Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.
Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP.
Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre+ mice with Rosa-mTmGfl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.
Sinds de eerste systematische beschrijving van de bijschildklieren in menselijke en in verschillende andere soorten van Sandström in 1880 1, kan begrijpen wat deze kleine endocrien orgaan voor menselijke fysiologie met voortdurend verbeterd. Bijschildklieren scheiden bijschildklierhormoon (PTH), de belangrijkste regulator van calcium metabolisme. PTH is een belangrijke hormoon op fosfaat homeostase en botturnover 1, 2. Per ongeluk verwijderen of beschadiging van de bijschildklieren tijdens de hals chirurgie is de meest voorkomende oorzaak van hypoparathyreoïdie, een ziekte die wordt gekenmerkt door een lage bloed calcium, lage PTH, en verhoogde fosfor 1.
Om beter studie hypoparathyroïdie en testen van nieuwe therapieën, betrouwbare en gemakkelijk toegankelijke muismodellen nodig verworven. Muizen worden veel gebruikt in onderzoek, omdat een groot aantal genetische hulpmiddelen zijnvailable in deze soort toelaat verfijnde mechanistische studies in vivo. Hoewel chirurgische parathyroïdectomie (PTX) kan worden gebruikt bij ratten 2, 3, 4, 5, en grotere zoogdieren 6, 7, 8, het technische uitdaging bij muizen vanwege de kleine omvang van de klieren en hun variabele anatomische verdeling 9. Daarom is thyro-parathyroïdectomie (TPTX) typisch uitgevoerd bij muizen, waarbij de schildklier en bijschildklieren elkaar 10 verwijderd. Echter, lage schildklierhormoon niveaus zijn een potentiële confounder in experimenten, complicerende dit model. Bovendien worden C-cellen in de schildklier, die calcitonine, een hormoon belangrijke calcium homeostase in knaagdieren, produceren ook verloren na verwijdering van de driyroids 11.
Verschillende genetische muismodellen van hypoparathyroïdie bestaan die de PTH-null muis 12, de GCM2-null muis 13, en de Nuf muis met een activerende mutatie in het calcium receptor (CASR) 14, 15 omvatten. Echter, deze genetische defecten reeds tijdens de embryonale ontwikkeling aanwezig, en de functie van de bijschildklieren is derhalve reeds tijdens embryogenese aangetast. Dit kan invloed hebben op de ontwikkeling van organen zoals het skelet. Dit in tegenstelling tot patiënten met postoperatieve hypoparathyroidism die de ziekte op latere leeftijd verwerven. Bovendien zijn sommige muismodellen vertonen vroegtijdige sterfte en verminderde vruchtbaarheid, die het gebruik 12, 13, 14 verder compliceert.
We ontwikkelden twee nieuwe muis modellen voor verworven hypoparathyreoïdie. Met behulp van genetisch gemanipuleerde muizen die GFP tot expressie specifiek in de bijschildklieren kan de bijschildklieren gemakkelijke identificatie voor chirurgische verwijdering zonder de schildklier. Deze muis werd geproduceerd door het kruisen van de PTH-Cre muizen, waarin Cre recombinase tot expressie brengt onder de controle van de 5,5 kb promotor PTH 16 met ROSA mTmG muis. De resulterende PTHcre; mTmG muizen uitdrukken groen fluorescerend eiwit specifiek in parathyroïde cellen. De tweede muismodel gebruikt dezelfde PTH-Cre, dit keer naar een STOP cassette uit de induceerbare DTR muis specifiek verwijderen, wat resulteert in expressie van het difterietoxine receptor in de bijschildklieren. Systemische toediening van DT vernietigt parathyroïde cellen, waardoor de dieren hypoparathyroid zonder operatie.
De twee muismodellen die in deze studie tonen een stabiele hypocalcemische fenotype over de drie maanden durende observatie period. De procedures zijn eenvoudig uit te voeren, het fenotype is reproduceerbaar, en de hypoparathyroid muizen vertonen een hoge overlevingskans 17.
We tonen de techniek van GFP geleide parathyreoïdectomie transgene muizen met GFP expressie selectief in de bijschildklieren. In de PTHcre, mTmG muizen, dubbele fluorescentie (groen GFP-expressie van Cre cellen en rode tomaten in niet-Cre tot expressie cellen) konden wij duidelijk aan, en nauwkeurig alle bijschildklieren verwijderen zonder de schildklieren. Terwijl we de voorkeur aan het gebruik van de dubbele-fluorescentie mTmG muizen voor de mogelijkheid om fluorescerend rood non-bijschildklierweefsel identificeren, moeten onze procedure ook goed werken met behulp van enkele fluorescerende dieren zoals de tomaat rood (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) Hze / J) muis. De procedure is relatief gemakkelijk uit te voeren, vereist ongeveer 20 minuten per muis, en resulteert in een ernstige en aanhoudende hypoparathyroid fenotype.
Bovendien is een ander voordeel van de GFP-positieve bijschildklieren is het gemak van detecteren van afwijkende bijschildklieren. Onze studies tonen aanmislocalisatie van de bijschildklieren op ongeveer een kwart van B6 muizen (figuur 1), die gemakkelijk in onze muismodel worden gedetecteerd door de groene fluorescentie. Anders dan thyro-parathyreoïdectomie, onze techniek vermijdt de verwijdering van de schildklier met daaropvolgende noodzaak schildklierhormonen en het onbekende effect van verwijdering van de schildklier calcitonine producerende C-cellen. Fluorescent gelabelde bijschildklieren kan ook worden gebruikt voor andere onderzoeken die de isolatie van de bijschildklieren nodig. De beperking van dit model omvat de vereiste operatie. Basic microchirurgie vaardigheden en een dissectie microscoop met een fluorescerende lichtbron nodig.
Een tweede techniek voor het genereren hypoparathyroid muizen die de noodzaak van chirurgie elimineert aangetoond. Difterietoxine-behandelde PTHcre-iDTR muizen vertonen een milder hypoparathyroïdie fenotype, maar gewoon voor dat het injecteren van DT intraperitoneaal in de muis. De kritische deel for genereren dit model werd de optimalisatie van de dosis en het doseringsschema. Hoge doses DT tot toxiciteit maar lage doses verlaagde de werkzaamheid van de benadering. We hebben vastgesteld dat de dosis regiment 2 injecties met 5 ug / kg, toegediend 3 dagen na elkaar, resulteerde in betrouwbaar en stabiel hypocalcemie geen / minimale mortaliteit.
Uiteindelijk hopen we dat deze twee benaderingen leveren nuttige muismodellen voor verworven hypoparathyreoïdie. Volgens een nieuw langwerkend PTH rapporteerden wij het eerste gebruik van beide modellen het bepalen van de effectiviteit van nieuwe geneesmiddelen voor hypoparathyreoïdie 17.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de NIH subsidies R01-DK100584 en China State Key Laboratory Mondziekten Open Funding SKLOD2015OF01 (RB). Wij danken Wenping Zhao, Tadatoshi Sato, en Kelly Lauter om hulp.
ROSAmT/mG mice | The Jackson Laboratory | 7676 | |
PTH-Cre mice | The Jackson Laboratory | 5989 | |
iDTRmice | The Jackson Laboratory | 7900 | |
6-0 polyglactin 910 suture with needle | Ethicon, Inc | J510G | |
Safety Single Edge Razor Blades | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co., LTD | 72042-11 | |
Povidone-Iodine Prep Pads | Dynarex Corporation | 1108 | |
Ply gauze | Busse. Inc | BHD707 | |
0.9% Sodium Chloride Solution | HOSPIRA Worldwide, Inc | 07983-09 | |
1mL 29G Insulin Syringe | BECTON DICKINSON | 329622 | |
Surgical Incise Drapes | 3M | 6640EZ | |
Dumstar Biology forceps | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-4984 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5605 | |
Needle Holder | MILTEX.,Inc | V98-42 | |
2,2,2-Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
2-Methyl-2-Butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | For dissolve the 2,2,2-Tribromethanol |
Diphtheria Toxin Powder | Sigma-Aldrich | D0564 | Dissolve in 0.9% sodium chloride solution at 1mg/mL as the stock solution in -80C |
Multicap Blood Collection Capillary tubes | Siemens Healthcare Diagnostics Ltd | 855578 | For collecting blood in iCa2+ analysis using RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer |
RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer | Siemens Healthcare | For iCa2+ analysis |