Introduction
Uno de los principales retos de la atención sanitaria en el siglo 21 son enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA). Tau es una proteína asociada a los microtúbulos que estimula la formación de microtúbulos (MT). Tau está igualmente implicado en varias enfermedades neurodegenerativas, llamados tauopatías, de los cuales el más conocido es AD. En estos trastornos, auto-tau agregados en filamentos helicoidales emparejados (PHFs) y se encuentra modificada por muchos residuos de acuerdo con las modificaciones posteriores a la traducción (PTMs) como la fosforilación 1. La fosforilación de la proteína tau está implicada tanto en la regulación de su función fisiológica de estabilización MT y la pérdida patológica de función que caracteriza las neuronas AD.
Además, la proteína Tau, cuando se integra en PHFs en las neuronas enfermas, es invariablemente hyperphosphorylated 2. A diferencia de tau normal que contiene 2-3 grupos fosfato, la Tau hiperfosforilada en PHFs contiene 5-9 Phosphatgrupos e 3. Hiperfosforilación de Tau corresponde tanto a un aumento de la estequiometría en algunos sitios y a la fosforilación de los sitios adicionales que se denominan sitios patológicos de fosforilación. Sin embargo, existe superposición entre los patrones normales de un adulto de la fosforilación de AD y, a pesar de las diferencias cuantitativas en el nivel 4. Cómo algunos eventos de fosforilación función de influencia y la disfunción del Tau sigue siendo desconocida. Nuestro objetivo es descifrar la regulación Tau por PTM a nivel molecular.
Para profundizar en la comprensión de los aspectos moleculares de Tau, tenemos que hacer frente a los desafíos técnicos. En primer lugar, Tau es una proteína intrínsecamente desordenados (IDP) cuando se aíslan en solución. Tales proteínas carecen de estructura tridimensional bien definido en condiciones fisiológicas particulares y requieren métodos biofísicos para estudiar su función (s) y las propiedades estructurales. Tau es un paradigma para la clase creciente de desplazados internos, a menudo se encuentran asociados conpatologías tales como enfermedades neurodegenerativas, por lo tanto aumentando el interés de comprender los parámetros moleculares que subyacen a sus funciones. En segundo lugar, la caracterización de la fosforilación de Tau es un reto analítico, con 80 sitios de fosforilación potenciales a lo largo de la secuencia de la isoforma más larga de Tau 441 amino-ácido. Un número de anticuerpos Se han desarrollado contra epítopos fosforilados de Tau y se utilizan para la detección de Tau patológico en neuronas o tejido cerebral. fosforilación eventos pueden tener lugar en al menos 20 lugares elegidos por las quinasas dirigidas por prolina, la mayoría de ellos en las proximidades de la región rica en prolina. El cualitativa (qué sitios?) Y cuantitativo (lo estequiometría?) La caracterización es difícil, incluso por las más recientes técnicas MS 5.
espectroscopía de RMN se puede utilizar para investigar proteínas desordenadas que son altamente sistemas dinámicos constituidos de conjuntos de confórmeros. espectroscopía de RMN de alta resolución fue aplied para investigar la estructura y función de la proteína Tau. Además, la complejidad del perfil de fosforilación de Tau condujo al desarrollo de herramientas moleculares y nuevos métodos de análisis utilizando RMN para la identificación de sitios de fosforilación de 6 - 8. NMR como un método de análisis permite la identificación de sitios de fosforilación de tau de una manera global, la visualización de todas las modificaciones de sitio único en un único experimento, y la cuantificación de la extensión de la incorporación de fosfato. Este punto es esencial, ya que aunque los estudios de fosforilación de Tau abundan en la literatura, la mayoría de ellos se han realizado con anticuerpos, dejando un alto grado de incertidumbre sobre el perfil completo de fosforilación y por lo tanto el verdadero impacto de los eventos de fosforilación individuales. quinasas recombinantes incluyendo PKA, 3β-glucógeno sintasa quinasa (GSK3), dependiente de ciclina quinasa 2 / ciclina A (CDK2 / CycA), la quinasa dependiente de ciclina 5 (CDK5) / p25 actoproteína ivator, quinasa 2 extracelular de señal regulada (ERK2) y microtúbulos afinidad de regulación de quinasa (MARK), que muestran actividad de fosforilación hacia Tau, se pueden preparar en una forma activa. Además, los mutantes Tau que permiten la generación de isoformas específicas de la proteína Tau con patrones de fosforilación bien caracterizados se utilizan para descifrar el código de la fosforilación de Tau. Espectroscopía de RMN se utiliza entonces para caracterizar muestras de Tau enzimáticamente modificados 6 - 8. Aunque la fosforilación in vitro de Tau es más difícil que pseudo-fosforilación como por mutación de seleccionado Ser / Thr en residuos de ácido glutámico (Glu), este enfoque tiene sus méritos. De hecho, ni los de impacto ni de interacción parámetros estructurales de la fosforilación siempre se pueden imitar por los ácidos glutámico. Un ejemplo es el motivo a su vez observado alrededor de fosfoserina 202 (pSer202) / phosphothreonine 205 (pThr205), que no se reproduce con mutaciones Glu 9.
en la fosforilación in vitro por ERK2 quinasa recombinante. ERK2 se activa por la fosforilación por la proteína quinasa activada por mitógeno / ERK quinasa (MEK) 10-12. Además de la preparación de proteína modificada, marcado isotópicamente Tau, la estrategia NMR utilizado para la identificación de la PTM se describe.
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Protocol
1. Producción de 15 N, 13 C-Tau (Figura 1)
- Transformar pET15b-Tau T7 recombinante plásmido de expresión de 13,14 en BL21 (DE3) células bacterianas competentes de Escherichia coli 15.
NOTA: el ADNc que codifica para la más larga (441 residuos de aminoácidos) isoforma Tau se clona entre los sitios de restricción NcoI y XhoI en el plásmido pET15b.- Mezclar suavemente 50 l de BL21 competente (DE3), formando 1-5 x 10 7 colonias por g de ADN plásmido, con 100 ng de ADN plasmídico en un tubo de plástico 1,5 ml.
NOTA: codón de uso optimizado cepas bacterianas para la expresión de ADNc eucariota no son esenciales para producir Tau humano. - Colocar la mezcla de células en hielo durante 30 min y después de choque térmico de 10 segundos a 42 ° C. Coloque el tubo de nuevo en hielo durante 5 minutos y añadir 1 ml de la temperatura ambiente LB (Luria-Bertani). Incubar la suspensión bacteriana a 37 ° C durante 30 min bajo suaveagitación.
- Mezclar suavemente 50 l de BL21 competente (DE3), formando 1-5 x 10 7 colonias por g de ADN plásmido, con 100 ng de ADN plasmídico en un tubo de plástico 1,5 ml.
- Extender el uso de un asa de siembra de 100 l de suspensión de células uniformemente sobre una placa de agar de medio LB que contiene 100 mg / ml de antibiótico ampicilina.
- Incubar la placa de selección durante 15 horas a 37 ° C.
- Mantenga la placa de selección a 4 ° C hasta que proceder a la etapa de cultivo, para un máximo de 2 semanas aproximadamente.
NOTA: un stock de glicerol de cultivo bacteriano (50% de glicerol), almacenados a -80 ° C, se puede preparar para iniciar el cultivo en una etapa posterior. - Añadir 1 ml 1 M MgSO 4, 1 ml mM CaCl 2 100, 10 ml 100x MEM vitamina complemento, 1 ml 100 mg / ml de ampicilina a 1 L de sales M9 autoclave (6 g Na 2 HPO 4, 3 g KH 2 PO 4 , 0,5 g de NaCl).
NOTA: Un precipitado blanco se forma después de la adición de la solución de CaCl 2 a las sales M9 que se disipa rápidamente. - Solubilizar 300 mg de N 15, C-13 medio completo, 1 g de 15NH 4 Cl y 2 g de 13 C 6 -glucosa en 10 ml de medio M9. Filtros de esterilizar la solución isótopo usando un filtro de 0,2 micras, directamente en el medio M9.
- Suspender el uso de una inoculación de bucle una colonia de pET15b-Tau transformado bacterias de la placa de selección en 20 ml de medio LB suplementado con 100 mg / ml de ampicilina.
- Incubar el medio inoculado a 37 ° C durante aproximadamente 6 horas.
- Medir la densidad óptica a 600 nm (OD 600) en 1 ml de una dilución de diez veces de cultivo bacteriano en una cubeta de espectrómetro de plástico.
NOTA: La turbidez del cultivo bacteriano correspondiente a OD 600 de 3,0 a 4,0 indica que se alcanza la fase de crecimiento de saturación. - Añadir 20 ml del cultivo LB saturado a 1 L de medio de crecimiento M9 suplementado con ampicilina (100 mg concentración final / ml), en 2 de plástico L matraz Erlenmeyer de cultura desconcertado.
- Colocar el frasco de cultivo en una incubadora programable ajustado a 10 °C y 50 rpm. Programar la incubadora para cambiar a 200 rpm y 37 ° C temprano en la mañana del día siguiente.
- Medida OD 600 en 1 ml de cultivo bacteriano en una cubeta de espectrómetro de plástico. Añadir 400 l de 1 M de IPTG (isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido) solución madre (mantenido a -20 ° C) cuando OD 600 alcanza un valor de aproximadamente 1,0 para inducir la expresión de la proteína tau recombinante.
- Continuar la incubación a 37 ° C durante un 3 horas más. Recoger las células bacterianas por centrifugación a 5000 xg durante 20 min.
- Congelar el sedimento bacteriano a -20 ° C. Mantener congelado hasta la etapa de purificación, por un período prolongado si es necesario.
2. Purificación de 15 N, 13 C-Tau (Figura 2)
- Autoclave de intercambio catiónico (CEX) amortiguadores de purificación a 121 ° C bajo 15 psi durante 20 min. tampones se almacenan a 4 ° C.
- Descongelar el pellet de células bacterianas y resuspender a fondo en 45 mlde extracción CEX Un tampón (50 mM de tampón NaPi pH 6,5, EDTA 1 mM) recién suplementado con 1x de cóctel inhibidor de la proteasa (1 comprimido) y DNAseI (2.000 unidades).
- Romper las células bacterianas usando un homogeneizador de alta presión a 20.000 psi. 3-4 pases son necesarios. Centrifugar a 20.000 xg durante 40 min para eliminar el material insoluble.
- Calentar el extracto de células bacterianas durante 15 minutos a 75 ° C usando un baño de agua.
NOTA: se observa un precipitado blanco después de unos pocos minutos. - Centrifugar a 15.000 xg durante 20 min y mantener el sobrenadante que contiene la proteína Tau estable al calor.
- Almacenar a -20 ° C hasta la siguiente etapa de purificación, si es necesario.
- Realizar una cromatografía de intercambio catiónico sobre una resina CEX fuerte embalado como una columna de 5 ml cama usando una cromatografía líquida rápida de proteínas del sistema (FPLC) (Figura 3 A).
- Ajuste del caudal de 2,5 ml / min.
- Equilibrar la columna en tampón A CEX
- Cargar el climatizada- 60-70 mlextracto que contiene Tau usando una bomba de muestra, o, alternativamente, la bomba A, en función del sistema. Recoger el flujo a través de análisis para verificar que la proteína Tau es vinculante de manera eficiente a la resina (ver 2.8).
- Lavar la resina con CEX Un tampón hasta que la absorbancia a 280 nm es de nuevo a valor de línea base.
- Eluir Tau de la columna usando un gradiente de NaCl de tres pasos obtenido por aumento gradual de tampón CEX B (CEX un tampón con 1 M NaCl). Programa de la FPLC de la siguiente manera: primero el paso del gradiente a un tampón de 25% CEX B en 10 volúmenes de columna (CV) para llegar a NaCl 250 mM, segundo paso a un tampón de 50% CEX B en 5 CV para llegar a NaCl 500 mM, y tercera etapa al 100% de tampón B en CEX 2 CV para llegar a 1 M de NaCl. Recoger fracciones de 1,5 ml durante los pasos de elución.
- Analizar 10 l de las fracciones recogidas durante la etapa de elución mediante SDS-PAGE (12% de gel de SDS-acrilamida) y tinción con Coomassie (Figura 3 A) 16. Compruebe la etapa de carga en la columna a su vez por Analyzing 10 l de el flujo a través.
- Elija las fracciones que contienen Tau y agrupar estas fracciones para el siguiente paso.
- Realizar un intercambio de tampón en fracciones que contienen Tau agrupados (Figura 3 B).
- Equilibrar una columna de desalación de 53 ml G25 resina de lecho compacto (26 x 10 cm) en mM de bicarbonato de amonio 50 (tampón volátil) utilizando un sistema de FPLC.
- Set velocidad de flujo a 5 ml / min. Se inyecta la muestra de Tau en la columna a través de un bucle de inyección de 5 ml. Recoger fracciones correspondientes al pico de absorción a 280 nm.
- Repetir la inyección 3-4 veces, dependiendo del volumen de la piscina inicial CEX.
- Calcular la cantidad de proteína Tau purificada utilizando el área del pico del cromatograma a 280 nm (1 mg de Tau corresponde a 140 mUA * ml).
NOTA: El coeficiente de extinción de la proteína Tau a 280 nm es 7,550 M -1 cm -1. Tau no contiene residuos de Trp. - La piscina todas las fracciones Tau.
- aliquot la muestra en tubos que contenían el equivalente de 1 a 5 mg de Tau. Elija estos tubos de modo que el volumen de la solución es pequeño comparado con el volumen del tubo (por ejemplo, 5 ml de la solución en un tubo de 50 ml).
- Perforar agujeros en las tapas de los tubos utilizando una aguja. Tau congelar las muestras a -80 ° C.
- muestras Liofilizar Tau. proteína liofilizada Tau puede mantenerse a -20 ° C durante largos períodos de tiempo.
3. En Vitro La fosforilación de 15 N-Tau
- Disolver 5 mg de Tau liofilizado en 500 l de tampón de fosforilación (Hepes 50 mM · KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, NaCl 50 mM).
- Añadir ATP 2,5 mM (25 l de solución madre 100 mM mantuvieron a -20 ° C), DTT 1 mM (1 l de solución madre de M 1 se mantuvieron a -20 ° C), mM EGTA 1 (2 l de una acción 0,5 M solución), 1x cóctel inhibidor de proteasa (25 l de una acción 40x obtenida disolviendo 1 comprimido en tampón de 1 ml fosforilación) y 181; M activado su-ERK2 (250 l en tampón de conservación de 10 mM Hepes, pH 7,3, DTT 1 mM, 5 mM MgCl2, NaCl 100 mM y glicerol al 10%, almacenado a -80 ° C) en un volumen total de la muestra de 1 ml.
NOTA: El activado su-ERK2 se puede preparar en la casa 5,8 por fosforilación con la quinasa MEK. - Incubar 3 horas a 37 ° C.
- Calentar la muestra a 75 ° C durante 15 min para inactivar ERK quinasa.
- Centrifugar a 20.000 xg durante 15 min. Recoger y guardar el sobrenadante.
- Desalar la muestra de proteína en 50 mM de bicarbonato de amonio usando una columna de 3,45 ml G25 resina de lecho empaquetado (1,3 x 2,6 cm), que es adecuado para una muestra de 1 ml.
- Ejecutar un 12% SDS-PAGE 16 con 2,5 l de la muestra de proteína para comprobar tanto su integridad y la fosforilación eficiente (Figura 4).
- Liofilizar la muestra Tau fosforilada. Guarde el polvo a -20 ° C.
4. La adquisición de espectros de RMN (Figura 5)
- Solubilizar 4 mg de liofilizado 15 N, 13 C ERK fosforilada-Tau en 400 l de tampón RMN (NaPi 50 mM o 50 mM Tris- deuterados d11 .CL, pH 6,5, NaCl 30 mM, EDTA 2,5 mM y DTT 1 mM).
- Añadir 5% D 2 O para el bloqueo de campo del espectrómetro de RMN y TMSP 1 mM (3- (trimetilsilil) sal de sodio 4 ácido propiónico-2,2,3,3-d)) como referencia de señal de RMN interna. Añadir 10 l de una solución social de 40x completo cóctel inhibidor de proteasa.
- Transferir la muestra en un tubo de RMN de 5 mm usando una jeringa electrónica con una aguja larga o una pipeta Pasteur. Cerrar el tubo de RMN utilizando el émbolo. Eliminar cualquier burbuja de aire atrapada entre el émbolo y el líquido por los movimientos de émbolo.
- Se coloca el tubo de RMN en una ruleta. Ajuste su posición vertical en la ruleta con el calibre adecuado para la cabeza de la sonda de RMN utilizado, de tal manera que la mayor parte de la solución de muestra habrá dentro de la bobina RMN.
- Iniciar el flujo de aire: haga clic en Levanton la ventana de sistema de control de imán. Colocar con cuidado el spinner con el tubo en el flujo de aire en la parte superior de la cavidad del imán. Detener el flujo de aire (click ascensor) y dejar que el tubo de descender en su lugar dentro de la cabeza de la sonda en el imán.
- Ajuste la temperatura a 25 ° C (298 K).
- Utilizar la sintonización semiautomático y la congruencia de la cabeza de la sonda para optimizar la transmisión de energía. Escriba ATMM en la línea de comandos.
- Bloquear la frecuencia del espectrómetro utilizando la señal de D2O de la muestra, en el canal de deuterio. Haga clic en la ventana de bloqueo de sistema de control de imán.
- Iniciar el procedimiento de calce para optimizar la homogeneidad del campo magnético en la posición de la muestra. Escriba topshim interfaz gráfica de usuario en la línea de comando para abrir la ventana de cuña. Haga clic en Inicio en la ventana de cuña. Comprobar el valor de la variación estándar B0 residual para verificar que las cuñas son óptimas (menos de 2 Hz es bueno).
- Calibrar el parámetro p1 (longitud de un protónpulso de radiofrecuencia en microsegundos), que es necesario para obtener una rotación de giros de protones 90 °. Objetivo para el impulso de 360 ° utilizando un espectro 1D de protones del agua (Figura 6).
- Ajustar la frecuencia de desplazamiento estableciendo el parámetro o1 (en Hz) a la frecuencia de protones del agua en el espectro 1D (Figura 6).
- Iniciar la adquisición de un espectro de protón 1D (secuencia de impulsos con la secuencia de esclusa para la supresión de la señal de agua, por ejemplo zggpw5) para verificar las señales de la muestra (Figura 7). Adaptar el número de exploraciones a la concentración relativa de proteínas. Zg escriba en la línea de comandos para iniciar la adquisición.
- Configurar parámetros adicionales para la adquisición de un 2D [1 H, 15 N] espectro HSQC (pulso secuencia hsqcetfpf3gpsi, las Figuras 8-9).
- Para un 15 N, 13 C etiquetado de la muestra, desacoplar 13 C durante la evolución indirecta 15N.
NOTA: Adaptar el número de puntos de datos de adquisición al campo espectrómetro para mantener un número similar de Hz por punto y limitar los tiempos de desacoplamiento: utilizar 3.072 puntos a 900 MHz y 2.048 puntos a 600 MHz, en la dimensión 1H. - Optimizar los parámetros adicionales en las secuencias de pulsos, lo que corresponde a los retrasos, longitudes de pulso, que se compensan las frecuencias, niveles de potencia. Tipo obre la base de la línea de comandos para visualizar todos los parámetros relevantes para el experimento.
5. Identificación de los sitios de fosforilación
- Los espectros de proceso utilizando software de adquisición y procesamiento de RMN.
- Realizar una transformación de Fourier de los datos (Figura 7). Tipo de pies para un espectro 1D, XFB para un espectro 2D o ft3d para un espectro 3D, en la línea de comandos.
- Fase y la referencia de todos los espectros (Figura 7C) usando las ventanas interactivas.
- Identificar las resonancias de interés en el HSQC 2D potencialmente correspondiente a los residuos fosforilados Ser y Thr (Figura 9, la caja roja).
- Planos del extracto (es decir, 2D 1 H- 13 C espectros) a partir deel espectro C 3D 1 H-15 N 13 N 15 utilizando los desplazamientos químicos de las resonancias de interés en el 2D. Utilice el cursor de dimensión 2 (W2) para elegir la frecuencia de 15 N correspondiente al plano (W1-W3) para ser visualizado (Figura 10B).
- Recoger las frecuencias de resonancia de 'CA' y 13 núcleos 'CB' C de la 'i' y residuos 'i-1' (conjunto más débil de las señales en comparación con los del residuo i) para cada [1 H, 15 N] resonancia de interés en el espectro HNCACB 3D haciendo clic en la resonancia, en el menú del modo de puntero encontrar / agregar pico, para añadir el valor del desplazamiento químico en un archivo de lista de pico.
- Identificar el tipo de residuo IR, pSer o pThr, mediante la comparación de los desplazamientos químicos en el pico de la lista de valores conocidos de CA y CB desplazamientos químicos de pSer y pThr 17.
- Identificar la presencia de un residuo Pro en la posición 1 + i por una característica adicional de 2 ppm de desplazamiento of el valor del desplazamiento químico CA 18.
- Comparación de los valores de desplazamiento químico de las resonancias de CA y CB que corresponde al residuo i-1 a una tabla de los desplazamientos químicos previstos para Tau residuos de aminoácidos 19 para identificar la naturaleza del residuo en la posición i-1.
- Recoger las frecuencias de resonancia de 15 N núcleos de la "i" y residuos 'I-1' para cada una de resonancia [1 H, 15 N] de interés en el espectro HNCANNH.
- Compara los 15 N valores de desplazamiento químico a la asignación de desplazamiento químico de la proteína Tau 20 - 23.
- Comparación de los dipéptidos identificados con la secuencia de Tau para definir la asignación específica de la secuencia.
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Representative Results
La figura 3A muestra un pico de absorción principal a 280 nm observados durante el gradiente de elución. Este pico corresponde a la proteína Tau purificada como se ve en el gel de acrilamida por encima del cromatograma. La Figura 3B muestra un pico de absorción bien separados a 280 nm y un pico de conductividad, asegurándose de que el desalado de la proteína es eficiente. La Figura 4 muestra la proteína gel de cambio observado por análisis de SDS-PAGE 16 característico de la fosforilación de proteínas múltiples (comparar carriles 2 y 3). La Figura 6 muestra una serie de protones (1 H) los espectros de 1D con el aumento de longitudes de pulso (en microsegundos). Para configurar la longitud del pulso que rotará 1 H giro magnetización por 90 °, un pulso que corresponde a una rotación de 360 ° se utiliza en la práctica, ya que es más fácil de calibrar, reduciendo al mínimo la señal. La señal de los protones del agua es nulo cuando la longitud 360 ° de impulsos se define de manera adecuada. El valor correspondiente a un 36076; la rotación se divide por 4. p1 en este experimento es 10,5 microsegundos. Región ampliada: La frecuencia de la señal residual se usa para definir el parámetro O1P (desplazamiento de frecuencia para 1 H). Figura 7 A. muestra una descomposición libre de la inducción (FID), visualizado para asegurarse de que se detecte una señal de RMN. Figura 7B. muestra un espectro H 1D 1 con una fase incorrecta, como se ve por las resonancias que aparecen picos como asimétricos. La Figura 7C muestra un espectro H 1D 1 con una buena relación señal a ruido, lo que indica que los parámetros básicos de adquisición se establecen correctamente y una señal de la muestra de proteína se pueden detectar. La Figura 8 muestra 2D 1 H, 15 N HSQC espectros de recombinante 15 N-Tau en 900 MHz; La Figura 8A con una buena sensibilidad y resolución y la Figura 8B. con la detección de la proteolisis en la muestra, como se ve por la aparición de pe adicionalaks en el (caja azul) del espectro. La figura 9 muestra 2D 1 H, 15 N HSQC espectros de recombinante 15 N-Tau Figura 9A a 600 MHz, con una buena sensibilidad pero menor resolución en comparación con la Figura 8A. La figura 9B a 600 MHz, muestra aparición de picos adicionales en el espectro correspondiente a los residuos fosforilados (recuadro rojo). Figura 9C a 900 MHz, muestra picos en el espectro correspondiente a los residuos fosforilados (recuadro rojo). La resolución es mejor que en la Figura 9B. La Figura 10 A muestra las proyecciones de espectro 3D NMR utilizado para evaluar un experimento exitoso. La figura 10B muestra un avión C 1 H-13 extraído de la 1 H-15 N- espectro de 13C 3D con buena intensidad de señal que permite detectar señales de 13 C de ambos I e I-1 residuos.
Figura 1: Esquema de las etapas principales de la producción de proteína recombinante y el etiquetado isotópico. A pasos de la transformación bacterias para la producción de proteínas recombinantes se describen como se describe en el párrafo 1 del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema de las principales etapas de la purificación de proteínas Tau recombinante. A pasos de células bacterianas de lisis para la purificación de proteínas recombinantes se describe como se describe en el párrafo 2 del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande deesta figura.
Figura 3: etapas de cromatografía de líquidos de protocolo. Cromatografía de fraccionamiento (A) de intercambio catiónico del extracto bacteriano climatizada. La absorbancia a 280 nm, 260 nm y la conductividad corresponden respectivamente a las líneas negras continuas y discontinuas y línea roja punteada. 12% Análisis SDS-PAGE de las fracciones recogidas se muestra por encima del cromatograma. (B) La desalación de la proteína Tau en un tampón adecuado para la liofilización. La cantidad de proteína Tau purificada estimado a partir del área de pico (2.260 mUA * ml) es de 16 mg de Tau. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: análisis de SDS-PAGE 12% de Tau. Carril 1, marcador de peso molecular; carril 2, 10 g de Tau; carril 3, 10 g de Tau fosforilada-ERK. Tau, como otros desplazados internos, se ejecuta de una manera anómala en SDS-PAGE, con un peso molecular aparente de aproximadamente 60 kDa en lugar del esperado 46 kDa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Esquema de los principales pasos para la preparación de la muestra de RMN, espectroscopía de RMN de adquisición de datos y procesamiento de datos. A pasos de preparación de la muestra de RMN para la adquisición y procesamiento de datos se describen como se describe en el párrafo 4 del protocolo. Haga clic aquí para ver una versio más granden de esta figura.
Figura 6: Puesta en marcha del parámetro p1 para la adquisición de los datos de RMN. Este parámetro se diferencia entre las muestras y depende principalmente de la concentración de sal. Se muestra una curva de nutación 1 H estándar para el 80% de H2O en D2O. Los espectros de un solo escaneo con un retraso de reciclado de 30 segundos se recogieron y se representa horizontalmente. El pulso (p1) se varió de 1 a 55 microsegundos microsegundos en pasos de 1 microsegundos. En teoría, la señal debe ser máxima para un impulso de 90 ° y igual a cero para un impulso de 180 °. Sin embargo, en la práctica, la amortiguación radiación causa de asimetría y distorsión de fase problemas que hacen que sea difícil determinar los 90 ° o 180 ° pulsos directamente. El segundo punto nulo corresponde a una duración de pulso de 360 °. La región ampliada muestra una señal residual para un giro de 360 ° pulso que se utiliza para definir el parámetro de frecuencia O1P. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: procesamiento de los datos de RMN. (A) la señal de decadencia de inducción libre en el dominio del tiempo. Espectros 1D de protones (B) resultante de la transformación de Fourier de la FID desde el panel A en el dominio de la frecuencia, pero con fase incorrecta (PhC0 -206 °). Referencia (señal TMSP a 0 ppm) (C) por etapas (PhC0 -113 °) y. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 8: 2D 1 H, 15 N HSQC espectros de recombinante 15 N-Tau en 900 MHz. 3.072 y 416 puntos de datos de adquisición se registraron utilizando anchuras espectrales de 14 y 25 ppm en el 1H (F2) y 15 N dimensiones (F1), respectivamente. 16 exploraciones fueron registrados por incremento F1, lo que lleva a una duración del experimento de 4 hr 30 min. (A) muestra de buena calidad Tau (B) muestra Tau que muestra la degradación según lo revelado por la aparición de resonancias adicionales en una región particular del espectro (de alto campo 1 H, 15 N de campo bajo), aquí en caja en azul. Esta última muestra se preparó sin inhibidores de proteasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: 2D 1 H, 15 N HSQC espectros de recombinante 15 N-Tau. (A) no fosforilada Tau, 600 MHz de espectro (B) fosforilada Tau, 600 MHz de espectro y (C) fosforilada Tau, 900 MHz de espectro. resonancias adicionales en una región particular del espectro, aquí en caja en rojo, se observaron en los espectros Tau fosforilada. Estas resonancias, que corresponden a protones de amida (1 H- 15 N) correlaciones de residuos pSer y PTHR, se visualizan fácilmente en la región de alrededor de 8.5 hasta 9.5 ppm para 1 H y 117 a 125 ppm de 15 N, fuera de la mayor parte de la 1 H, 15 N correlaciones del espectro Tau fosforilada. (A y B) corresponden a espectros adquiridos a 600 MHz, 2.048 y 256 puntos de datos en anchuras espectrales de 14 y 25 ppm se registraron en la 1 H (F2) y 15 N dimensiones (F1), respectivamente.Se utilizaron 32 barridos, y la duración total de la adquisición fue de 2 h 44 min y (C) a 900 MHz, 3.072 y 416 puntos de datos en anchuras espectrales de 14 y 25 ppm se registraron en la 1 H (F2) y 15 N ( F1) dimensiones, respectivamente. Se utilizaron 48 exploraciones, y la duración total de la adquisición fue de 6 horas 37 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: 3D 1 H, 15 N, 13 C RMN espectro, proyecciones y planos 2D extraídos. 2.048, 72, y 256 puntos de datos se registraron en la 1 H (F3), 15 N (F2), y 13 C (F1) dimensiones, respectivamente. Anchuras espectrales son 14, 25, y 61 ppm, centrada en 4,7, 119, y 41 ppm en el 1 H,15 N y 13 dimensiones C, respectivamente. Duración de la adquisición usando 16 barridos es de 4 días y 6 hr. La representación (A) del cubo correspondiente a la transformada de Fourier conjunto de datos 3D de un espectro HNCACB de Tau fosforilada-ERK obtiene a 600 MHz. El 2D 1 H, 15 N y el 1 H, 13 aviones C se obtienen por proyección de los datos 3D lo largo de la 13 C y 15 N dimensión, respectivamente. Procesamiento de datos y la representación se realizaron usando adquisición de RMN y de software de procesamiento. (B) 2D 1 H, 13 C avión extraída del 3D 1 H, 15 N, 13 C RMN conjunto de datos en un desplazamiento químico de 15 N 121,8 ppm. Un zoom (a la derecha) se centró en el desplazamiento químico 1 H de 9,38 ppm muestra los 13 CA y CB 13 resonancias tanto de residuos i (pThr153) e i-1 (Ala152). La resonancia 13 CB es alias debido a la anchura de las spectral ventana. Representación gráfica y recolección de pico se realizaron utilizando el software de análisis de RMN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos utilizado la espectroscopía de RMN para caracterizar muestras de Tau enzimáticamente modificados. La expresión recombinante y la purificación se describe aquí para la proteína tau humana de longitud completa de manera similar se pueden utilizar para producir mutantes Tau o Tau dominios. Isotópicamente la proteína es necesaria enriquecido para espectroscopía de RMN, lo que exige de expresión recombinante. La identificación de sitios de fosforilación requiere la asignación de resonancia y una proteína doblemente marcada 15N, 13C. Dado el costo de isótopos, se requiere un buen rendimiento en la etapa de expresión recombinante. La glucosa es el factor limitante para el crecimiento bacteriano en el medio M9, por tanto, la cantidad de 13 C 6 -glucosa se puede aumentar a 4 g por litro de medio de crecimiento para mejorar el rendimiento. La adición de vitaminas completas medianas y MEM no son obligatorias, pero ayudan a estimular el crecimiento y mejorar el rendimiento. Dado el alto costo del medio de marcado, este producto se utiliza como un medio de crecimiento supplement. El crecimiento bacteriano es lenta en medio M9. En general, los cultivos bacterianos usando medios M9 suplementado con 3% de avance de tiempo mediano alcance de la inducción después de aproximadamente 4 horas de incubación. Un OD 600 de 1.6 a 1.8 se obtiene normalmente al final del cultivo. Rendimiento esperado de la proteína tau recombinante es de unos 15 mg por litro de cultivo bacteriano. El uso de una incubadora programable permite programar convenientemente la producción de proteínas, la recogida del sedimento bacteriano y el control analítico de la producción de proteína durante las horas del día de trabajo.
Concentración de la muestra es importante para obtener un espectro de buena calidad. Una muestra típica Tau suficiente para un espectro 2D contendría 1 mg en 200 l (es decir, 100 mM), la proteína Tau. Para un espectro 3D, se requieren al menos 200 micras de 300 l, a condición de que se utiliza un cabezal de sonda criogénica. El acceso a un espectrómetro de alto campo, tal como el instrumento 900 MHz utilizada en este estudio proporcionará una mejor relación señal-ruidoy reducir las limitaciones sobre la concentración de la muestra (figura 8). Dado que Tau es una proteína desordenado grande, sus espectros de RMN se caracterizan por una considerable superposición de la señal, y un espectrómetro de RMN de campo alto también será la mejor opción en términos de resolución (Figura 8). Sin embargo, las resonancias correspondientes a los sitios de fosforilación están en una región distinta del espectro y son fáciles de detectar incluso con un espectrómetro de 600 MHz (comparar las figuras 9 B y 9C). Además, debido a su naturaleza desordenada, la proteína Tau es sensible a la proteolisis (Figuras 8B).
Se aconseja Esterilización de tampones para limitar la degradación Tau. La adición de inhibidores de la proteasa a la muestra de RMN ayuda a proteger Tau contra la degradación durante los períodos de adquisición de datos que pueden durar desde horas a días, dependiendo de la secuencia de impulsos. Se requiere un pH bajo (es decir, pH inferior a 7,0) a AVoid cambio demasiado rápido entre los protones de proteínas y los protones del agua, lo que conduce a la señal ampliación. pH de la muestra debe también ser bien controladas para asegurar la reproducibilidad de los espectros. De hecho, puesto que los valores de pKa de pSer y pThr están cerca del pH óptimo para la espectroscopia de RMN, desplazamientos químicos de los residuos fosforilados son muy sensibles a las variaciones de pH. El ajuste del pH de la muestra de RMN se puede hacer directamente usando un pH-metro con un electrodo de pH micro, adaptada a pequeños volúmenes. Tau es una proteína soluble y no agrega en condiciones estándar. La adición de polianiones, tales como sulfato de heparina, e incubación a 37 ° C puede iniciar la agregación en las muestras de tau. En este caso, dada la naturaleza sólida de los agregados, la mayoría de las resonancias en el espectro de RMN correspondiente ensanchan más allá de la detección. Incluso las muestras Tau fosforilada no lo hacen agregada en las condiciones descritas aquí para la adquisición de los datos de RMN.
En comparación con el análisis de anticuerpos, NMR proporciona una overall vista del PTM. La espectrometría de masas también se puede utilizar para identificar el patrón de fosforilación de una muestra de proteína. marcaje isotópico no es necesario para esta técnica, y las cantidades de muestra necesarios son mucho más pequeños. Sin embargo, la caracterización de una proteína con múltiples fosforilaciones, como Tau, sigue siendo un reto. fosforilaciones adyacentes producirán péptidos isobáricas en las estrategias de abajo hacia arriba de identificación. Identificación completa a continuación, necesita secuenciación MS / MS de los péptidos obtenidos por proteolisis muestra. Una ventaja de la RMN consiste en la naturaleza cuantitativa intrínseca de la técnica. La intensidad de una señal de RMN se puede vincular a la cantidad del grupo químico presente en un sitio específico. Así pues, podemos definir la proporción de modificación química en cada sitio. No obstante los avances más recientes en las aplicaciones de MS han demostrado que el análisis de MS Tau fosforilación múltiple es factible 24, incluso de una manera cuantitativa después de la normalización adecuada 25.
A continuación, presentamos la fosforilación de tau por ERK2 activada, pero la metodología se puede utilizar para la fosforilación con otras quinasas, así 6,7,26 - 28. Los experimentos cinéticos se pueden realizar, lo que puede ayudar a definir la especificidad quinasa hacia un sustrato de proteína 28-31. Estudios de fosforilación no se limitan a quinasas recombinantes, y la actividad quinasa de los extractos de células o tejidos pueden ser analizados 6,32,28. Un desarrollo interesante es el uso de RMN en células para estudiar en modificaciones in situ 33,34. A la inversa, se RMN también bien adaptado para abordar la especificidad de la fosfatasa, como se ha demostrado mediante el estudio de la desfosforilación de Tau fosforilada por la fosfatasa PP2A 35. espectroscopía de RMN se puede aplicar a la caracterización de inhibidores de la quinasa mediante la comparación del perfil de la fosforilación del sustrato de proteína en un espectro 2D en presencia del compuesto inhibidor de ingenioh el espectro emitido a partir de un experimento de control 6.
El interés de la utilización de espectroscopía de RMN, en comparación con las técnicas de EM más sensibles, reside en la amplia gama de aplicaciones que explotan el protocolo descrito aquí, en lugar de en su capacidad analítica solo. Ha demostrado ser crucial identificar los sitios de fosforilación para ser capaz de enlazar fosforilaciones específicos con modificaciones estructurales o funcionales que se estudiaron principalmente usando RMN. Espectroscopía de RMN de muestras Tau fosforilada permite explorar el impacto estructural de la fosforilación de ambas estructuras secundarias locales transitorias y el reordenamiento global del conjunto dinámico de Tau modificado 36,37. Aspectos funcionales incluyen la regulación de la interacción tanto de Tau con compañeros de la proteína 7,38,39 y la agregación de Tau fosforilación 8. La muestra Tau fosforilada caracterizado por RMN se puede utilizar más de descifrar las interacciones fosfo-dependiente, porejemplo, con las proteínas 14-3-3, 40 y la interacción proteína-proteína de ingeniería inhibidores 41,42. RMN permite la definición de sitio (s) interacción en el nivel de residuos y de la dependencia de esta interacción sobre la fosforilación. Además, la espectroscopia de RMN de fosforilados Tau es una metodología clave para caracterizar la prolina cis: trans isomerasa Pin1, una importante enzima fosfo-dependientes participan en la regulación Tau 43 - 45 años. Además, el análisis de la fosforilación por RMN se puede aplicar no sólo a las PDI sino también a las proteínas globulares 46. Por último, otros tipos de Tau PTM tales como acetilaciones 22,40,41 pueden ser estudiadas por NMR. Los protocolos descritos aquí han demostrado ser crucial para entender mejor la regulación funcional y estructural de Tau en condiciones fisiológicas y patológicas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET15B recombinant T7 expression plasmid | Novagen | 69257 | Keep at -20 °C |
| BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria | New England Biolabs | C2527I | Keep at -80 °C |
| Autoclaved LB Broth, Lennox | DIFCO | 240210 | Bacterial Growth Medium |
| MEM vitamin complements 100x | Sigma | 58970C | Bacterial Growth Medium Supplement |
| 15N, 13C-ISOGRO complete medium powder | Sigma | 608297 | Bacterial Growth Medium Supplement |
| 15NH4Cl | Sigma | 299251 | Isotope |
| 13C6-Glucose | Sigma | 389374 | Isotope |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 5056489001 | Keep at 4 °C |
| 1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C | |||
| DNaseI | EUROMEDEX | 1307 | Keep at -20 °C |
| Homogenizer (EmulsiFlex-C3) | AVESTIN | Lysis is realized at 4 °C | |
| Pierce™ Unstained Protein MW Marker | Pierce | 266109 | |
| Active human MEK1 kinase, GST Tagged | Sigma | M8822 | Keep at -80 °C |
| AKTÄ Pure chromatography system | GE Healthcare | FPLC | |
| HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column) | GE Healthcare | 17-5156-01 | Cation exchange chromatography columns |
| HiPrep 26/10 Desalting | GE Healthcare | 17-5087-01 | Protein Desalting column |
| PD MidiTrap G-25 | GE Healthcare | 28-9180-08 | Protein Desalting column |
| Tris D11, 97% D | Cortecnet | CD4035P5 | Deuterated NMR buffer |
| 5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe) | Euriso-top | BMS-005B | NMR Shigemi Tubes |
| eVol kit-electronic syringe starter kit | Cortecnet | 2910000 | Pipetting |
| Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead | Bruker | NMR spectrometer for data acquisition | |
| Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead | Bruker | NMR spectrometer for data acquisition | |
| TopSpin 3.1 | Bruker | Acquisition and Processing software for NMR experiments | |
| Sparky 3.114 | UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) | NMR data Analysis software |
References
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