Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים

Published: December 27, 2016 doi: 10.3791/55001
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1UMR8576, CNRS, Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS, Lille University
* These authors contributed equally

Introduction

אחד האתגרים העיקריים של שירותי בריאות במאה ה -21 הם מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD). טאו הוא חלבון הקשורים-microtubule שמגר microtubule היווצרות (MT). טאו מעורב באותה מידה בכמה הפרעות ניווניות, tauopathies שנקרא, מתוכם את הטוב ביותר הידוע הוא לספירה. בהפרעות אלה, אגרגטים עצמיים טאו בחוטי סליל לזווג (PHFs) והוא נמצא שונה על שאריות רבות על ידי שינויי posttranslational (PTMs) כגון זרחון 1. זירחון של חלבון טאו הוא מעורב בשני הסדרת תפקודו הפיזיולוגי של ייצוב MT ואובדן פתולוגית של פונקציה המאפיינת נוירונים לספירה.

יתר על כן, חלבון טאו, כאשר משולבים PHFs בנוירונים חולה, ללא יוצא מן הכלל הוא hyperphosphorylated 2. בניגוד טאו רגיל המכיל 2-3 קבוצות פוספט, את טאו hyperphosphorylated ב PHFs מכיל 5 עד 9 phosphatקבוצות דואר 3. Hyperphosphorylation של טאו תואמת הן לעלייה של stoichiometry בכמה אתרים כדי זירחון של אתרים נוספים שנקראים אתרי פתולוגית של זירחון. עם זאת, קיימת חפיפה בין AD ודפוסים מבוגרים נורמלים של זירחון, למרות הבדלים כמותיים ברמה 4. איך פונקצית השפעה ספציפית אירועי זירחון לבין תפקוד לקוי של טאו נותר ברובה לא ידוע. אנו שואפים לפענח תקנת טאו ידי PTMs ברמה המולקולרית.

כדי להעמיק את ההבנה של ההיבטים המולקולריים של טאו, אנחנו צריכים להתמודד עם אתגרים טכניים. ראשית, טאו הוא חלבון סדר מהותי (IDP) כאשר מבודדים בתמיסה. חלבונים כאלה חסרי מבנה תלת ממדי מוגדר היטב גם במצב רגיל וגם דורשים שיטות biophysical בפרט ללמוד תפקידם (ים) ו תכונות מבניות. טאו היא פרדיגמה עבור המעמד ההולך וגדל של עקורים, נמצא לעתים קרובות קשורפתולוגיות כגון מחלות ניווניות, ומכאן גברת העניין כדי להבין את הפרמטרים המולקולריים שבבסיס תפקידיהם. שנית, אפיון של זירחון טאו הוא אתגר אנליטי, עם 80 אתרי זירחון פוטנציאל לאורך הרצף של איזופורם טאו 441 חומצות אמיניות הארוכה. מספר הנוגדנים פותח כנגד אפיטופים פוספורילציה של טאו ומשמש לצורך זיהוי של טאו פתולוגי בנוירונים או רקמת המוח. אירועי זירחון יכולים להתקיים ב -20 אתרים לפחות על כוונת של קינאזות מכוונת פרולין, רובם בסמיכות בתוך אזור פרולין העשיר. טיבה האיכותי (אילו אתרים?) וכמוני (מה ורכב?) אפיון קשה אפילו על ידי טכניקות MS האחרונות 5.

ספקטרוסקופיה NMR יכול לשמש כדי לחקור חלבונים סדר כי הם מערכות דינמיות מאוד היוו של הרכבים של conformers. ספקטרוסקופיה NMR ברזולוציה גבוהה הייתה applied לחקור הן המבנה והתפקוד של חלבון טאו. בנוסף, את המורכבות של פרופיל זירחון של טאו הובילו לפיתוח של כלים מולקולריים ושיטות אנליטיות חדשות באמצעות NMR לזיהוי אתרי זירחון 6 - 8. תמ"ג כשיטת אנליטיים מאפשר זיהוי של אתרי זירחון טאו באופן גלובלי, ויזואליזציה של כל השינויים באתר יחיד בניסוי יחיד, וכימות של היקף ההתאגדות פוספט. נקודה זו חיונית שכן למרות שמחקרים זירחון על טאו בשפע בספרות, רובם בוצעו עם נוגדנים, משאיר מידה רבה של אי-ודאות לגבי הפרופיל המלא של זרחון ובכך את ההשפעה האמיתית של אירועי זירחון פרט. קינאזות רקומביננטי כולל PKA, 3β קינאז גליקוגן-synthase (Gsk3β), A 2 / cyclin קינאז Cyclin התלוי (CDK2 / CycA), קינאז תלוי-ציקלין 5 (CDK5) / מעשה p25 חלבון ivator, קינאז התאי מוסדרת-אות 2 (ERK2) ו microtubule-זיקה-ויסות קינאז (MARK), אשר ניכר פעילות זירחון כלפי טאו, ניתן להכין בצורה פעילה. בנוסף, מוטציות טאו המאפשרות יצירת isoforms חלבון טאו ספציפי עם דפוסי זירחון היטב מאופיינים משמשות לפענח את קוד זירחון של טאו. ספקטרוסקופיה NMR מכן נעשה שימוש כדי לאפיין דגימות טאו שונה enzymatically 6 - 8. למרות במבחנה זירחון של טאו הוא יותר מאתגר מאשר-זירחון פסאודו כגון על ידי מוטציה של הנבחרת שירו / Thr לחומצה גלוטמית (Glu) שאריות, גישה זו יש לגופו. ואכן, לא פרמטרי ההשפעה ולא אינטראקציה המבניות של זירחון ניתן חיקה תמיד על ידי חומצות גלוטמית. דוגמה לכך היא המוטיב בתורו נצפה סביב phosphoserine 202 (pSer202) / phosphothreonine 205 (pThr205), אשר אינו משוחזר עם Glu מוטציות 9.

ss = "jove_content"> כאן, הכנת טאו שכותרתו isotopically לחקירות NMR יתואר ראשון. חלבון טאו פוספורילציה ידי ERK2 הוא שונה באתרים רבים מתוארים באתרי פתולוגית של זירחון, ובכך מייצג מודל מעניין של טאו hyperphosphorylated. פרוטוקול מפורט של טאו בזירחון במבחנה על ידי קינאז ERK2 רקומביננטי מוצג. ERK2 מופעל על ידי זירחון על ידי קינאז חלבון מופעל mitogen / קינאז ERK (MEK) 10 - 12. בנוסף ההכנה שונה, שכותרתו isotopically חלבון טאו, אסטרטגית NMR המשמשת לזיהוי של PTMs מתוארת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור של 15 N, 13 C-טאו (איור 1)

  1. Transform פלסמיד ביטוי T7 רקומביננטי pET15b-טאו 13,14 לתוך BL21 (DE3) תאים חיידקיים המוסמכות coli Escherichia 15.
    הערה: קידוד cDNA עבור איזופורם טאו הארוך (441 שאריות חומצת אמינו) הוא משובטים בין NcoI ו XhoI אתרי הגבלה פלסמיד pET15b.
    1. מערבבים בעדינות 50 μl של BL21 המוסמכת (DE3) תאים, ויצרו 1-5 x 10 7 מושבות לכל מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד, עם 100 ננוגרם של DNA פלסמיד בתוך שפופרת פלסטיק 1.5 מ"ל.
      הערה: קודון-שימוש אופטימיזציה זני חיידקים לביטוי cDNA איקריוטיים אינם חיוניים לייצר טאו אדם.
    2. מניחים את תערובת תאים על קרח למשך 30 דקות ולאחר מכן הלם חום במשך 10 שניות על 42 מעלות צלזיוס. מניחים את הצינור בחזרה על קרח למשך 5 דקות ולהוסיף 1 מ"ל של בטמפרטורת החדר LB (לוריא- Bertani) בינוני. לדגור על השעיית חיידקים על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תחת עדיןתסיסה.
  2. מורח באמצעות לולאת חיסון 100 μl של השעית התא באופן שווה על צלחת אגר של מדיום LB המכיל 100 מיקרוגרם / מיליליטר של אנטיביוטיקת אמפיצילין.
  3. דגירה את הצלחת הבחירה במשך 15 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. שמור את הצלחת הבחירה ב 4 ° C עד שתמשיך לשלב תרבות, לכל היותר 2 שבועות כ.
    הערה: מלאי גליצרול של התרבות חיידקים (50% גליצרול), המאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס, ניתן להכין להתחיל בתרבות בשלב מאוחר יותר.
  5. הוסף 1 מ"ל 1 M 4 MgSO, 1 מ"ל 100 מ"מ CaCl 2, 10 מ"ל 100x השלמה ויטמין MEM, 1 מ"ל 100 מ"ג / אמפיצילין מ"ל עד 1 ליטר של מלחים M9 autoclaved (6 גרם Na 2 4 HPO, 3 גרם KH 2 PO 4 , 0.5 גרם NaCl).
    הערה: משקע לבן יהווה על תוספת של פתרון CaCl 2 אל מלחי M9 כי מתפוגגים במהירות.
  6. Solubilize 300 מ"ג של 15 N, 13 בינוני C-שלם, 1 גרם של 15NH 4 Cl ו -2 גרם של 13 C 6 -glucose ב 10 מ"ל של מדיום M9. סנן לעקר את הפתרון איזוטופ באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר, ישירות לתוך המדיום M9.
  7. להשעות באמצעות המושבה חיסון לולאה אחת pET15b-טאו טרנספורמציה חיידקים מהצלחת הבחירה ב 20 מ"ל של מדיום LB בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אמפיצילין.
  8. דגירה בינוני מחוסן ב 37 מעלות צלזיוס במשך כ -6 שעות.
  9. מדוד צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) ב -1 מ"ל של דילול פי עשרה של התרבות חיידקים קובט ספקטרומטר פלסטיק.
    הערה: עכירות של תרבות החיידקים המתאימה OD 600 של 3.0-4.0 עולה כי בשלב צמיחה הרוויה הוא הגיע.
  10. הוסף 20 מ"ל של התרבות LB רווי 1 ליטר של מדיום הגידול M9 השלימו עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם / הריכוז הסופי מ"ל), ב 2 בקבוק תרבות L Erlenmeyer פלסטיק מבולבל.
  11. מניח את בקבוק תרבות חממה לתכנות מוגדר 10 °C ו -50 סל"ד. לתכנת את החממה כדי לעבור 200 סל"ד ו -37 מעלות צלזיוס בשעות הבוקר המוקדמות של יום המחרת.
  12. OD מדוד 600 על 1 מ"ל של תרבית החיידקים ב קובט ספקטרומטר פלסטיק. להוסיף 400 μl של 1 M IPTG (איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside) פתרון מניות (כל הזמן ב -20 ° C) כאשר OD 600 מגיע לערך של 1.0 עומד להשרות את הביטוי של חלבון טאו רקומביננטי.
  13. המשך הדגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופת hr 3 נוספת. אסוף תאים חיידקיים ידי צנטריפוגה ב 5000 XG במשך 20 דקות.
  14. להקפיא את גלולת החיידקים ב -20 ° C. שמור קפוא עד שלב הטיהור, במשך תקופה ארוכה במידת צורך.

טיהור 2. של 15 N, 13 C-טאו (איור 2)

  1. מאגרי טיהור קטיון חילופי חיטוי (CEX) ב 121 מעלות צלזיוס מתחת לגיל 15 psi במשך 20 דקות. מאגרי חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. ההפשרה גלולה תא החיידק ו resuspend ביסודיות 45 מ"לממוצא CEX חיץ (50 מ"מ NaPi חיץ pH 6.5, 1 mM EDTA) השלימו טרי עם 1x קוקטייל מעכבי פרוטאז (1 טאבלטים) DNAseI (2,000 יחידות).
  3. לשבש תאים חיידקיים באמצעות homogenizer בלחץ גבוה ב -20,000 psi. 3-4 עובר נחוצים. צנטריפוגה ב 20,000 XG במשך 40 דקות כדי להסיר חומר מסיס.
  4. מחמם את תמצית תא החיידק במשך 15 דקות ב 75 מעלות צלזיוס באמצעות אמבט מים.
    הערה: משקע לבן הוא ציין לאחר כמה דקות.
  5. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 20 דקות ולשמור את supernatant המכיל את חלבון טאו חום יציב.
  6. חנות ב -20 ° C עד שלב הטיהור הבא, במידת צורך.
  7. בצע כרומטוגרפיה קטיון החליפין על שרף CEX חזק ארוז כגיס 5 מ"ל המיטה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר (FPLC) מערכת (איור 3).
    1. קצב הזרימה נקבע ל -2.5 מ"ל / דקה.
    2. לאזן את העמודה CEX חיץ
    3. טען את heated- 60-70 מ"ללחלץ המכיל טאו באמצעות משאבת מדגם, או לחילופין לשאוב A, בהתאם למערכת. אסוף את הזרימה דרך לניתוח על מנת לוודא כי חלבון טאו מחייב ביעילות השרף (ראה 2.8).
    4. לשטוף את השרף עם CEX חיץ עד ספיגה ב 280 ננומטר הוא חוזר לערך בסיס.
    5. Elute טאו מהעמודה באמצעות שיפוע NaCl שלושה שלבים מתקבל על ידי עלייה הדרגתית של חיץ B CEX (CEX חיץ עם 1 M NaCl). תכנת את FPLC כדלקמן: השלב הראשון של שיפוע עד 25% CEX B חיץ 10 כרכים עמודה (CV) להגיע 250 מ"מ NaCl, הצעד השני ל -50% CEX B חיץ 5 קורות חיים כדי להגיע ל -500 מ"מ NaCl, ואת השלב השלישי עד 100% CEX B חיץ 2 CV להגיע 1 M NaCl. אסוף 1.5 מיליליטר שבר במהלך שלבי elution.
  8. לנתח 10 μl של שברים שנאספו במהלך השלב elution ידי SDS-PAGE (12% ג'ל SDS-acrylamide) ו Coomassie מכתים (איור 3 א) 16. בדוק את שלב הטעינה על הטור, כמו גם על ידי analyזיע 10 μl של דרך-זרימה.
  9. בחר שברים המכיל טאו ובריכת שברים אלה לשלב הבא.
  10. בצע חילוף חיץ על טאו המכיל שברים ונקוו (איור 3 ב ').
    1. לאזן טור desalting מהמיטה ארז שרף 53 מ"ל G25 (26 x 10 ס"מ) אמוניום ביקרבונט 50 מ"מ (חיץ נדיפים) באמצעות מערכת FPLC.
    2. קצב הזרימה סט 5 מ"ל / דקה. להזריק את מדגם טאו על עמודה באמצעות לולאה הזרקת 5 מ"ל. אסוף שברים המתאים שיא ספיגת ב 280 ננומטר.
    3. חזור על הזריקה 3-4 פעמים, תלוי בנפח של ברכת CEX הראשונית.
  11. לחשב את כמות החלבון טאו מטוהרים באמצעות אזור השיא של chromatogram ב 280 ננומטר (1 מ"ג של טאו תואמת 140 מאו * מ"ל).
    הערה: מקדם ההכחדה של חלבון טאו ב 280 ננומטר היא 7,550 M -1 cm -1. טאו אינו מכיל שאריות TRP.
  12. הברכה כל שברי טאו.
  13. Aliquot המדגם לתוך צינורות המכילים את המקבילה של 1 עד 5 מ"ג של טאו. בחר צינורות אלה, כך היקף הפתרון הוא קטן בהשוואה להיקף הצינור (למשל 5 מ"ל של תמיסת בתוך שפופרת 50 מ"ל).
  14. פונץ 'חורי כמוסות הצינור באמצעות מחט. להקפיא דגימות טאו ב -80 מעלות צלזיוס.
  15. Lyophilize דגימות טאו. חלבון Lyophilized טאו יכול להישמר ב -20 מעלות צלזיוס במשך פרקי זמן ארוכים.

3. במבחנה זירחון של 15 N-טאו

  1. ממיסים 5 מ"ג טאו lyophilized במאגר 500 זירחון μl (50 מ"מ Hepes · KOH, pH 8.0, 12.5 מ"מ MgCl 2, 1 mM EDTA, 50 מ"מ NaCl).
  2. להוסיף 2.5 מ"מ ATP (25 μl של 100 מ"מ מניות פתרון והמשיך ב -20 מעלות צלזיוס), 1 מ"מ DTT (1 μl של 1 M פתרון מניות והמשיך ב -20 ° C), 1 מ"מ EGTA (2 μl של המניה 0.5 M פתרון), מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x (25 μl של המניה 40x מתקבל על ידי המסת 1 לוח במאגר 1 מ"ל זירחון) ו -181; M המופעל ERK2 שלו (250 μl חיץ שימור 10 מ"מ Hepes, pH 7.3, 1 מ"מ DTT, 5 מ"מ MgCl 2, 100 מ"מ NaCl ו -10% גליצרול, לאחסן ב -80 ° C) בהיקף המדגם של 1 מ"ל.
    הערה: המופעל ERK2 שלו יכול להיות מוכן בתוך הבית 5,8 ידי זרחון עם קינאז MEK.
  3. דגירה 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. מחממים את המדגם ב 75 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להשבית קינאז ERK.
  5. צנטריפוגה ב 20,000 XG במשך 15 דקות. לאסוף ולשמור את supernatant.
  6. Desalt המדגם חלבון לתוך אמוניום ביקרבונט 50 מ"מ באמצעות טור מהמיטה ארז שרף 3.45 מ"ל G25 (1.3 x 2.6 ס"מ), אשר מתאים מדגם 1 מ"ל.
  7. הפעל 12% SDS-PAGE 16 עם 2.5 μl של מדגם החלבון לבדוק הן שלמותה זירחון ביותר (איור 4).
  8. Lyophilize מדגם טאו פוספורילציה. אחסן את האבקה ב -20 ° C.

4. רכישת NMR ספקטרה (אלחוטיאיור 5)

  1. Solubilize 4 מ"ג lyophilized 15 N, 13 C ERK-פוספורילציה-טאו חיץ 400 μl תמ"ג (50 מ"מ NaPi או 50 מ"מ deuterated כמה עצוב D11 .cl, pH 6.5, 30 mM NaCl, 2.5 mM EDTA ו 1 מ"מ DTT).
  2. הוסף 5% D 2 O עבור נעילה בתחום ספקטרומטר תמ"ג ו -1 מ"מ TMSP (3- (trimethylsilyl) מלח נתרן propionic-2,2,3,3-ד 4 חומצה)) כנקודת התייחסות אות תמ"ג פנימי. הוסף 10 μl של פתרון 40x מלאה של מעכבי פרוטאז קוקטייל שלם.
  3. מעביר את המדגם בתוך שפופרת NMR 5 מ"מ באמצעות מזרק אלקטרוני עם מחט ארוכה או פיפטה פסטר. סגור את צינור NMR באמצעות הבוכנה. הסר את כל בועות אוויר שנלכדו בין הבוכנה ונוזל ידי תנועות הבוכנה.
  4. מניח את צינור תמ"ג הצנטריפוגה. התאם במצב האנכי שלה טווה עם המד המתאים ראש חללית NMR בשימוש, באופן שמרבית הפתרון המדגם יהיה בתוך סליל NMR.
  5. הפעל את זרימת האוויר: לחץ אני מריםn חלון מערכת בקרת מגנט. בזהירות במקום טווה עם הצינורית את זרימת האוויר בחלק העליון של קנה המגנט. עצור את זרימת האוויר (לחץ מעלית) ולתת הצינור לרדת למקומו בתוך ראש בדיקת המגנט.
  6. טמפרטורה מוגדרת 25 ° C (298 K).
  7. בצע חצי אוטומטי כוונון והתאמה של ראש החללית כדי לייעל העברת כוח. הקלד atmm על שורת הפקודה.
  8. נעל את תדירות ספקטרומטר באמצעות האות D 2 O של המדגם נרשם בערוץ דאוטריום. לחץ מנעול בחלון מערכת בקרת מגנט.
  9. להתחיל את הליך shimming כדי לייעל ההומוגניות של השדה המגנטי בעמדה של המדגם. הקלד topshim GUI בשורת הפקודה כדי לפתוח את חלון שים. לחץ להתחיל בחלון שים. בדוק את ערך הגירסה הסטנדרטית שיורית B0 כדי לוודא shims הם אופטימליים (פחות מ -2 הרץ הוא טוב).
  10. כייל את הפרמטר p1 (אורך של פרוטוןדופק גלי רדיו ב μsec), אשר יש צורך לקבל 90 ° סיבוב של ספיני פרוטון. כוון את הדופק 360 ° באמצעות ספקטרום 1D הפרוטונים מים (איור 6).
  11. התאם את התדירות בקיזוז קביעת פרמטר O1 (ב רץ) לתדר מי פרוטון בספקטרום 1D (איור 6).
  12. התחל רכישת ספקטרום פרוטון 1D (רצף דופק עם רצף ווטרגייט לדיכוי אות מים, למשל zggpw5) לאמת אותות מן המדגם (איור 7). התאם את מספר סריקות על ריכוז החלבון יחסית. הקלד ZG על שורת הפקודה כדי להפעיל את הרכישה.
  13. הגדרת פרמטרים נוספים לרכישת 2 ד [1 H, 15 N] ספקטרום HSQC (הדופק רצף hsqcetfpf3gpsi, תרשימים 8-9).
    1. במשך 15 N, 13 C שכותרתו מדגם, לנתק 13 צלזיוס במהלך 15 האבולוציה העקיפה N.
      2. 1 H (F2) ו -15 N ממדים (F1).
      הערה: התאם את מספר נקודות הנתונים הרכישה לשדה ספקטרומטר לשמור על מספר דומה של הרץ לכל נקודה ולהגביל decoupling פעמים: להשתמש 3,072 נקודות ב -900 מגה-הרץ ו -2,048 נקודות ב 600 MHz, בממד 1 H.
    2. מטב פרמטרים נוספים של הרצפים הדופקים, מתאים עיכובים, אורכי דופק, לקזז תדרים, רמות כוח. סוג ased על שורת הפקודה כדי להציג את כל הפרמטרים הרלוונטיים לניסוי.
  14. פרמטרים שנקבעו לרכישת מגהרץ 3D [1 H, 15 N, 13 C] HNCACB ספקטרום (הדופק רצף hncacbgpwg3d, איור 10A) ב 600.
  15. פרמטרים שנקבעו עבור 3D [1 H, 15 N, 15 N] ניסוי HNCANNH (hncannhgpwg3d רצף דופק) ב 600 MHz. הגדר את מספר נקודות 2048 ב H 1 ו, 64ו -128 נקודות בשנתיים 15 N ממדים. הגדר את רוחב ספקטרלי כמו 14, 25, 25 חלקים למיליון (ppm) התרכזו 4.7, 119, 119 עמודים לדקה ב 1 H, 15 N ו- 15 N ממדים. משך הרכישה עם 16 סריקות הוא יום 1 ו -22 שעות.

5. זיהוי של אתרי זירחון

  1. ספקטרה תהליך באמצעות תוכנת רכישה והעיבוד NMR.
    1. בצע טרנספורמציה פורייה של הנתונים (איור 7). סוג רגל עבור ספקטרום 1D, xfb עבור ספקטרום 2D או ft3d עבור ספקטרום 3D, על שורת הפקודה.
    2. שלב והתייחסות כל ספקטרום (7C איור) באמצעות חלונות אינטראקטיביים.
  2. זיהוי תהודות של עניין 2D HSQC המקביל פוטנציאל למשקעים שירו ו Thr פוספורילציה (איור 9, תיבה אדומה).
  3. מטוסי חלץ (כלומר 2D 1 H- 13 ספקטרה צלזיוס)ספקטרום 3D 1 H- 15 N- 13 C באמצעות 15 N המשמרות הכימיות של תהודות של עניין 2D. השתמש הסמן של מימד 2 (W2) כדי לבחור את תדירות 15 N המקביל למישור (W1-W3) להיות דמיינו (איור 10 ב).
  4. פיק תדרי התהודה של Ca '' ו 'CB' 13 גרעיני C של 'אני' ו 'אני-1 "שאריות (סט החלשות אותות בהשוואה לאלו של שאריות i) עבור כל [1 H, 15 N] תהודה עניין בספקטרום 3D HNCACB ידי לחיצה על התהודה, בתפריט מצב המצביע למצוא / להוסיף שיא, להוסיף את ערך המשמרת הכימי בקובץ רשימת שיא.
    1. זהה את סוג שאריות i, pSer או pThr, על ידי השוואת המשמרות הכימיות ברשימת השיא לערכים הידועים של CA משמרות כימיות CB של pSer ו pThr 17.
    2. זיהוי נוכחות של שאריות פרו בבית i + 1 עמדה על ידי o שינוי מאפיין נוסף +2 עמודים לדקהf ערך המשמרת הכימי CA 18.
    3. השווה את הערכים המשמרים הכימית של תהודות CA ו- CB מתאימות שאריות i-1 שולחן של משמרות כימיות ניבאו שאריות חומצת אמינו טאו 19 לזהות את אופי השאריות במיקום i-1.
  5. פיק תדרי התהודה של 15 N גרעינים של 'אני' ו 'אני-1 "שאריות לכל [1 H, 15 N] תהודה של עניין ספקטרום HNCANNH.
  6. השווה את הערכים המשמרים כימי 15 N אל משימת המשמרת הכימית של חלבון טאו 20 - 23.
  7. השווה את dipeptides המזוהה עם רצף טאו להגדיר את משימת רצף מסוימת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 3 א מציג שיא ספיג גדול ב 280 ננומטר שנצפו במהלך שיפוע elution. שיא זה מתאים חלבון טאו מטוהרים כפי שניתן לראות על ג'ל acrylamide מעל הכרומתוגרמה. איור 3 ב מציג לשיא ספיגה מופרד היטב ב 280 ננומטר שיא של מוליכות, להבטיח כי desalting של החלבון הוא יעיל. איור 4 מראה ג'ל משמרת חלבון נצפתה על ידי SDS-PAGE ניתוח 16 מאפיין של זרחון חלבון המרובה (להשוות מסלולים 2 ו -3). איור 6 מציג סדרה של פרוטון (1 H) ספקטרום 1D עם הגדלת אורכי הדופק (ב μsec). כדי להגדיר את אורך הפולס כי יסתובב 1 H המגנטיזציה ספין של 90 מעלות, דופק מתאים סיבוב 360 מעלות משמש בפועל, כפי שהוא קל יותר לכייל ידי מזעור האות. האות של פרוטונים מים בטלה כאשר אורך הפולס 360 ° מוגדר כראוי. הערך המקביל ל 36076; סיבוב לאחר מכן מחולק 4. p1 בניסוי זה הוא 10.5 μsec. אזור מוגדל: תדירות האות שיורית משמש להגדרת הפרמטר o1p (תדירות לקזז עבור 1 H). איור 7 א מראה ריקבון אינדוקציה חינם (FID), דמיינו על מנת להבטיח כי אות תמ"ג מזוהה. איור 7. מראה ספקטרום H 1D 1 עם שלב שגוי, כפי שניתן לראות על ידי תהודות המופיעות פסגות סימטריות כמו. איור 7C מראה ספקטרום H 1D 1 עם אות טובה יחס רעש, המציין את פרמטרי רכישת הבסיסי הוגדרו כראוי ואיתות מן מדגם החלבון ניתן לאתר. איור 8 מציג 2D 1 H, 15 N HSQC ספקטרום של רקומביננטי 15 N-טאו ב 900 MHz; איור 8 א ברגישות רזולוציה טובה ואיור 8B. עם זיהוי של proteolysis במדגם, כפי שניתן לראות על ידי הופעתו של PE נוספים AKS בספקטרום (הקופסה הכחולה). איור 9 מציג 2D 1 H, 15 N HSQC ספקטרום של רקומביננטי 15 N-טאו איור 9 א ב 600 MHz, עם רגישות טובה אבל פחות ברזולוציה לעומת איור 8 א. 9B האיור ב 600 MHz, תערוכות מראה של פסגות נוספות בספקטרום מתאים שאריות פוספורילציה (תיבה אדומה). 9 ג איור ב 900 MHz, מראה פסגות בספקטרום מתאימות שאריות פוספורילציה (תיבה אדומה). רזולוציה עדיפה באיור 9 ב. איור 10 א 'מוצגים תחזיות מספקטרום 3D NMR המשמש להערכת ניסוי מוצלח. איור 10B תערוכות מטוס C 1 H- 13 שחולץ מן ספקטרום 3D 1 H- 15 N- 13 C עם עוצמת אות טובה המאפשרת לזהות 13 אותות C משתי i ו- i-1 שאריות.

together.within-page = "1"> איור 1
איור 1: תכנית של השלבים העיקריים של ייצור חלבון רקומביננטי איזוטופים תיוג. המדרגות עשויים טרנספורמציה חיידקים לייצור חלבונים רקומביננטיים מתוארים כמתואר בסעיף 1 של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: תכנית של השלבים העיקריים של טיהור חלבוני טאו רקומביננטי. המדרגות עשויים תאים חיידקיים תמוגה טיהור חלבונים רקומביננטיים מתוארים כמתואר בסעיף 2 של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר שלנתון זה.

איור 3
איור 3: צעדים כרומטוגרפיה נוזלית של פרוטוקול. (א) חילוף קטיונים חלוק כרומטוגרפיה של תמצית חיידקים המחוממת. את הספיגה ב 280 ננומטר, 260 ננומטר המוליכות מתאימות בהתאמה לקווים מוצקים מקווקוים שחורים קו אדום מקווקו. 12% SDS-PAGE ניתוח של שברים שנאספו מוצג מעל הכרומתוגרמה. (ב) Desalting של חלבון טאו לתוך חיץ מתאים lyophilization. כמות החלבון טאו מטוהרים מוערך מאזור השיא (2,260 מ"ל * מאו) הוא 16 מ"ג של טאו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4 איור 4: 12% SDS-PAGE ניתוח של טאו. ליין 1, סמן משקל מולקולרי; מסלול 2, 10 מיקרוגרם של טאו; מסלול 3, 10 מיקרוגרם של ERK-פוספורילציה טאו. טאו, כמו עקורים אחרים, פועל באופן חריג על SDS-PAGE, לעבר משקל מולקולרי לכאורה של כ -60 kDa במקום הצפוי 46 kDa. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: תכנית של השלבים העיקריים עבור הכנת מדגם NMR, רכישת נתונים ספקטרוסקופיה NMR ועיבוד נתונים. המדרגות עשויים הכנת המדגם NMR לרכישת הנתונים ועיבודם מתוארים כמפורט בסעיף 4 לפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג versio גדולn של נתון זה.

איור 6
איור 6: הגדרת פרמטר p1 לרכישת נתוני תמ"ג. פרמטר זה שונה בין דגימות תלויה בעיקר ריכוז מלח. עקומת nutation סטנדרטית 1 H עבור 80% H 2 O ב D 2 O מוצגת. ספקטרום חד סריקה עם עיכוב מחזור של 30 שניות נאספו זממו אופקי. הדופק (p1) היה נע בין 1 ל -55 μsec μsec בצעדים של 1 μsec. בתאוריה, האות צריך להיות מקסימאלי עבור דופק 90 ° ושווה לאפס את דופק 180 °. עם זאת, בפועל, דעיכת הקרינה גורמת לבעיות האסימטריה בשלב עיוות אשר עושים את זה קשה לקבוע את 90 ° או 180 ° פולסים ישירות. נקודת null השנייה מקבילה משך דופק 360 °. האזור המורחב מראה אות שיורים עבור 360 ° דופק המשמש להגדיר את פרמטר תדירות o1p. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7: עיבוד נתוני תמ"ג. (א) ריקבון אות אינדוקציה חינם במישור הזמן. 1D ספקטרום פרוטון (B) הנובעות טרנספורמציה פורייה של FID מלוח לתוך תחום תדר אבל עם שלב שגוי (PHC0 -206 מעלות). (C) בהדרגה (PHC0 -113 °) ואת הפניה (אות TMSP ב 0 ppm). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"/>
איור 8: 2 ד 1 H, 15 N HSQC ספקטרום של רקומביננטי 15 N-טאו ב 900 MHz. 3,072 ו 416 נקודות נתוני רכישה נרשמו באמצעות רוחב ספקטרום של 14 ו -25 עמודים לדקה ב 1 H (F2) ו -15 N ממדים (F1), בהתאמה. 16 סריקות נרשמו לכל תוספת F1, שמובילה תקופת הניסוי של 4 שעה ו -30 דקות. (א) מדגם טאו באיכות טוב (B) מדגם טאו מראה שפל, כפי שהיא מתגלה על ידי הופעתו של תהודות נוספות באזור מסוים של ספקטרום (גבוה שדה 1 H, שדה נמוך 15 N), כאן התאגרף בכחול. המדגם האחרון הוכן ללא מעכבי פרוטאז. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 9
איור 9: 2 ד 1 H, 15 N HSQC ספקטרום של רקומביננטי 15 N-טאו. (א) unphosphorylated טאו, 600 ספקטרום MHz (B) פוספורילציה טאו, 600 ספקטרום MHz ו- (ג) פוספורילציה טאו, ספקטרום MHz 900. תהודות נוספות באזור מסוים של הספקטרום, כאן התאגרפו באדום, הם נצפו בספקטרום טאו פוספורילציה. תהודות אלו, אשר מתאימות אמיד פרוטון (1 H- 15 N) מתאמים של שאריות pSer ו pThr, הם דמיינו בקלות באזור סביבה של 8.5 עד 9.5 עמודים לדקה עבור 1 H ו- 117 עד 125 ppm 15 N, מחוץ הארי של 1 H, 15 N מתאמים של הספקטרום טאו unphosphorylated. (A ו- B) מתאים ספקטרום רכשו ב 600 MHz, 2,048 ו 256 נקודות נתונים רוחביים ספקטרלי של 14 ו -25 עמודים לדקה נרשמו 1 H (F2) ו -15 N ממדים (F1), בהתאמה.32 סריקות שימשו, ומשך הכולל של הרכישה היתה 2 hr 44 דקות ו (ג) ב 900 MHz, 3,072 ו 416 נקודות נתונים רוחבי ספקטרלי של 14 ו -25 עמודים לדקה נרשמו 1 H (F2) ו -15 N ( F1) ממדים, בהתאמה. 48 סריקות שימשו, ומשך הכולל של הרכישה עמד על כ -6 שעות 37 דקות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 10
איור 10: 3D 1 H, 15 N, 13 ספקטרום C תמ"ג, תחזיות ומטוסים 2D חילוץ. 2,048, 72, ו 256 נקודות נתונים נרשמו 1 H (F3), 15 N (F2), ו -13 C (F1) ממדים, בהתאמה. רוחבי ספקטרלית 14, 25, ו -61 עמודים לדקה, התרכזו 4.7, 119, ו -41 עמודים לדקה ב 1 H,15 N ו- 13 מידות C, בהתאמה. משך הרכישה באמצעות 16 סריקות הוא 4 ימים ו -6 שעות. (א) ייצוג קיוב המתאים הפורה טרנספורמציה נתוני 3D של ספקטרום HNCACB של טאו ERK-פוספורילציה שהושגו ב 600 MHz. הגדוד 2 1 H, 15 N ואת 1 H, 13 מטוסי C מתקבלים על ידי הקרנה של נתוני 3D לאורך 13 C ו -15 N ממד, בהתאמה. עיבוד נתונים וייצוג נעשו באמצעות רכישת NMR ותוכנות עיבוד. (ב) 2D 1 H, 13 מטוס C שחולצו מן הנתונים 3D 1 H, 15 N, 13 C תמ"ג בכל משמרת 15 N הכימי של 121.8 ppm. זום (מימין) מרוכז במשמרת הכימית 1 H של 9.38 ppm מציג את 13 CA ו -13 CB תהודות הן השאריות i (pThr153) ו- i-1 (Ala152). תהודת 13 CB יש כינוי בשל רוחב שלחלון pectral. ייצוג גרפי קטיף שיא בוצעו באמצעות תוכנת ניתוח NMR. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השתמשנו ספקטרוסקופיה NMR לאפיין דגימות טאו שונות enzymatically. ביטוי רקומביננטי והטיהור המתוארת כאן עבור חלבון טאו אדם באורך מלא יכולים לשמש באופן דומה כדי לייצר מוטצית טאו או תחומי טאו. Isotopically חלבון מועשר נדרשת ספקטרוסקופיה NMR, דבר המחייב ביטוי רקומביננטי. זיהוי של אתרי זירחון דורש הקצאת תהודה ו 15 N, 13 C כפליים חלבון הנקרא. בהתחשב בעלות של איזוטופים, תשואה טובה נדרשת בשלב ביטוי רקומביננטי. גלוקוז הוא הגורם המגביל את התפתחות חיידקים במדיום M9 ולכן בסך 13 -glucose C 6 ניתן להגדיל עד 4 גרם לליטר של מדיום הגידול כדי לשפר את התשואה. תוספים של ויטמינים בינוניים MEM מלאה אינם חובה אלא לעזור להמריץ את הצמיחה ולשפר תשואה. בהתחשב בעלות הגבוהה של המדיום שכותרתו המלא, המוצר הזה משמש רק בתור supplemen מדיום גידולt. התפתחות חיידקים איטית במדיום M9. באופן כללי, תרבויות חיידקים באמצעות תקשורת M9 בתוספת 3% בפעם ידם בינונית מלאה של אינדוקציה לאחר כ -4 שעות של דגירה. OD של 600 1.6-1.8 בדרך כלל מתקבל בסוף התרבות. תשואה צפויה של חלבון טאו רקומביננטי הוא כ -15 מ"ג לליטר התרבות חיידקים. שימוש חממה לתכנות מאפשר לתזמן ייצור חלבון בנוחות, אוסף של גלולת החיידקים ובקרה אנליטי של ייצור חלבון בשעות יום עבודה.

ריכוז מדגם חשוב להשיג ספקטרום באיכות טובה. מדגם טאו טיפוסי מספק ספקטרום 2D יכיל 1 מ"ג ב 200 μl (כלומר 100 מיקרומטר) חלבון טאו. עבור ספקטרום 3D, לפחות 200 מיקרומטר 300 μl נדרשים, ובלבד ראש החללית קריוגני משמש. גישה ספקטרומטר גבוהה בתחום, כגון מכשיר 900 MHz השתמשו במחקר זה יספק אות לרעש טוב יותרולהפחית אילוצים על ריכוז מדגם (איור 8). בהתחשב בכך טאו הוא חלבון סדר גדול, ספקטרום NMR שלה מאופיין חפיפת אות ניכרת, ספקטרומטר תמ"ג גבוה שדה גם יהיה הבחירה הטובה ביותר מבחינת רזולוציה (איור 8). עם זאת, התהודות המתאימות לאתרי זירחון נמצאות באזור מובהק של הספקטרום והם קלים לזהות אפילו עם ספקטרומטר 600 MHz (השווה איורים 9 B ו- 9 ג). בנוסף, בשל אופי הסדר שלה, חלבון טאו הוא רגיש proteolysis (8B איורים).

עיקור של מאגרים מומלץ להגביל השפלה טאו. תוספת של מעכבי פרוטאז מדגם NMR מסייעת להגן טאו נגד שפלה בתקופות רכישת נתונים שיכולים להימשך בין שעות עד ימים, תלוי הרצף הדופק. PH נמוך (pH כלומר מתחת 7.0) נדרש באבOID החליפין מהר מדי בין פרוטונים חלבון ופרוטונים מים, מה שמוביל לאותת הרחבה. pH לדוגמא חייב גם להיות נשלט היטב כדי להבטיח שחזור של הספקטרום. ואכן, מאז ערכי pKa של pSer ו pThr קרובים החומציות האופטימלית עבור ספקטרוסקופיה NMR, משמרות כימיות של שאריות פוספורילציה רגישות מאוד לשינויי pH. התאמת ה- pH של המדגם NMR יכול להתבצע ישירות באמצעות מטר pH עם אלקטרודה מיקרו pH, המותאמים בנפחים קטנים. טאו הוא חלבון מסיס ואינו לצבור בתנאים סטנדרטיים. תוספת של polyanions, כגון סולפט הפרין, דגירה על 37 מעלות צלזיוס יכולה ליזום צבירה בדגימות טאו. במקרה זה, בהתחשב באופי מוצק של אגרגטים, רוב תהודות בספקטרום התמ"ג המתאים להרחיב מעבר ליכולת הגילוי. אפילו דגימות טאו פוספורילציה לא המצרפי בתנאים המתוארים כאן לרכישת נתוני תמ"ג.

בהשוואה לניתוח נוגדן, NMR מספק oנוף verall של PTMs. ספקטרומטריית מסה יכולה לשמש גם כדי לזהות את דפוס זירחון של מדגם חלבון. תיוג איזוטופי אין צורך עבור טכניקה זו, וכמויות מדגמות הנדרשות הן הרבה יותר קטנות. עם זאת, אפיון של חלבון עם phosphorylations מרובה, כגון טאו, נותר מאתגר. phosphorylations סמוך יפיק פפטידים isobaric באסטרטגיות מלמטה למעלה הזדהות. הזדהות מלאה אז צריך רצף MS / MS של פפטידים מתקבל על ידי proteolysis המדגם. יתרון של תמ"ג מורכב באופי כמותית המהותי של הטכניקה. עוצמת אות תמ"ג ניתן לקשר את הסכום של ההווה הכימי הקבוצה ב אתר ספציפי. לכן אנו יכולים להגדיר את שיעור השינוי כימי בכל אתר. רוב ההתקדמות האחרונה ביישומי MS אולם הראתה כי ניתוח MS של זירחון המרובה טאו הוא 24 ריאלי, אפילו באופן כמותי לאחר נורמליזציה נכונה 25.

כאן, הצגנו זירחון טאו ידי ERK2 מופעל, אבל המתודולוגיה יכול לשמש זירחון עם קינאזות אחרות גם כן 6,7,26 - 28. ניסויי קינטי יכולים להתבצע, אשר יכול לעזור להגדיר סגולי קינאז כלפי מצע חלבון 28 - 31. מחקרים זירחון אינם מוגבלים קינאזות רקומביננטי, ואת פעילות קינאז של תמציות תאים או רקמות ניתן לנתח 6,32,28. התפתחות מעניינת היא השימוש NMR בתוך התאים ללמוד שינויים באתרו 33,34. לעומת זאת, התמ"ג הוא גם היטב מותאם לטפל הספציפיות phosphatase, כפי שהוכח על ידי לימוד dephosphorylation של טאו פוספורילציה ידי phosphatase PP2A 35. ספקטרוסקופיה NMR יכולה להיות מיושמת על האפיון של מעכבי קינאז על ידי השוואת פרופיל זירחון של מצע חלבון ספקטרום 2D בנוכחותו של השנינות המתחמת המעכבh הספקטרום הוציא מניסוי מלא 6.

האינטרס של באמצעות ספקטרוסקופיית NMR, לעומת טכניקות MS הרגישות יותר, מתגורר בטווח הרחב של יישומי ניצול הפרוטוקול המתואר כאן, ולא על יכולת אנליטית שלה לבד. היא הוכיחה חיונית כדי לזהות אתרי זרחון כדי להיות מסוגל לקשר phosphorylations הספציפי עם שינויים מבניים או תפקודיים כי נחקרו בעיקר באמצעות NMR. ספקטרוסקופיה NMR של דגימות טאו פוספורילציה מאפשרת לחקור את ההשפעה המבנית של זירחון משני מבנים מהשניים המקומיים חולפים על התארגנות העולמית של ההרכב הדינמי מהונדס טאו 36,37. היבטים פונקציונליים כוללים ההסדרה היא האינטראקציה של טאו עם שותפי חלבון 7,38,39 ומקבצים על ידי טאו זירחון 8. מדגם טאו פוספורילציה המאופיין תמ"ג ניתן להשתמש כדי להמשיך לפענח אינטראקציות phospho תלוי עבורלמשל עם 14-3-3 חלבונים 40, ואינטראקציה בין חלבונים מהונדסים מעכבי 41,42. NMR מאפשר הגדרה של אתר אינטראקציה (ים) ברמת השאריות, ואת התלות של אינטראקציה זו על זירחון. בנוסף, תמ"ג ספקטרוסקופיה של טאו פוספורילציה היא מתודולוגיה מפתח לאפיין את ציס פרולין: PIN1 איזומראז טראנס, אנזים phospho התלוי חשוב המעורבים בויסות טאו 43 - 45. בנוסף, ניתוח זירחון על ידי התמ"ג ניתן ליישם לא רק עקורים אלא גם ל -46 חלבונים כדוריים. לבסוף, סוגים אחרים של PTMs טאו כגון 22,40,41 acetylations ניתן ללמוד על ידי התמ"ג. הפרוטוקולים המתוארים כאן התגלו כבעלי תפקיד משמעותיים כדי להבין טוב יותר את הרגולציה התפקודית מבנית של טאו בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET15B recombinant T7 expression plasmid Novagen 69257 Keep at -20 °C
BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria New England Biolabs C2527I Keep at -80 °C
Autoclaved LB Broth, Lennox  DIFCO 240210 Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100x Sigma 58970C Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder Sigma 608297 Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl Sigma 299251 Isotope
13C6-Glucose Sigma 389374 Isotope
Protease inhibitor tablets  Roche 5056489001 Keep at 4 °C
1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C
DNaseI EUROMEDEX 1307 Keep at -20 °C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) AVESTIN Lysis is realized at 4 °C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker Pierce 266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged Sigma M8822 Keep at -80 °C
AKTÄ Pure chromatography system GE Healthcare FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column) GE Healthcare 17-5156-01 Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting GE Healthcare 17-5087-01 Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25 GE Healthcare 28-9180-08 Protein Desalting column
Tris D11, 97% D Cortecnet CD4035P5 Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe)  Euriso-top BMS-005B NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit Cortecnet 2910000 Pipetting
Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1 Bruker Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114 UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) NMR data Analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
  2. Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer's disease brain. J. Biol. Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
  3. Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268 (32), 24374-24384 (1993).
  4. Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging. 16 (3), 409-417 (1995).
  5. Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482 (2011).
  6. Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128 (11), 3575-3583 (2006).
  7. Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23 (4), 1146-1152 (2009).
  8. Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291 (14), 7742-7753 (2016).
  9. Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133 (40), 15842-15845 (2011).
  10. Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249 (4964), 64-67 (1990).
  11. Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343 (6259), 651-653 (1990).
  12. Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (14), 6142-6146 (1991).
  13. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  14. Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56 (1), 125-135 (1987).
  15. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  17. Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15 (3), 203-206 (1999).
  18. Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5 (1), 67-81 (1995).
  19. Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132 (51), 18000-18003 (2010).
  20. Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5 (1), 73-78 (2004).
  21. Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5 (12), 1639-1646 (2004).
  22. Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7 (2), e34 (2009).
  23. Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7 (4), e34679 (2012).
  24. Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18 (8), 1183-1189 (2015).
  25. Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88 (7), 3704-3714 (2016).
  26. Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285 (43), 33435-33444 (2010).
  27. Theillet, F. -X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
  28. Qi, H., Cantrelle, F. -X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  29. Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
  30. Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137 (20), 6468-6471 (2015).
  31. Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
  32. Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
  33. Bodart, J. -F., Wieruszeski, J. -M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192 (2), 252-257 (2008).
  34. Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
  35. Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer's disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521 (2011).
  36. Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80 (2), 454-462 (2012).
  37. Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23 (8), 1448-1458 (2015).
  38. Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412 (4), 743-746 (2011).
  39. Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1's SH3 domain and Tau's proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3 (1), (2015).
  40. Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29 (10), 4133-4144 (2015).
  41. Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48 (15), 4815-4823 (2005).
  42. Milroy, L. -G., Bartel, M., et al. Stabilizer-Guided Inhibition of Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54 (52), 15720-15724 (2015).
  43. Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochemistry. 43 (7), 2032-2040 (2004).
  44. Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7 (3), 179-194 (2006).
  45. Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274 (20), 5211-5222 (2007).
  46. Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
  47. Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16 (8), 414-423 (2010).
  48. Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochemistry. 53 (18), 3020-3032 (2014).

Tags

ביוכימיה גיליון 118 ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית תיוג איזוטופי חלבון סדר מיסודם חלבון רקומביננטי טיהור חלבונים זרחון חלבון רכישת נתוני תמ"ג הקצאת תהודה.
ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Danis, C., Despres, C., Bessa, L.… More

Danis, C., Despres, C., Bessa, L. M., Malki, I., Merzougui, H., Huvent, I., Qi, H., Lippens, G., Cantrelle, F. X., Schneider, R., Hanoulle, X., Smet-Nocca, C., Landrieu, I. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (118), e55001, doi:10.3791/55001 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter