Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance spektroskopi for identifisering av flere Phosphorylations med egen Uordnede Proteiner

Published: December 27, 2016 doi: 10.3791/55001
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1UMR8576, CNRS, Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS, Lille University
* These authors contributed equally

Introduction

En av de viktigste utfordringene i helsevesenet i det 21. århundre er nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom (AD). Tau er en microtubule assosiert protein som stimulerer microtubule (MT) formasjon. Tau er like involvert i flere nevrodegenerative lidelser, såkalte tauopatier, hvorav den mest kjente er AD. I disse lidelsene, er Tau selv aggregater i sammenkoblede spiraltråder (PHFs) og funnet endret mange rester av posttranslational modifikasjoner (PTMs) som fosforylering en. Fosforylering av tau-protein er implisert i reguleringen av både dets fysiologiske funksjon av MT stabilisering og patologisk tap av funksjon som karakteriserer AD nerveceller.

Videre Tau protein, når de er integrert i PHFs i syke nevroner, er alltid hyperfosforylert to. I motsetning til vanlige Tau som inneholder 2-3 fosfatgrupper, den hyperfosforylisert Tau i PHFs inneholder 5-9 phosphate gruppe 3. Hyperfosforylering av Tau tilsvarer både en økning på støkiometri på noen områder og til fosforylering av flere nettsteder som er kalt patologiske områder av fosforylering. Imidlertid eksisterer overlapping mellom AD og normale voksne mønstre av fosforylering, til tross for kvantitative forskjeller i nivå 4. Hvordan spesifikk fosforylering hendelser innflytelse funksjon og dysfunksjon av Tau fortsatt i stor grad ukjent. Vi tar sikte på å dechiffrere Tau regulering av PTMs på molekylært nivå.

For å utdype forståelsen av de molekylære aspekter av Tau, må vi løse tekniske utfordringer. For det første er Tau en egen uordnede protein (IDP) når isolert i løsningen. Slike proteiner mangler veldefinert tredimensjonal struktur under fysiologiske betingelser, og krever spesielle biofysiske metoder for å studere deres funksjon (er) og strukturelle egenskaper. Tau er et paradigme for den voksende klassen av internt fordrevne, ofte funnet i forbindelse medpatologi som nevrodegenerative sykdommer, dermed øker interessen for å forstå de molekylære parametre bak sine funksjoner. For det andre, er karakteriseringen av Tau fosforylering en analytisk utfordring med 80 potensielle fosforyleringsseter langs sekvensen av den lengste 441 aminosyre-Tau isoform. En rekke antistoffer har blitt utviklet mot fosforylerte epitoper av Tau og anvendes for påvisning av patologiske Tau i neuronene eller hjernevev. Fosforylering hendelser kan finne sted på i det minste 20 områder målrettet av prolin-dirigert kinaser, de fleste av dem i umiddelbar nærhet innenfor prolin-rik region. Den kvalitative (hvilke områder?) Og kvantitativ (hva støkiometri?) Karakterisering er vanskelig selv etter de siste MS teknikker 5.

NMR-spektroskopi kan anvendes for å undersøke uordnede proteiner som er sterkt dynamiske systemer som utgjøres av ensembler av konformerer. Høy oppløsning NMR-spektroskopi var apparaed å undersøke både struktur og funksjon av Tau protein. I tillegg kompleksiteten av Tau fosforylering profil førte til utviklingen av molekylære verktøy og nye analysemetoder ved hjelp av NMR for identifisering av fosforyleringsseter 6 - 8. NMR som en analytisk metode gjør det mulig for identifisering av Tau fosforyleringsseter i et globalt måte, visualisering av alle enkeltsted endringer i et enkelt eksperiment, og kvantifisering av graden av fosfat inkorporering. Dette punktet er viktig siden selv om fosforylering studier på Tau florerer i litteraturen, de fleste av dem har blitt utført med antistoffer, og etterlater en stor grad av usikkerhet over hele profilen til fosforylering og dermed den sanne betydningen av individuelle fosforylering hendelser. Rekombinante kinaser inkludert PKA, glykogen-syntase-kinase 3β (GSK3P), syklin-avhengig kinase 2 / cyklin A (CDK2 / CycA), syklin-avhengig kinase 5 (cdk5) / p25 activator protein, ekstracellulære signalregulert kinase 2 (ERK2) og microtubule-affinitet regulerende kinase (MARK), som viser fosforyleringsaktivitet mot Tau, kan tilberedes på en aktiv form. I tillegg er Tau mutanter som gjør det mulig for generering av spesifikke tau-protein isoformene med godt karakterisert fosforylering mønstre anvendes for å dechiffrere koden fosforylering av Tau. NMR-spektroskopi blir så brukt for å karakterisere enzymatisk modifiserte Tau prøvene 6 - 8. Selv om in vitro-fosforylering av Tau er mer utfordrende enn pseudo-fosforylering slik som ved mutasjon av den valgte Ser / Thr inn i glutaminsyre (Glu) rester Denne tilnærming har sine fordeler. Faktisk kan verken strukturelle støt eller interaksjons parametere av fosforylering alltid bli etterlignet av glutaminsyre. Et eksempel er turn motiv observert rundt fosfoserin- 202 (pSer202) / fosfotreoninmimetikumet 205 (pThr205), som ikke er gjengitt med Glu mutasjoner 9.

in vitro-fosforylering ved hjelp av rekombinant ERK2 kinase er presentert. ERK2 er aktivert ved fosforylering av mitogen aktivert proteinkinase / ERK-kinase (MEK) 10 - 12. I tillegg til fremstilling av modifiserte, isotopisk-merkede Tau-protein, er NMR-strategi som brukes for å identifisere den PTMs rives.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av N 15, 13 C-Tau (figur 1)

  1. Transform pET15b-Tau rekombinant T7 ekspresjonsplasmidet 13,14 i BL21 (DE3) kompetent Escherichia coli bakterieceller 15.
    MERK: cDNA som koder for den lengste (441 aminosyreresidier) Tau isoform er klonet mellom Ncol og Xhol restriksjonssetene i pET15b plasmid.
    1. Bland forsiktig 50 pl av kompetente BL21 (DE3) celler, som danner 1-5 x 10 7 kolonier pr ug av plasmid-DNA, med 100 ng plasmid-DNA i et 1,5 ml plastrør.
      MERK: optimalisert kodon-bruk bakteriestammer for eukaryote cDNA uttrykk er ikke avgjørende for å produsere menneskelig Tau.
    2. Plasser celleblandingen på is i 30 min og deretter varmesjokk i 10 sekunder ved 42 ° C. Plasser røret tilbake på is i 5 minutter og tilsett 1 ml romtemperatur LB (Luria-Bertani) medium. Inkuber bakteriesuspensjonen ved 37 ° C i 30 minutter under forsiktigomrøring.
  2. Spredt ved hjelp av en inokulasjon sløyfe 100 mL av cellesuspensjonen jevnt på en agar plate av LB medium inneholdende 100 ug / ml ampicillin antibiotikum.
  3. Inkuber seleksjonsplate i 15 timer ved 37 ° C.
  4. Hold utvalg plate ved 4 ° C før du fortsetter til kultur trinn, for maksimalt 2 uker omtrent.
    MERK: et lager av glyserol bakteriekultur (50% glycerol), lagret ved -80 ° C, kan fremstilles til å begynne kulturen på et senere tidspunkt.
  5. Tilsett 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 100 mM CaCl2, 10 ml 100 x MEM vitamin komplement, 1 ml 100 mg / ml ampicillin til 1 liter autoklaverte M9-salter (6 g Na2 HPO 4, 3 g KH 2PO 4 , 0,5 g NaCl).
    MERK: En hvit utfelling vil dannes ved tilsetning av CaCl 2 oppløsning til M9 salter som raskt forsvinner.
  6. Oppløse 300 mg 15 N, 13 C-komplett medium, 1 g 15NH4CI og 2 g av 13 C 6 -glukose i 10 ml M9-medium. Filter-sterilisere isotopen løsning ved hjelp av en 0,2 mikrometer filter, direkte inn i M9 medium.
  7. Suspendere ved hjelp av en løkke inokulering en koloni av pET15b-Tau transformerte bakterier fra utvalget platen i 20 ml LB-medium supplementert med 100 ug / ml ampicillin.
  8. Inkuber det inokulerte medium ved 37 ° C i ca. 6 timer.
  9. Måle optisk tetthet ved 600 nm (OD 600) på 1 ml av en ti-gangers fortynning av bakteriekultur i et plast spektrometer kyvette.
    MERK: Turbiditet av bakteriekultur som svarer til OD600 på 3,0-4,0 indikerer at metningsvekstfasen er nådd.
  10. Tilsett 20 ml av mettet LB kulturen til 1 liter M9 vekstmedium supplementert med ampicillin (100 pg / ml sluttkonsentrasjon), i 2 l Erlenmeyer plast forvirret kulturflaske.
  11. Sett kulturflaske i en programmerbar inkubator innstilt på 10 °C og 50 rpm. Programmere kuvøse for å bytte til 200 rpm og 37 ° C tidlig på morgenen neste dag.
  12. Mål OD 600 på 1 ml av bakteriekultur i en plast spektrometer kyvette. Tilsett 400 ul av 1 M IPTG (isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid) stamløsning (holdt ved -20 ° C) ved OD 600 når en verdi på omtrent 1,0 for å indusere ekspresjon av rekombinant protein Tau.
  13. Fortsett inkubering ved 37 ° C i ytterligere 3 timer. Samle bakteriecellene ved sentrifugering ved 5000 x g i 20 min.
  14. Fryse den bakterielle pellet ved -20 ° C. Oppbevar frosset helt til rensetrinnet, i en lengre periode hvis nødvendig.

2. Rensing av 15 N, 13 C-Tau (Figur 2)

  1. Autoclave kation-utveksling (CEX) Rensing av buffere ved 121 ° C under 15 psi i 20 min. Oppbevar buffere ved 4 ° C.
  2. Tine bakteriecellen pellet og resuspender grundig i 45 mlfor utvinning CEX En buffer (50 mM NaPi buffer pH 6,5, 1 mM EDTA) nylig supplert med proteasehemmer cocktail 1x (1 tablett) og DNaseI (2000 enheter).
  3. Forstyrre bakteriecellene ved hjelp av en høytrykks homogenisator ved 20 000 kPa. 3-4 passerer er nødvendig. Sentrifuger ved 20000 xg i 40 minutter for å fjerne uoppløselig materiale.
  4. Varm opp bakteriecelleekstrakt i 15 min ved 75 ° C ved hjelp av et vannbad.
    MERK: et hvitt bunnfall ble observert etter noen få minutter.
  5. Sentrifuger ved 15.000 xg i 20 min og hold supernatanten inneholdende den varmestabile Tau-protein.
  6. Oppbevar ved -20 ° C inntil de følgende rensetrinn, om nødvendig.
  7. Utføre en kation-bytte kromatografi på en sterk CEX harpiks pakket som en seng kolonne 5 ml ved hjelp av en hurtig protein-væskekromatografi (FPLC) system (figur 3 A).
    1. Satt strømningshastigheten til 2,5 ml / min.
    2. Balanser konsollen i CEX En buffer
    3. Legg den 60-70 ml oppvarmet-ekstrakt inneholdende Tau ved hjelp av en prøvepumpe, eller alternativt pumpe A, avhengig av systemet. Samle gjennomstrømnings for analyse for å bekrefte at Tau-protein er effektivt binding til resinet (se 2.8).
    4. Vask harpiks med CEX En buffer inntil absorbans ved 280 nm er tilbake til baseline verdi.
    5. Elute Tau fra kolonnen ved å anvende en tre-trinns NaCl-gradient som oppnås ved gradvis økning av CEX B buffer (A buffer CEX med 1 M NaCl). Program FPLC som følger: første trinn av gradient til 25% CEX B-buffer i 10 kolonnevolumer (CV) for å nå 250 mM NaCl, andre trinn til 50% CEX B-buffer i 5 CV for å nå 500 mM NaCl, og tredje trinnet til 100% B CEX-buffer i 2 CV for å nå 1 M NaCl. Samle 1,5 ml fraksjoner under eluering trinn.
  8. Analyser 10 ul av fraksjonene som samles inn under elueringstrinnet ved SDS-PAGE (12% SDS-akrylamid gel) og Coomassie-farging (figur 3 A) 16. Kontroller laste skritt på søylen så vel ved analyzing 10 ul av gjennomstrømnings.
  9. Velge fraksjonene inneholdende Tau og pool disse fraksjonene for det neste trinn.
  10. Utfør en buffer utveksling på Tau inneholder sammenslåtte fraksjoner (figur 3 B).
    1. Ekvilibrere en avsalting kolonne av 53 ml G25-harpiks pakket sjikt (26 x 10 cm) i 50 mM ammoniumbikarbonat (flyktig buffer) ved hjelp av et FPLC-system.
    2. Sett strømningshastigheten til 5 ml / min. Injiser Tau prøven på kolonnen via en 5 ml injeksjonssløyfe. Oppsamle fraksjoner som svarer til den absorpsjonstopp ved 280 nm.
    3. Gjenta injeksjonen 3-4 ganger, avhengig av volumet av den opprinnelige CEX bassenget.
  11. Beregne mengden av renset Tau-protein ved hjelp av topparealet på kromatogrammet ved 280 nm (1 mg Tau tilsvarer 140 mAU * ml).
    MERK: ekstinksjonskoeffisient på Tau protein ved 280 nm er 7550 M -1 cm -1. Tau inneholder ingen Trp-restene.
  12. Pool alle Tau fraksjoner.
  13. Aliquot prøven i rør som inneholdt den tilsvarende 1 til 5 mg av Tau. Velge disse rørene slik at volumet av løsningen er lite i forhold til volumet av røret (for eksempel 5 ml oppløsning i et 50 ml rør).
  14. Lage hull i røret caps ved hjelp av en nål. Tau fryse prøvene ved -80 ° C.
  15. Lyofiliser Tau prøver. Lyofilisert Tau-protein kan oppbevares ved -20 ° C i lange perioder av gangen.

3. In Vitro Fosforylering av 15 N-Tau

  1. Oppløs 5 mg lyofilisert Tau i 500 ul fosforylering buffer (50 mM Hepes · KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl).
  2. Legg 2,5 mM ATP (25 ul av 100 mM stamløsning holdt ved -20 ° C), 1 mM DTT (1 ul 1 M stamløsning holdt ved -20 ° C), 1 mM EGTA (2 pl av en 0,5 M stam løsning), 1x protease inhibitor cocktail (25 ul av en 40x lager erholdt ved å oppløse en tablett i 1 ml buffer fosforylering) og ett81; M aktivert His-ERK2 (250 ul i bevaringsbuffer 10 mM Hepes, pH 7,3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl og 10% glycerol, lagret ved -80 ° C) i et totalt prøvevolum på 1 ml.
    MERK: Den aktiverte Hans-ERK2 kan tilberedes på huset 5,8 av fosforylering med MEK kinase.
  3. Inkuber 3 timer ved 37 ° C.
  4. Varm prøven ved 75 ° C i 15 min for å inaktivere ERK-kinase.
  5. Sentrifuger ved 20.000 xg i 15 min. Samle og holde supernatanten.
  6. Avsalte proteinprøven inn i 50 mM ammoniumbikarbonat ved anvendelse av en kolonne med 3,45 ml G25-harpiks pakket sjikt (1,3 x 2,6 cm), som er egnet for en 1 ml prøve.
  7. Kjøre en 12% SDS-PAGE 16 med 2,5 ul av proteinprøven for å kontrollere både sin integritet og effektiv fosforylering (figur 4).
  8. Lyofilisere den fosforylerte Tau prøven. Oppbevar pulver ved -20 ° C.

4. Kjøp av NMR Spectra (Fifigur 5)

  1. Oppløse 4 mg av lyofilisert 15 N, 13 C ERK-fosforylert Tau-i 400 ul NMR-buffer (50 mM NaPi eller 50 mM Tris-deutererte d11 .Cl, pH 6,5, 30 mM NaCl, 2,5 mM EDTA og 1 mM DTT).
  2. Tilsett 5% D2O for felt låsing av NMR-spektrometer og 1 mM TMSP (3- (trimetylsilyl) propionsyre-2,2,3,3-d 4-natriumsalt)) som intern referanse NMR-signal. Tilsett 10 pl av en 40x stamløsning av fullstendig protease inhibitor cocktail.
  3. Overfør prøven i et 5 mm NMR-rør ved hjelp av en elektronisk sprøyte med en lang nål eller Pasteur pipette. Lukk NMR røret ved hjelp av stempelet. Fjern eventuelle luftbobler fanget mellom stempelet og væske ved stempelbevegelser.
  4. Plasser NMR rør i en spinner. Justere dens vertikale posisjon i spinneren med riktig tykkelse for NMR-sondehodet anvendes, slik at det meste av prøveoppløsningen vil være inne i NMR-spolen.
  5. Start luftstrømmen: Klikk heis in systemet vindu magnet kontroll. Forsiktig spinneren med rør i luftstrømmen på toppen av magneten boringen. Stopp luftstrømmen (klikk heis) og la røret ned på plass inne sondehodet i magneten.
  6. Innstilt temperatur til 25 ° C (298 K).
  7. Utfør semi-automatisk tuning og tilpasning av sondehodet å optimalisere kraftoverføring. Skriv atmm på kommandolinjen.
  8. Lås spektrometer frekvensen ved hjelp av D-2-O-signalet til prøven registreres på deuterium kanal. Klikk lock i systemet vindu magnet kontroll.
  9. Start shimsingen fremgangsmåte for å optimalisere homogenitet av det magnetiske felt ved posisjonen til prøven. Skriv topshim gui på kommandolinjen for å åpne mellomlegg vinduet. Klikk starte i mellomlegg vinduet. Sjekk rest B0 standard variasjonsverdien for å verifisere at shims er optimale (mindre enn 2 Hz er bra).
  10. Kalibrer p1 parameter (lengden av et protonradiofrekvente puls i usek), som er nødvendig for å oppnå en 90 ° dreining av proton spinn. Målet for den 360 ° puls ved hjelp av en 1D spektrum av vannprotoner (figur 6).
  11. Juster frekvensforskyvningen ved å sette O1 parameter (i Hz) for å proton vann frekvensen i 1D-spektrum (figur 6).
  12. Starte anskaffelse av en 1D protonspektrum (pulssekvens med watergate sekvens for vann signal undertrykkelse, for eksempel zggpw5) for å kontrollere signaler fra prøven (figur 7). Tilpasse antall skanninger til den relative proteinkonsentrasjon. Skriv ZG på kommandolinjen for å starte kjøp.
  13. Sett opp flere parametere for kjøp av et 2D [1 H, 15 N] HSQC spektrum (pulssekvens hsqcetfpf3gpsi, figur 8-9).
    1. For en 15 N, 13 C merket prøven, decouple 13 C i løpet av 15 N indirekte evolusjon.
      2. en H (F2) og 15 N (F1) dimensjoner.
      MERK: tilpasse antall oppkjøp datapunkter til spektrometeret feltet for å holde et tilsvarende antall Hz per poeng og for å begrense decoupling ganger: bruke 3.072 poeng på 900 MHz og 2048 poeng på 600 MHz, i en H dimensjon.
    2. Optimaliser flere parametere i pulssekvenser, tilsvarende forsinkelser, pulslengder, offset frekvenser, effektnivåer. Type dessuten økt på kommandolinjen for å vise alle parametere som er relevante for forsøket.
  14. Angi parametere for erverv av en 3D [1 H, 15 N, 13 C] HNCACB spektrum (pulssekvens hncacbgpwg3d, figur 10A) på 600 MHz.
  15. Angi parametere for en 3D [1 H, 15 N, 15 N] HNCANNH eksperiment (pulssekvens hncannhgpwg3d) på 600 MHz. Angi antall punkter til 2048 i en H og 64og 128 punkter i de to 15 N dimensjoner. Definer de spektrale bredder som 14, 25, 25 deler per million (ppm) sentrert på 4,7, 119, 119 ppm i en H, 15 N og 15 N dimensjoner. Varighet av oppkjøpet med 16 skanninger er en dag og 22 timer.

5. Identifisering av fosforylering nettsteder

  1. Prosess spektra ved hjelp av oppkjøp og foredling NMR programvare.
    1. Utføre en Fourier-transformasjon av dataene (figur 7). Type ft for en 1D spekteret, XFB for en 2D spektrum eller ft3d for en 3D-spekteret, på kommandolinjen.
    2. Fase og referanse alle spektra (figur 7C) ved hjelp av den interaktive vinduene.
  2. Identifisere resonanser av interesse i 2D HSQC potensielt tilsvarer fosforylerte Tjen og Thr rester (figur 9, rød boks).
  3. Pakk fly (dvs. 2D 1 H- 13C spektra) fra3D-1 H- 15 N- 13C-spektret under anvendelse av de 15 N kjemiske skift av resonanser av interesse i 2D. Bruk markøren av dimensjon 2 (w2) for å velge den 15 N-frekvens som svarer til planet (w1-W3) for å bli visualisert (figur 10B).
  4. Plukk resonansfrekvensene av 'CA' og 'CB' 13 C kjerner av 'i' og 'i-1' rester (svakere sett signaler i forhold til de av i rest) for hver [1 H, 15 N] resonans av interesse i HNCACB 3D spekteret ved å klikke på resonans, i pekeren modusmenyen finne / legge til topp, for å legge den kjemiske skift verdi i en topp liste fil.
    1. Identifiser jeg rest type, pSER eller pThr, ved å sammenligne de kjemiske skift i topp liste til kjente verdier av CA og CB kjemiske skift av pSER og pThr 17.
    2. Identifisere tilstedeværelsen av en Pro-rest på i + 1 stilling ved hjelp av en karakteristisk ytterligere 2 ppm skift of CA kjemisk skift verdi 18.
    3. Sammenlign de kjemiske skiftverdier av CA og CB resonanser svarende til i-en rest til en tabell av kjemiske skift forutsagte for Tau aminosyrerester 19 for å identifisere arten av resten ved i-1 stilling.
  5. Plukk resonansfrekvensene på 15 N kjerner av 'i' og 'i-1' rester etter hvert [1 H, 15 N] resonans av interesse i HNCANNH spekteret.
  6. Sammenligne de 15 N kjemisk skiftverdier til kjemisk skift tildeling av Tau protein 20-23.
  7. Sammenlign identifisert dipeptider med Tau sekvens for å definere sekvensen enkelte oppdrag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 3A viser en større absorpsjonstopp ved 280 nm observert i løpet av elueringsgradient. Denne toppen tilsvarer rensede Tau-protein som sett på akrylamidgel ovenfor kromatogrammet. Figur 3B viser en godt adskilt absorpsjonstopp ved 280 nm og toppen av ledeevne, slik at avsalting av proteinet er effektiv. Figur 4 viser protein-gel-skift observert ved hjelp av SDS-PAGE-analyse 16 karakteristisk for multiple protein fosforylering (sammenlign spor 2 og 3). Figur 6 viser en serie av proton (1H) 1D-spektra med økende pulslengder (i usek). For å stille inn lengden av den puls som vil rotere 1 H sentrifugemagnetiseringen ved 90 °, en puls svarende til en 360 ° rotasjon blir brukt i praksis, ettersom det er lettere å kalibrere ved å minimere signal. Signalet til vannprotonene er null når den 360 ° pulslengde er tilstrekkelig definert. Den verdi som svarer til en 36076; rotasjon blir deretter dividert med 4. p1 i dette eksperimentet er 10,5 usek. Forstørret region: Frekvensen av restsignalet blir brukt til å definere o1p parameter (frekvensforskyvning for en H). Figur 7 a viser et induksjons decay (FID), visualisert for å sikre at et NMR-signal blir detektert. Figur 7B. viser en 1D 1 H spekteret med feil fase, som sett av resonanser vises som asymmetriske topper. Figur 7C viser en 1D 1H-spektrum med god signal-til-støy-forholdet, noe som indikerer at de grunnleggende innhentingsparametrene ble riktig innstilt og kan påvises et signal fra proteinprøven. Figur 8 viser 2D 1 H, 15 N HSQC spektra av rekombinant 15 N-Tau på 900 MHz; Figur 8A med god følsomhet og oppløsning og 8B. med påvisning av proteolyse i prøven, sett av utseendet på ekstra peaks i spekteret (blå boks). Figur 9 viser 2D 1 H, 15 N HSQC spektra av rekombinant 15 N-Tau Figur 9A 600 MHz, med god følsomhet, men mindre oppløsning i forhold til figur 8A. Figur 9B ved 600 MHz, viser utseendet av ytterligere topper i spektret som svarer til fosforylerte rester (rød boks). Figur 9C ved 900 MHz, viser topper i spekteret tilsvarer fosforylerte rester (rød boks). Oppløsning er bedre enn i figur 9B. Figur 10 A viser anslag fra 3D-NMR-spektrum som brukes til å evaluere et vellykket eksperiment. Figur 10B viser et 1H- 13 C planet ekstraheres fra en H- 15 N- 13C 3D-spektrum med god signalintensiteten som tillater å detektere 13 C-signaler fra både i og i-1-rester.


Figur 1: Skjema over hovedtrinnene av rekombinant proteinproduksjon og isotop-merking. Skritt fra bakterier transformasjon til rekombinant proteinproduksjon er skissert som beskrevet i punkt 1 i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Skjema av de viktigste trinnene i rekombinant Tau protein rensing. Skritt fra bakterieceller lyse til rekombinant protein rensing er skissert som beskrevet i punkt 2 i protokollen. Klikk her for å se en større versjon avdette tallet.

Figur 3
Figur 3: væskekromatografi ved trinnene med protokollen. (A) Kationbytterkromatografi fraksjonering av den oppvarmede bakterielt ekstrakt. Absorbansen ved 280 nm, 260 nm og ledningsevnen tilsvarer henholdsvis faste og stiplede svarte linjer og stiplede rød linje. 12% SDS-PAGE-analyse av de oppsamlede fraksjoner er vist ovenfor kromatogrammet. (B) Avsaltning av Tau-protein i en buffer egnet for lyofilisering. Mengden av renset Tau protein beregnet fra toppområdet (2260 mAU * ml) er 16 mg Tau. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4 Figur 4: 12% SDS-PAGE analyse av Tau. Lane 1, molekylvekt markør; kolonne 2, 10 ug Tau; spor 3, 10 mikrogram av ERK-fosforylert Tau. Tau, som andre fordrevne, kjører på en isolert måte på SDS-PAGE, ved en tilsynelatende molekylvekt på omtrent 60 kDa i stedet for den forventede 46 kDa. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Skjema av de viktigste trinnene for NMR prøveopparbeidelse, NMR-spektroskopi datainnsamling og databehandling. Skritt fra NMR prøveopparbeidelse til datainnsamling og prosessering er skissert som beskrevet i punkt 4 i protokollen. Klikk her for å se et større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: Oppsett av p1 parameter for NMR datainnsamling. Denne parameteren er forskjellig mellom prøvene og er i hovedsak avhengig av saltkonsentrasjonen. En standard 1H nutasjon kurve for 80% H2O i D2O er vist. Single-scan spektra med en resirkulerings forsinkelse på 30 sekunder ble samlet og plottet horisontalt. Puls (p1) ble variert fra 1 til 55 usek usek i trinn på en usek. I teorien bør signalet være maksimal for en 90 ° puls, og er lik null for en 180 ° puls. Men i praksis, forårsaker stråling demping asymmetri og faseforvrengningsproblemer som gjør det vanskelig å bestemme 90 ° eller 180 ° pulser direkte. Den andre null punkt svarer til en 360 ° puls varighet. Den forstørrede området viser et restsignal for en 360 ° puls som brukes til å definere o1p frekvensparameteren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7: NMR-data prosessering. (A) Free induksjon signal forråtnelse i tidsdomenet. 1D proton-spektra (B) som følge av Fourier-transformasjonen av den FID fra panel A til frekvensplanet, men med korrekt fase (PHC0 -206 °). (C) fases (PHC0 -113 °) og refererte (TMSP signal på 0 ppm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

"/>
Figur 8: 2D 1 H, 15 N HSQC spektra av rekombinant 15 N-Tau på 900 MHz. 3.072 og 416 oppkjøpet datapunkter ble registrert med spektrale bredder på 14 og 25 ppm i en H (F2) og 15 N (F1) dimensjoner, henholdsvis. 16 skanninger ble registrert pr F1 inkrement, som fører til en varighet av forsøket på 4 timer 30 min. (A) god kvalitet Tau prøve (B) Tau prøve viser degradering som avsløres ved fremkomsten av flere resonanser i et spesielt område av spekteret (høy felt 1H, lav felt 15 N), her eske i blått. Denne siste prøve ble fremstilt uten proteasehemmere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 9
Figur 9: 2D 1 H, 15 N HSQC spektra av rekombinant 15 N-Tau. (A) ufosforylerte Tau, 600 MHz spektrum (B) fosforylert Tau, 600 MHz spektrum og (C) fosforylert Tau, 900 MHz spektrum. Ytterligere resonanser i et spesielt område av spekteret, her eske i rødt, blir observert i fosforylert Tau-spektra. Disse resonanser, som tilsvarer proton amid (1 H 15 N) korrelasjoner av pSER og pThr rester, er lett visualisert i området rundt 8,5 til 9,5 ppm i 1 time og 117-125 ppm for 15 N, utenfor hoveddelen av 1 H, 15 N korrelasjoner av ufosforylerte Tau spekteret. (A og B) tilsvarer spektra ervervet ved 600 MHz, 2048 og 256 datapunkter på spektrale bredder på 14 og 25 ppm ble tatt opp i 1 H (F2) og 15 N (F1) dimensjoner, respektivt.32 skanninger ble brukt, og total varighet av oppkjøpet var 2 timer 44 min og (C) på 900 MHz, 3.072 og 416 datapunkter på spektrale bredder på 14 og 25 ppm ble registrert i en H (F2) og 15 N ( F1) dimensjoner, henholdsvis. 48 skanninger ble brukt, og total varighet av oppkjøpet var 6 timer 37 min. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 10
Figur 10: 3D 1 H, 15 N, 13 C NMR spekteret, prognoser og hentet 2D fly. 2048, 72, og 256 datapunkter ble tatt opp i 1 H (F3), 15 N (F2), og 13 C (F1) dimensjoner, respektivt. Spektrale bredder er 14, 25, og 61 ppm, sentrert på 4,7, 119 og 41 ppm i en H,15 N og 13 C dimensjoner, henholdsvis. Varighet av oppkjøpet med 16 skanninger er 4 dager og 6 timer. (A) Cube representasjon som svarer til den Fourier-transformerte 3D datasett av en HNCACB spektrum av ERK-fosforylert Tau erholdt ved 600 MHz. 2D 1 H, 15 N og en H, er 13 C flyene oppnås ved projeksjon av 3D-data langs 13 C og 15 N dimensjon, henholdsvis. Databehandling og representasjon ble gjort ved hjelp av NMR innsamling og prosessering programvare. (B) 2D 1H, 13C plan trukket ut fra 3D-1H, 15 N, 13C NMR datasett ved en 15 N kjemisk skift på 121,8 ppm. En zoom (til høyre) sentrert på en H kjemisk skift på 9,38 ppm viser 13 CA og 13 CB resonanser av både rester i (pThr153) og i-1 (Ala152). Den 13 CB resonans er overlappet på grunn av bredden av spectral vinduet. Grafisk representasjon og topp plukking ble utført ved hjelp av NMR-analyse programvare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har brukt NMR-spektroskopi for å karakterisere enzymatisk modifiserte Tau prøver. Den rekombinante ekspresjon og rensing som er beskrevet her for full-lengde humant Tau-protein kan på lignende måte bli brukt til å fremstille mutant Tau eller Tau-domener. Isotopisk anrikede protein som er nødvendig for NMR-spektroskopi, hvilket nødvendig rekombinant ekspresjon. Identifisering av fosforyleringsseter krever resonans oppdrag og en 15 N, 13 C dobbelt merket protein. Gitt kostnad av isotoper, er godt utbytte nødvendig i rekombinant ekspresjon trinnet. Glukose er den begrensende faktor for bakterievekst i M9 medium dermed mengden av 13 C 6 -glukose kan økes til 4 g per liter vekstmedium for å forbedre utbyttet. Tilsetting av komplett medium og MEM vitaminer er ikke obligatorisk, men bidra til å stimulere vekst og bedre avkastning. Gitt den høye kostnaden av hele merket medium er produktet bare anvendes som et vekstmedium supplement. Bakterievekst er treg i M9 medium. Vanligvis bakteriekulturer ved hjelp av M9 mediet supplert med 3% komplett medium rekkevidde tidspunktet for induksjon etter omtrent 4 timer med inkubasjon. En OD 600 på 1,6-1,8 blir vanligvis oppnådd ved slutten av kulturen. Forventet utbytte av rekombinant protein Tau er ca 15 mg per liter bakteriekultur. Bruken av en programmerbar inkubator gjør det mulig å enkelt beregne proteinproduksjon, samling av den bakterielle pellet og analytisk kontroll av proteinproduksjonen i løpet av arbeidsdagen timer.

Prøvekonsentrasjon er viktig for å oppnå en god kvalitet spektrum. En typisk prøve Tau tilstrekkelig for en 2D-spektrum ville inneholde 1 mg i 200 pl (dvs. 100 mm) tau-protein. For en 3D-spektrum, er minst 200 uM i 300 ul kreves, forutsatt at en kryogenisk sondehodet brukes. Tilgang til et høy-felt spektrometer, for eksempel 900 MHz instrument som brukes i denne studien vil gi bedre signal-til-støy-og redusere begrensninger på prøvekonsentrasjon (figur 8). Gitt at Tau er en stor uorden protein, er dens NMR spektra preget av betydelig signal overlapping, og en høy-feltet NMR-spektrometer vil også være det beste valget når det gjelder oppløsning (figur 8). Likevel resonanser svarende til fosforyleringsseter er i en distinkt område av spekteret, og er lett å oppdage selv med et 600 MHz spektrometer (sammenlign figurene 9 B og 9C). I tillegg, på grunn av sin uordnede natur, er det Tau-protein følsom overfor proteolyse (figurene 8B).

Sterilisering av buffere anbefales å begrense Tau degradering. Tilsetning av proteaseinhibitorer til NMR-prøven bidrar til å beskytte Tau mot nedbrytning under datainnsamlingsperioder som kan vare i fra timer til dager, avhengig av pulssekvensen. Lav pH (dvs. pH under 7.0) er nødvendig for å AvOID for fort utveksling mellom protein protoner og vann protoner, noe som fører til signal utvidelse. Eksempel pH må også være godt kontrollert for å sikre reproduserbarhet av spektrene. Faktisk, siden pKa-verdier av pSER og pThr er nær den optimale pH-verdien for NMR-spektroskopi, kjemiske skift av fosforylerte rester er svært følsomme for pH-variasjoner. Justering av pH-verdien av NMR-prøven kan foretas direkte ved hjelp av et pH-meter med en pH-mikroelektrode som er tilpasset små volumer. Tau er et løselig protein og ikke samler seg i standard betingelser. Tilsetning av polyanioner, slik som heparin-sulfat, og inkubering ved 37 ° C kan starte aggregering Tau prøver. I dette tilfelle gis den faste karakter av aggregatene, de fleste resonanser i det tilsvarende NMR-spektrum utvide utover deteksjon. Selv de fosforylerte Tau prøvene ikke tilslag i betingelsene beskrevet her for NMR datainnsamling.

Sammenlignet med antistoffanalyse, gir NMR en overall utsikt over PTMs. Massespektrometri kan også brukes til å identifisere den fosforylering mønster av en proteinprøve. Isotop-merking er ikke nødvendig for denne teknikken, og som kreves for prøvemengder er mye mindre. Imidlertid karakterisering av et protein med flere phosphorylations, slik som Tau, forblir utfordrende. Tilstøtende phosphorylations vil produsere isobariske peptider i bottom-up strategier for identifikasjon. Fullstendig identifisering deretter behov MS / MS-sekvensering av peptidene ble oppnådd ved å sample proteolyse. En fordel med NMR består i det indre kvantitativ karakter av teknikken. Intensiteten av et NMR-signal kan være knyttet til mengden av den kjemiske gruppen tilstede på et bestemt område. Vi kan således definere andelen av kjemisk modifisering på hvert sted. Nyeste fremgang i MS applikasjoner har imidlertid vist at MS analyse av Tau multippel fosforylering er mulig 24, selv i en kvantitativ måte etter skikkelig normalisering 25.

Her presenteres vi Tau fosforylering av aktivert ERK2, men metodikken kan brukes til fosforylering til andre kinaser, så vel 6,7,26 - 28. Kinetiske eksperimenter kan utføres, noe som kan hjelpe til å definere kinase spesifisitet mot et proteinsubstrat 28-31. Fosforylering studier er ikke begrenset til rekombinante kinaser, og kinase-aktivitet av celle- eller vevsekstrakter kan analyseres 6,32,28. En interessant utvikling er bruk av in-cell NMR til å studere in situ modifikasjoner 33,34. Omvendt, NMR er også velegnet for å løse fosfatase spesifisitet, som ble vist ved å studere defosforylering av fosforylert Tau av PP2A-fosfatase 35. NMR-spektroskopi kan anvendes til karakterisering av kinase-inhibitorer ved å sammenligne fosforylering profilen av proteinet substratet i et 2D-spektrum i nærvær av inhibitoren forbindelsen with spekteret utstedt fra et kontrollforsøk 6.

Interessen for å bruke NMR-spektroskopi, sammenlignet med de mer følsomme MS teknikker, ligger i det brede spekter av applikasjoner som utnytter protokollen beskrevet her i stedet for på sin analytiske kapasitet alene. Det har vist seg viktig å identifisere fosforyleringsseter for å være i stand til å koble spesifikke phosphorylations med strukturelle eller funksjonelle modifiseringer som er hovedsakelig studert ved bruk av NMR. NMR-spektroskopi av fosforylerte Tau prøver gjør det mulig å utforske den strukturelle virkningen av fosforylering på begge forbigående lokale sekundære konstruksjoner og på global omorganisering av dynamisk ensemble av modifisert Tau 36,37. Funksjonelle aspektene inkluderer regulering av både samspillet mellom Tau med protein partnere 7,38,39 og aggregering av Tau fosforylering 8. Den fosforylert Tau Prøven karakterisert ved NMR kan videre brukes til å dechiffrere fosfo-avhengige interaksjoner, foreksempel med 14-3-3 proteiner 40, og utviklet protein-protein interaksjon hemmere 41,42. NMR tillater definisjon av interaksjon (r) på rester nivå, og i avhengighet av dette samspillet på fosforylering. I tillegg NMR-spektroskopi av fosforylert Tau er et viktig metode for å karakterisere prolin cis: trans isomerase Pin1, en viktig fosfo-avhengig enzym som er involvert i regulering Tau 43-45. I tillegg kan påføres fosforylering analyse med NMR, ikke bare for å fordrevne men også for å globulære proteiner 46. Endelig kan andre typer Tau PTMs som acetylations 22,40,41 bli studert ved NMR. Protokollen beskrevet her har vist seg avgjørende for bedre å forstå den funksjonelle og strukturelle regulering av Tau i fysiologiske og patologiske tilstander.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET15B recombinant T7 expression plasmid Novagen 69257 Keep at -20 °C
BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria New England Biolabs C2527I Keep at -80 °C
Autoclaved LB Broth, Lennox  DIFCO 240210 Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100x Sigma 58970C Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder Sigma 608297 Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl Sigma 299251 Isotope
13C6-Glucose Sigma 389374 Isotope
Protease inhibitor tablets  Roche 5056489001 Keep at 4 °C
1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C
DNaseI EUROMEDEX 1307 Keep at -20 °C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) AVESTIN Lysis is realized at 4 °C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker Pierce 266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged Sigma M8822 Keep at -80 °C
AKTÄ Pure chromatography system GE Healthcare FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column) GE Healthcare 17-5156-01 Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting GE Healthcare 17-5087-01 Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25 GE Healthcare 28-9180-08 Protein Desalting column
Tris D11, 97% D Cortecnet CD4035P5 Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe)  Euriso-top BMS-005B NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit Cortecnet 2910000 Pipetting
Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1 Bruker Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114 UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) NMR data Analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
  2. Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer's disease brain. J. Biol. Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
  3. Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268 (32), 24374-24384 (1993).
  4. Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging. 16 (3), 409-417 (1995).
  5. Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482 (2011).
  6. Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128 (11), 3575-3583 (2006).
  7. Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23 (4), 1146-1152 (2009).
  8. Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291 (14), 7742-7753 (2016).
  9. Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133 (40), 15842-15845 (2011).
  10. Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249 (4964), 64-67 (1990).
  11. Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343 (6259), 651-653 (1990).
  12. Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (14), 6142-6146 (1991).
  13. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  14. Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56 (1), 125-135 (1987).
  15. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  17. Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15 (3), 203-206 (1999).
  18. Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5 (1), 67-81 (1995).
  19. Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132 (51), 18000-18003 (2010).
  20. Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5 (1), 73-78 (2004).
  21. Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5 (12), 1639-1646 (2004).
  22. Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7 (2), e34 (2009).
  23. Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7 (4), e34679 (2012).
  24. Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18 (8), 1183-1189 (2015).
  25. Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88 (7), 3704-3714 (2016).
  26. Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285 (43), 33435-33444 (2010).
  27. Theillet, F. -X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
  28. Qi, H., Cantrelle, F. -X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  29. Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
  30. Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137 (20), 6468-6471 (2015).
  31. Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
  32. Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
  33. Bodart, J. -F., Wieruszeski, J. -M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192 (2), 252-257 (2008).
  34. Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
  35. Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer's disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521 (2011).
  36. Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80 (2), 454-462 (2012).
  37. Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23 (8), 1448-1458 (2015).
  38. Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412 (4), 743-746 (2011).
  39. Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1's SH3 domain and Tau's proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3 (1), (2015).
  40. Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29 (10), 4133-4144 (2015).
  41. Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48 (15), 4815-4823 (2005).
  42. Milroy, L. -G., Bartel, M., et al. Stabilizer-Guided Inhibition of Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54 (52), 15720-15724 (2015).
  43. Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochemistry. 43 (7), 2032-2040 (2004).
  44. Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7 (3), 179-194 (2006).
  45. Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274 (20), 5211-5222 (2007).
  46. Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
  47. Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16 (8), 414-423 (2010).
  48. Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochemistry. 53 (18), 3020-3032 (2014).

Tags

Biokjemi kjernemagnetisk resonans spektroskopi isotopisk merking egen uordnede protein rekombinant protein proteinrensing protein fosforylering NMR datainnsamling resonans oppdrag.
Nuclear Magnetic Resonance spektroskopi for identifisering av flere Phosphorylations med egen Uordnede Proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Danis, C., Despres, C., Bessa, L.… More

Danis, C., Despres, C., Bessa, L. M., Malki, I., Merzougui, H., Huvent, I., Qi, H., Lippens, G., Cantrelle, F. X., Schneider, R., Hanoulle, X., Smet-Nocca, C., Landrieu, I. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (118), e55001, doi:10.3791/55001 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter