 kolonnvolymer (CV) för att nå 250 mM NaCl, andra steg till 50% CEX B-buffert i 5 CV för att nå 500 mM NaCl, och tredje steg till 100% CEX B-buffert i 2 CV för att nå en M NaCl. Samla 1,5 ml fraktioner under elueringssteg.
  8. Analysera 10 pl av fraktionerna som samlats in under elueringssteget genom SDS-PAGE (12% SDS-akrylamidgel) och Coomassie-färgning (figur 3 A) 16. Kontrollera laddningssteget på kolonnen samt genom analyzing 10 fil av genomflödet.
  9. Välj de fraktioner som innehåller Tau och förena dessa fraktioner för nästa steg.
  10. Utför en buffertbyte på Tau-innehållande sammanslagna fraktioner (Figur 3 B).
    1. Jämvikta en avsaltningskolonn av 53 ml G25-harts packad bädd (26 x 10 cm) i 50 mM ammoniumbikarbonat (flyktig buffert) med användning av ett FPLC-system.
    2. Inställda flödet till 5 ml / min. Injicera Tau provet på kolonnen via en 5 ml injektionsslinga. Samla fraktioner motsvarande absorptionstoppen vid 280 nm.
    3. Upprepa injektionen 3-4 gånger, beroende på volymen av den initiala CEX poolen.
  11. Beräkna mängden renat Tau-protein genom användning av topparea för kromatogrammet vid 280 nm (1 mg Tau motsvarar 140 mAU * ml).
    OBS: extinktionskoefficienten för Tau-protein vid 280 nm är 7550 M -1 cm -1. Tau innehåller inga Trp rester.
  12. Pool alla Tau fraktioner.
  13. Aliquot provet i rör innehållande motsvarande 1 till 5 mg av Tau. Välja dessa rör så att volymen av lösningen är liten jämfört med volymen av röret (till exempel 5 ml lösning i en 50 ml rör).
  14. Stansa hål i rörslock med hjälp av en nål. Frysa Tau prover vid -80 ° C.
  15. Lyofilisera Tau prover. Lyofiliserad Tau-protein kan hållas vid -20 ° C under långa tidsperioder.

3. In vitro-Fosforylering av 15 N-Tau

  1. Lös upp 5 mg lyofiliserat Tau i 500 | il fosforylering-buffert (50 mM Hepes · KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl).
  2. Lägg 2,5 mM ATP (25 | il av 100 mM stamlösning förvaras vid -20 ° C), (1 | il av 1 M förrådslösning som hölls vid -20 ° C) 1 mM DTT, 1 mM EGTA (2 ^ il av en 0,5 M förråds lösning), 1x proteasinhibitorcocktail (25 pl av en 40x stock framställd genom upplösning av en tablett i en ml fosforylering buffert) och en81; M aktiverad His-ERK2 (250 | il i konserveringsbuffert 10 mM Hepes, pH 7,3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl och 10% glycerol, lagrades vid -80 ° C) i en total provvolym på 1 ml.
    OBS: Den aktiverade His-ERK2 kan framställas in-house 5,8 genom fosforylering med MEK-kinas.
  3. Inkubera 3 h vid 37 ° C.
  4. Provet uppvärms vid 75 ° C under 15 min för att inaktivera ERK-kinas.
  5. Centrifugera vid 20000 x g under 15 min. Samla och hålla supernatanten.
  6. Avsalta proteinprovet in i 50 mM ammoniumbikarbonat med användning av en kolonn av 3,45 ml G25-harts packad bädd (1,3 x 2,6 cm), som är lämplig för en en ml prov.
  7. Köra en 12% SDS-PAGE 16 med 2,5 | il av proteinprovet att kontrollera både sin integritet och effektiv fosforylering (figur 4).
  8. Lyofilisera den fosforylerade Tau provet. Förvara pulver vid -20 ° C.

4. Förvärv av NMR-spektra (Figur 5)

  1. Solubilisera 4 mg lyofiliserat 15 N, 13 C ERK-fosforylerad-Tau i 400 | j, l NMR-buffert (50 mM NaPi eller 50 mM deutererade Tris- d11 .Cl, pH 6,5, 30 mM NaCl, 2,5 mM EDTA och 1 mM DTT).
  2. Tillsätt 5% D2O för fält låsning av NMR-spektrometer och 1 mM TMSP (3- (trimetylsilyl) propionsyra-2,2,3,3-d4-natriumsalt)) som intern NMR-signal referens. Tillsätt 10 | il av en 40x förrådslösning av fullständig proteasinhibitorcocktail.
  3. Överföra provet i ett 5 mm NMR-rör med användning av en elektronisk injektionsspruta med en lång nål eller pasteurpipett. Stänga NMR-röret med hjälp av kolven. Ta bort eventuella luftbubbla instängd mellan kolven och vätska genom kolven rörelser.
  4. Placera NMR-röret i en spinnare. Justera dess vertikala position i spinnaren med den lämpliga visaren för NMR-sond huvud som används, så att det mesta av provlösningen kommer att vara inne i NMR-spolen.
  5. Starta luftflödet: Klicka hiss in systemet fönster magnet kontroll. Placera försiktigt spinnaren med röret i luftflödet på toppen av magnetöppningen. Stoppa luftflödet (klicka hiss) och låt röret ner på plats inne i sondhuvudet i magneten.
  6. Inställd temperatur till 25 ° C (298 K).
  7. Utför halvautomatisk inställning och matchning av sonden huvudet för att optimera kraftöverföringen. Skriv atmm på kommandoraden.
  8. Lås spektrometern frekvensen med D 2 O signal av provet registreras på deuterium kanalen. Klicka på låset i systemfönstret magnet kontroll.
  9. Starta mellanlägg förfarande för att optimera homogeniteten hos det magnetiska fältet vid läget för provet. Skriv topshim gui på kommandoraden för att öppna shim fönstret. Klicka på Start i shim fönstret. Kontrollera återstående B0 standard variation värde för att verifiera att shims är optimala (mindre än 2 Hz är bra).
  10. Kalibrera p1 parametern (längd av en protonradiofrekvenspuls i ^ sek), vilket är nödvändigt för att erhålla en 90 ° rotation av proton snurrar. Sikta på 360 ° puls med hjälp av en 1D spektrum av vattenprotoner (Figur 6).
  11. Justera frekvensförskjutningen genom att ställa in o1 parametern (i Hz) till protonvatten frekvens i 1D-spektrum (fig 6).
  12. Starta förvärv av en 1D protonspektrum (pulssekvens med watergate sekvens för vatten signalundertryckning, till exempel zggpw5) att kontrollera signaler från provet (Figur 7). Anpassa antalet avsökningar för den relativa proteinkoncentrationen. Skriv ZG på kommandoraden för att starta förvärvet.
  13. Inrätta ytterligare parametrar för förvärv av en 2D [1 H, 15 N] HSQC-spektrum (pulssekvens hsqcetfpf3gpsi figurerna 8-9).
    1. För en 15 N, 13 C-märkt prov, frikoppla 13 C under 15 N indirekt evolution.
      2. en H (F2) och 15 N (F1) dimensioner.
      OBS: Anpassa antalet förvärvsdatapunkter till spektrometern fältet för att hålla ett liknande antal Hz per punkt och begränsa frikoppling gånger: använd 3,072 poäng på 900 MHz och 2048 pekar på 600 MHz, i en H-dimension.
    2. Optimera ytterligare parametrar i pulssekvenser, motsvarande förseningar, pulslängder, offset frekvenser, effektnivåer. Typ visar därmed kommandoraden för att visa alla parametrar som är relevanta för experimentet.
  14. Ställ parametrar för förvärv av en 3D [1 H, 15 N, 13 C] HNCACB spektrum (pulssekvens hncacbgpwg3d, figur 10A) vid 600 MHz.
  15. Ställ parametrar för en 3D [1 H, 15 N, 15 N] HNCANNH experiment (pulssekvens hncannhgpwg3d) vid 600 MHz. Ställ in antalet punkter till 2048 i ett H och 64och 128 poäng i de två 15 N dimensioner. Definiera spektrala bredder som 14, 25, 25 delar per miljon (ppm) centrerad på 4,7, 119, 119 ppm i en H, 15 N och 15 N dimensioner. Varaktighet förvärv med 16 scanningar är en dag och 22 timmar.

5. Identifiering av fosforyleringsställen

  1. Process spektra med hjälp av förvärv och bearbetning NMR programvara.
    1. Utför en Fourier transformation av data (Figur 7). Typ ft för en 1D spektrum, XFB för en 2D-spektrum eller ft3d för en 3D-spektrum, på kommandoraden.
    2. Fas och referens alla spektra (figur 7C) med interaktiva fönster.
  2. Identifiera resonanser av intresse i 2D HSQC potentiellt motsvarande fosforylerade Ser och Thr-rester (Figur 9, röda rutan).
  3. Utdrag plan (dvs. 2D 1 H- 13 C-spektra) från3D 1 H- 15 N 13 C spektrum med hjälp av de 15 N kemiska förskjutningar av resonanser av intresse i 2D. Använd markören med dimensionen 2 (W2) för att välja 15 N frekvens som motsvarar planet (w1-w3) som ska visualiseras (Figur 10B).
  4. Plocka resonansfrekvensema för "CA" och "CB" 13 C kärnor av "i" och "i-1" rester (svagare uppsättning signaler jämfört med dem för den i resten) för varje [1 H, 15 N] resonans av intresse i HNCACB 3D spektrum genom att klicka på resonans i pekarläge meny hitta / lägga topp, för att lägga till det kemiska skiftvärdet i en topp fillistan.
    1. Identifiera typen i återstoden pSER eller PTHR, genom att jämföra de kemiska förändringar i topp lista med kända värden för CA och CB kemiska förskjutningar av pSER och PTHR 17.
    2. Identifiera närvaron av en Pro-rest vid i + 1 position med en karakteristisk ytterligare 2 ppm skift of CA kemiska skiftvärdet 18.
    3. Jämför kemiska skiftvärden för CA och CB resonanser som motsvarar i-1 rest till en tabell över kemiska skift kan indikera Tau aminosyraresterna 19 att identifiera vilken typ av återstoden vid i-ett läge.
  5. Plocka resonansfrekvenser av 15 N kärnor av "i" och "I-1" rester för varje [1 H, 15 N] resonans av intresse i HNCANNH spektrumet.
  6. Jämför de 15 N kemiska skiftvärden till den kemiska skifttilldelning av Tau-protein 20-23.
  7. Jämför de identifierade dipeptider med Tau-sekvensen för att definiera sekvensspecifika uppdrag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 3A visar en större absorptionstopp vid 280 nm observerades under elueringen gradient. Denna topp motsvarar renat Tau-protein som kan ses på akrylamidgelen ovanför kromatogrammet. Figur 3B visar en väl separerad absorptionstopp vid 280 nm och toppen av ledningsförmåga, vilket säkerställer att avsaltning av proteinet är effektiv. Figur 4 visar proteingel-shift observeras genom SDS-PAGE-analys 16 karakteristisk för multipel proteinfosforylering (jämför spår 2 och 3). Figur 6 visar en serie av proton (1H) 1D-spektra med ökande pulslängder (i ps). För att ställa in längden på den puls som kommer att rotera en H spin magnetisering av 90 °, en puls som motsvarar en 360 ° rotation används i praktiken, eftersom det är lättare att kalibrera genom att minimera signalen. Signalen från vattenprotoner är null när 360 ° pulslängd är tillräckligt definierade. Det värde som motsvarar en 36076; rotation divideras sedan med 4. p1 i detta experiment är 10,5 ^ is. Förstorad region: Frekvensen av restsignalen används för att definiera den o1p parameter (frekvensoffset 1 H). Figur 7 A. visar en induktions sönderfall (FID), visualiseras för att säkerställa att en NMR-signal upptäcks. Figur 7B. visar en 1D 1 H spektrum med en felaktig fas, som ses av resonanser som förekommer som asymmetriska toppar. Figur 7C visar en 1D 1 H spektrum med bra signal-brus-förhållande, vilket indikerar att de grundläggande insamlingsparametrar var korrekt inställd och en signal från proteinprovet kan detekteras. Figur 8 visar 2D 1 H, 15 N HSQC spektra av rekombinant 15 N-Tau på 900 MHz; Figur 8A med god känslighet och upplösning och figur 8B. med detektion av proteolys i provet, vilket framgår av förekomsten av ytterligare peaks i spektrumet (blue box). Figur 9 visar 2D 1 H, 15 N HSQC spektra av rekombinant 15 N-Tau figur 9A på 600 MHz, med god känslighet men mindre upplösning jämfört med figur 8A. Figur 9B vid 600 MHz, visar uppkomsten av ytterligare toppar i spektrumet motsvarande fosforylerade rester (röd ruta). Figur 9C vid 900 MHz, visar toppar i spektrumet motsvarande fosforylerade rester (röd ruta). Upplösningen är bättre än i figur 9B. Figur 10 A visar prognoser från 3D NMR-spektrum som används för att utvärdera ett lyckat experiment. Figur 10B visar en 1 H- 13C plan extraheras från en H- 15 N 13 C 3D spektrum med god signalstyrka gör det möjligt att upptäcka 13 C-signaler från både I och I-1 rester.


Figur 1: Schema av de viktigaste stegen av rekombinant proteinproduktion och isotopmärkning. Steg från bakterier omvandling till rekombinant proteinproduktion beskrivs enligt punkt 1 i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Schema av de viktigaste stegen i rekombinant Tau proteinrening. Steg från bakterieceller lys rekombinant proteinrening beskrivs enligt punkt 2 i protokollet. Klicka här för att se en större version avdenna siffra.

Figur 3
Figur 3: vätskekromatografi stegen protokoll. (A) Katjonbyteskromatografi fraktionering av den uppvärmda bakterieextrakt. Absorbansen vid 280 nm, 260 nm och konduktiviteten motsvarar respektive fasta och streckade svarta linjer och prickade röda linjen. 12% SDS-PAGE-analys av de uppsamlade fraktionerna visas ovanför kromatogrammet. (B) Avsaltning av Tau-protein i en buffert lämplig för lyofilisering. Mängden renat Tau-protein beräknas från topparean (2260 mAU * ml) är 16 mg Tau. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4 Figur 4: 12% SDS-PAGE-analys av Tau. Spår 1, molekylviktsmarkör; spår 2, 10 ^ g av Tau; spår 3, 10 | j, g av ERK-fosforylerat tau. Tau, som andra internt fördrivna, körs i en anomal sätt på SDS-PAGE, vid en skenbar molekylvikt av ca 60 kDa i stället för den förväntade 46 kDa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Schema av de viktigaste stegen för NMR provval, NMR-spektroskopi datainsamling och databehandling. Steg från NMR provberedning till datainsamling och bearbetning beskrivs enligt punkt 4 i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6: Set-up av p1 parametern för NMR datainsamling. Denna parameter skiljer sig mellan prover och är i huvudsak beroende av saltkoncentrationen. En standard 1H nickkurvan för 80% H2O i D2O visas. Single-scan-spektra med ett recirkulerat fördröjning på 30 sek uppsamlades och plottades horisontellt. Puls (P1) varierades från en ps till 55 ps i steg om en ps. I teorin bör signalen vara maximal för en 90 ° -puls och lika med noll under en 180 ° puls. Men i praktiken orsakar strålning dämpning asymmetri och fasdistorsion problem som gör det svårt att avgöra 90 ° eller 180 ° pulser direkt. Den andra nollpunkten motsvarar en 360 ° pulslängd. Den utvidgade området visar en restsignal för en 360 ° puls som används för att definiera parametern o1p frekvensen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 7
Figur 7: NMR databehandling. (A) Fri induktionssignal avklingning i tidsdomänen. 1D protonspektra (B) till följd av Fourier transformation av FID från panel A i frekvensdomänen, men med felaktig fas (PHC0 -206 °). (C) fasas (PHC0 -113 °) och refererade (TMSP signal vid 0 ppm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

"/>
Figur 8: 2D en H, 15 N HSQC spektra av rekombinant 15 N-Tau på 900 MHz. 3,072 och 416 förvärvsdatapunkter registrerades med hjälp av spektrala bredder 14 och 25 ppm i en H (F2) och 15 N (F1) dimensioner, respektive. 16 scanningar registrerades per F1 ökning, vilket leder till en varaktighet av experimentet av 4 tim 30 min. (A) god kvalitet Tau prov (B) Tau prov visar nedbrytning vilket framgår av förekomsten av ytterligare resonanser i en viss region av spektrumet (hög fält 1H, låg fält 15 N), här inramad i blått. Denna sista prov framställdes utan proteasinhibitorer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 9
Figur 9: 2D en H, 15 N HSQC spektra av rekombinant 15 N-Tau. (A) ofosforylerade Tau, 600 MHz spektrum (B) fosforylerat tau, 600 MHz spektrum och (C) fosforylerat tau, 900 MHz spektrum. Ytterligare resonanser i en viss region av spektrumet, här förpackade i rött, observeras i fosforylerat tau-spektra. Dessa resonanser, som motsvarar proton amid (1 H 15 N) korrelationer av pSER och PTHR rester lätt visualiseras i området kring 8,5-9,5 ppm för ett H och 117 till 125 ppm för 15 N, utanför huvuddelen av 1 H, 15 N korrelationer av ofosforylerade Tau spektrumet. (A och B) motsvarar spektra förvärvades 600 MHz, 2048 och 256 datapunkter på spektrala bredder 14 och 25 ppm noterades i en H (F2) och 15 N (F1) dimensioner, respektive.32 skanningar användes, och totala varaktigheten av förvärvet var 2 tim 44 min och (C) vid 900 MHz, 3,072 och 416 datapunkter på spektrala bredder 14 och 25 ppm noterades i en H (F2) och 15 N ( F1) dimensioner, respektive. 48 skanningar användes, och totala varaktigheten av förvärvet var 6 tim 37 min. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 10
Figur 10: 3D en H, 15 N, 13 C NMR-spektrum, prognoser och extraherade 2D-plan. 2048, 72, och 256 datapunkter registrerades i en H (F3), 15 N (F2), och 13 C (F1) dimensioner, respektive. Spektrala bredder är 14, 25 och 61 ppm, centrerad på 4,7, 119 och 41 ppm i en H,15 N och 13 C dimensioner, respektive. Varaktighet av förvärvet med hjälp av 16 skanningar är 4 dagar och 6 timmar. (A) Cube representation motsvarande Fourier transformerade 3D-dataset av en HNCACB spektrum av ERK-fosforylerat tau erhålls vid 600 MHz. 2D 1 H, 15 N och en H, är 13 C plan som erhållits genom projektionen av 3D-data längs 13 C och 15 N dimension, respektive. databehandling och representation gjordes med hjälp av NMR förvärv och bearbetning programvara. (B) 2D 1H, 13C plan utvinns ur 3D 1 H, 15 N, 13 C NMR dataset på en 15 N kemiskt skift av 121,8 ppm. En zoom (till höger) centrerad på en H kemiskt skift av 9,38 ppm visar 13 CA och 13 CB resonanser både rester i (pThr153) och i-1 (Ala152). Den 13 CB resonans alias på grund av bredden hos de spectral fönstret. Grafisk representation och topp plockning utfördes med hjälp av NMR-analys programvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har använt NMR-spektroskopi för att karaktärisera enzymatiskt modifierade Tau prover. Den rekombinanta expression och rening beskrivs här för fullängds humant tau-protein kan på liknande sätt användas för att producera mutanta Tau eller Tau-domäner. Isotop behövs berikad protein för NMR-spektroskopi, vilket kräver rekombinant uttryck. Identifiering av fosforyleringsställen kräver resonans uppdrag och en 15 N, 13 C dubbelt märkt protein. Med tanke på kostnaden av isotoper är gott utbyte krävs i den rekombinanta expression steg. Glukos är den begränsande faktorn för bakterietillväxt i M9-medium kan därför ökas mängden 13 C 6-glukos till 4 g per liter odlingsmedium för att förbättra avkastningen. Tillsats av kompletta medium och MEM-vitaminer är inte obligatoriskt, men bidra till att stimulera tillväxten och förbättra utbytet. Med tanke på den höga kostnaden för hela märkta mediet, är denna produkt endast används som ett odlingsmedium supplement. Bakteriell tillväxt är långsam i M9-medium. Generellt bakteriekulturer som använder M9 medium kompletterat med 3% komplett medium räckvidd induktion efter ca 4 timmar inkubation. En OD 600 av 1,6 till 1,8 erhålls vanligtvis vid slutet av odlingen. Förväntad avkastning av rekombinant Tau protein är ca 15 mg per liter bakteriekultur. Användningen av en programmerbar inkubator gör det möjligt att enkelt schemalägga proteinproduktion, samling av den bakteriella pelleten och analytisk kontroll av proteinproduktion under arbetstid dag timmar.

Provkoncentration är viktigt att erhålla en god kvalitet spektrum. Ett typiskt Tau prov räcker för en 2D-spektrum skulle innehålla 1 mg i 200 ^ (dvs 100 ^ M) Tau-protein. För en 3D-spektrum, är åtminstone 200 pM i 300 ^ krävs, under förutsättning att en kryogen sondhuvudet används. Tillgång till en hög-fält-spektrometer, såsom 900 MHz instrument som används i denna studie kommer att ge bättre signal-till-brusoch minska begränsningarna på provkoncentration (figur 8). Med tanke på att Tau är en stor oordnad protein, är dess NMR-spektra som kännetecknas av betydande signal överlappning, och en hög fält NMR-spektrometer kommer också att vara det bästa valet när det gäller upplösning (figur 8). Icke desto mindre resonanserna motsvarande fosforyleringsställen är i ett distinkt område av spektrumet och är lätta att upptäcka även med en 600 MHz-spektrometer (Jämför figurerna 9 B och 9C). Dessutom, på grund av dess oordnade natur, är känslig för proteolys (fig 8B) Tau protein.

Sterilisering av buffertar rekommenderas att begränsa Tau nedbrytning. Tillsats av proteashämmare till NMR provet skyddar Tau mot nedbrytning under datainsamlingsperioder som kan pågå från timmar till dagar, beroende på pulssekvens. Lågt pH (dvs. pH under 7,0) krävs för att AV-oid för snabbt utbyte mellan protein protoner och vattenprotoner, vilket leder till signalbreddning. Prov pH måste också kontrolleras väl för att säkerställa reproducerbarhet av spektra. I själva verket, eftersom pKa-värden av pSER och PTHR är nära det optimala pH för NMR-spektroskopi, kemiska förskjutningar av fosforylerade rester är mycket känsliga för pH-variationer. Justering av pH av NMR-provet kan göras direkt med hjälp av en pH-mätare med en pH-mikroelektrod, anpassad till små volymer. Tau är ett lösligt protein och sammanställer inte i standardbetingelser. Tillsats av polyanjoner, såsom heparinsulfat, och inkubering vid 37 ° C kan initiera aggregation i Tau prover. I detta fall, med tanke på den fasta naturen hos aggregaten, de flesta av de resonanser i den motsvarande NMR-spektrum bredda bortom detektion. Även de fosforylerade Tau prover inte samlade under de förhållanden som beskrivs här för NMR datainsamling.

Jämfört med analysantikroppen, erbjuder NMR en oVERGRIPANDE vy av PTMs. Masspektrometri kan också användas för att identifiera fosforyleringen mönster av ett proteinprov. Isotopmärkning är inte nödvändigt för denna teknik, och nödvändiga provkvantiteter är mycket mindre. Men karakterisering av ett protein med flera fosforyleringar, såsom Tau, förblir utmanande. Intilliggande fosforyleringar kommer att producera isobariska peptider i bottom-up-strategier för identifiering. Fullständig identifiering behöver då MS / MS-sekvensering av peptiderna som erhållits genom prov proteolys. En fördel med NMR består i det inneboende kvantitativa art av tekniken. Intensiteten för en NMR-signal kan kopplas till den mängd av den kemiska gruppen är närvarande vid ett specifikt ställe. Vi kan alltså definiera andelen kemisk modifiering på varje plats. Senaste framsteg i MS program har dock visat att MS-analys av Tau flera fosforylering är genomförbart 24, även på ett kvantitativt sätt efter lämplig normalisering 25.

Här presenterade vi Tau fosforylering av aktivt ERK2, men metoden kan användas för fosforylering med andra kinaser samt 6,7,26 - 28. Kinetiska experiment kan utföras, vilket kan bidra till att definiera kinas specificitet mot ett proteinsubstrat 28-31. Fosforyleringsställen studier är inte begränsade till rekombinanta kinaser, och kinasaktiviteten hos cell- eller vävnadsextrakt kan analyseras 6,32,28. En intressant utveckling är användningen av i-cell NMR för att studera in situ ändringar 33,34. Omvänt, NMR är också anpassad för att ta itu med fosfatas specificitet, som visades genom att studera defosforylering av fosforylerade Tau av PP2A fosfatas 35. NMR-spektroskopi kan tillämpas på karaktäriseringen av kinasinhibitorer genom att jämföra fosforylering profilen för proteinsubstrat i en 2D-spektrum i närvaro av inhibitom förening with spektrumet utfärdas från ett kontrollexperiment 6.

Intresset för att använda NMR-spektroskopi, jämfört med de mer känsliga masspektrometriteknikerna, bosatt i det breda spektrum av tillämpningar som utnyttjar det protokoll som beskrivs här, snarare än på sin analytiska förmåga ensam. Det har visat sig avgörande för att identifiera fosforyleringsställen för att kunna länka specifika fosforyleringar med strukturella eller funktionella förändringar som främst studerades med hjälp av NMR. NMR-spektroskopi av fosforylerat tau prov innebär att utforska den strukturella effekterna av fosforylering på både övergående lokala sekundära strukturer och global ombildning av den dynamiska ensemble av modifierad Tau 36,37. Funktionella aspekter inkluderar reglering av både interaktion mellan Tau med proteinpartners 7,38,39 och aggregering av Tau fosforylering 8. Den fosforylerade Tau Provet karakteriserades genom NMR kan vidare användas för att dechiffrera Fosfor-beroende interaktioner, förexempel med 14-3-3 proteiner 40 och konstruerad interaktion protein-protein hämmare 41,42. NMR tillåter definition av interaktion webbplats (s) på resthalten, och beroende av denna interaktion på fosforylering. Dessutom är NMR-spektroskopi av fosforylerat Tau en viktig metod för att karakterisera prolin cis: trans isomeras Pin1, en viktig fosfor-beroende enzym som är involverat i Tau förordning 43-45. Dessutom kan fosforylering analys genom NMR tillämpas inte bara till internt fördrivna utan även för globulära proteiner 46. Slutligen kan andra typer av Tau PTMs såsom acetyleringar 22,40,41 studeras genom NMR. De protokoll som beskrivs här har visat sig vara avgörande för att bättre förstå den funktionella och strukturella reglering av Tau i fysiologiska och patologiska tillstånd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET15B recombinant T7 expression plasmid Novagen 69257 Keep at -20 °C
BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria New England Biolabs C2527I Keep at -80 °C
Autoclaved LB Broth, Lennox  DIFCO 240210 Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100x Sigma 58970C Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder Sigma 608297 Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl Sigma 299251 Isotope
13C6-Glucose Sigma 389374 Isotope
Protease inhibitor tablets  Roche 5056489001 Keep at 4 °C
1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C
DNaseI EUROMEDEX 1307 Keep at -20 °C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) AVESTIN Lysis is realized at 4 °C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker Pierce 266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged Sigma M8822 Keep at -80 °C
AKTÄ Pure chromatography system GE Healthcare FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column) GE Healthcare 17-5156-01 Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting GE Healthcare 17-5087-01 Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25 GE Healthcare 28-9180-08 Protein Desalting column
Tris D11, 97% D Cortecnet CD4035P5 Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe)  Euriso-top BMS-005B NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit Cortecnet 2910000 Pipetting
Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1 Bruker Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114 UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) NMR data Analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
  2. Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer's disease brain. J. Biol. Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
  3. Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268 (32), 24374-24384 (1993).
  4. Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging. 16 (3), 409-417 (1995).
  5. Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482 (2011).
  6. Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128 (11), 3575-3583 (2006).
  7. Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23 (4), 1146-1152 (2009).
  8. Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291 (14), 7742-7753 (2016).
  9. Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133 (40), 15842-15845 (2011).
  10. Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249 (4964), 64-67 (1990).
  11. Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343 (6259), 651-653 (1990).
  12. Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (14), 6142-6146 (1991).
  13. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  14. Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56 (1), 125-135 (1987).
  15. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  17. Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15 (3), 203-206 (1999).
  18. Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5 (1), 67-81 (1995).
  19. Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132 (51), 18000-18003 (2010).
  20. Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5 (1), 73-78 (2004).
  21. Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5 (12), 1639-1646 (2004).
  22. Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7 (2), e34 (2009).
  23. Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7 (4), e34679 (2012).
  24. Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18 (8), 1183-1189 (2015).
  25. Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88 (7), 3704-3714 (2016).
  26. Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285 (43), 33435-33444 (2010).
  27. Theillet, F. -X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
  28. Qi, H., Cantrelle, F. -X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  29. Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
  30. Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137 (20), 6468-6471 (2015).
  31. Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
  32. Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
  33. Bodart, J. -F., Wieruszeski, J. -M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192 (2), 252-257 (2008).
  34. Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
  35. Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer's disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521 (2011).
  36. Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80 (2), 454-462 (2012).
  37. Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23 (8), 1448-1458 (2015).
  38. Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412 (4), 743-746 (2011).
  39. Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1's SH3 domain and Tau's proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3 (1), (2015).
  40. Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29 (10), 4133-4144 (2015).
  41. Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48 (15), 4815-4823 (2005).
  42. Milroy, L. -G., Bartel, M., et al. Stabilizer-Guided Inhibition of Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54 (52), 15720-15724 (2015).
  43. Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochemistry. 43 (7), 2032-2040 (2004).
  44. Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7 (3), 179-194 (2006).
  45. Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274 (20), 5211-5222 (2007).
  46. Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
  47. Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16 (8), 414-423 (2010).
  48. Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochemistry. 53 (18), 3020-3032 (2014).

Tags

Biokemi kärnmagnetisk resonansspektroskopi isotopisk märkning i sig oordnad protein rekombinant protein proteinrening proteinfosforylering NMR datainsamling resonans uppdrag.
Kärnmagnetisk resonansspektroskopi för identifiering av flera fosforyleringar av egen Oordnade proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Danis, C., Despres, C., Bessa, L.… More

Danis, C., Despres, C., Bessa, L. M., Malki, I., Merzougui, H., Huvent, I., Qi, H., Lippens, G., Cantrelle, F. X., Schneider, R., Hanoulle, X., Smet-Nocca, C., Landrieu, I. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (118), e55001, doi:10.3791/55001 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter