Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.
Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP.
Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre+ mice with Rosa-mTmGfl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.
人間の生理と疾患のためのこの小さな内分泌器官の重要性を理解する1880年1中のヒトおよびサンドストロームによって、いくつかの他の種における副甲状腺の最初の体系的な説明、以来継続的に改善しています。副甲状腺は副甲状腺ホルモン(PTH)、カルシウム代謝の主要な調節因子を分泌します。 PTHはまた、リン酸の恒常性と骨代謝回転1、2のための重要なホルモンです。首の手術中の副甲状腺の脱落や破損が副甲状腺機能低下症の最も一般的な原因、低い血中カルシウム、低PTH、および高いリン1によって特徴付けられる疾患です。
優れた研究に副甲状腺機能低下症とテストの新規治療法を取得し、簡単に信頼性が高く、アクセス可能なマウスモデルが必要とされています。遺伝的ツールの多種多様であるため、マウスは、広く研究に使用されていますin vivoで洗練された機構研究を可能にするこの種で利用できます。外科副甲状腺(PTX)は、ラット2、3、4、5、及び大型哺乳類6、7、8で使用することができるがしかし、それは、技術的理由腺のサイズが小さいと、その変数の解剖学的分布のマウスでは非常に困難です9。したがって、THYRO、副甲状腺(TPTX)は、典型的には、甲状腺および副甲状腺が一緒10を除去されたマウスで行われます。しかし、低甲状腺ホルモンレベルは、このモデルを複雑に、実験における潜在的な交絡因子です。また、カルシトニン、げっ歯類におけるカルシウム恒常性に重要なホルモンを産生する甲状腺内のC-細胞は、また目の除去の際に失われますyroids 11。
副甲状腺機能低下症のいくつかの遺伝的マウスモデルは、PTH-ヌルマウス12、GCM2ヌルマウス13、およびカルシウム感知受容体(CaSRを)14、15における活性化変異を有するNUFマウスが含まれ、存在しています。しかしながら、これらの遺伝的欠損は、胚発生中に既に存在し、副甲状腺の機能は、したがって、既に胚形成の間に損なわれています。これは、骨格のような臓器の発達に影響を与えることができます。これは、その後の人生で病気を取得術後性副甲状腺機能低下症を有する患者とは対照的です。さらに、これらのマウスモデルのいくつかは、さらにそれらの使用12、13、14を複雑早期致死性および減少生殖能力を示します。
我々は2つの新しいマウスメートルを開発しました後天性副甲状腺機能低下症のためodels。具体的には副甲状腺にGFPを発現する遺伝子改変マウスを使用すると、副甲状腺が簡単に甲状腺を除去することなく、外科的除去のために識別することができます。このマウスはROSA mTmGマウスで5.5キロバイトのPTHプロモーター16の制御下でCreリコンビナーゼを発現するPTH-のCreマウスを、交配することにより生成されました。その結果PTHcre; mTmGマウスは副甲状腺細胞に特異的に緑色蛍光タンパク質を発現します。 2番目のマウスモデルは、同じPTH-Creを、副甲状腺に特異的にジフテリア毒素受容体の発現をもたらす、誘導性DTRマウスからSTOPカセットを削除するには、この時間を使用しています。 DTの全身投与は、動物が手術なしでhypoparathyroidレンダリング、副甲状腺細胞を破壊します。
本研究で提示2つのマウスモデルは、3ヶ月の観測周囲にわたって安定した低カルシウム血症の表現型を実証しますOD。手順は実行が容易であり、表現型は再現性があり、かつhypoparathyroidマウスは、高い生存率17を示します。
私たちは、副甲状腺に選択的にGFP発現トランスジェニックマウスを用いて、GFP-導かれた副甲状腺摘出術の技術を実証します。 PTHcreでは、mTmGマウス、二重蛍光(Creを発現した細胞と非のCreの赤いトマトの緑色のGFPは、細胞を発現する)を明確に識別するために、そして正確に甲状腺を除去することなく、すべての副甲状腺を除去することができました。我々は、蛍光赤非副甲状腺組織を同定する能力のための二重蛍光mTmGマウスの使用を好むが、私たちの手順はまた、トマトの赤(B6.Cg-CT(ROSA)26Sortm14(のような単一の蛍光の動物を使用してうまく動作するはずですCAG-tdTomato)Hze / J)マウス。手順は、実行するのが比較的容易であり、マウス当たり約20分を必要とし、重篤かつ持続hypoparathyroid表現型をもたらします。
加えて、GFP陽性の副甲状腺の別の利点は、異常な副甲状腺の検出を容易にします。我々の研究は実証します容易に緑色蛍光によって私たちのマウスモデルで検出されたB6マウス( 図1)の約四分の一で副甲状腺の誤局在。 THYRO-副甲状腺に反して、私たちの技術は、甲状腺ホルモン補充およびカルシトニン産甲状腺C細胞の除去の未知の効果のためのその後の必要性と甲状腺の除去を回避することができます。蛍光標識された副甲状腺はまた、副甲状腺の単離を必要とする他の調査のために使用することができます。このモデルの制限は、手術のための要件が含まれています。基本的なマイクロサージェリーのスキルや蛍光光源と解剖顕微鏡が必要です。
手術の必要性を排除hypoparathyroidマウスを生成するための第2の技術は、実証されています。ジフテリア毒素処理したPTHcre-IDTRマウスは、より穏やかな副甲状腺機能低下症の表現型を示すが、単にマウスの腹腔内にDTを注入する必要があります。 foの重要な部分Rこのモデルを生成する用量および投与レジメンの最適化でした。 DTの高用量は、毒性につながったが、低用量は、アプローチの有効性を減少させました。私たちは、3日おきに投与を5μg/ kgの2回の注射の用量レジメンは、なし/最小の死亡率と信頼性の高い、安定した低カルシウム血症をもたらしたことを決定しました。
最終的に、我々はこれら二つのアプローチは、後天性副甲状腺機能低下症のために有用なマウスモデルを提供することを願っています。小説長時間作用型PTHを使用して、我々は、副甲状腺機能低下症17のための新薬の有効性を決定する際に、これらのモデルの両方の最初の使用を報告しました。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、口腔疾患オープン資金SKLOD2015OF01(RB)のNIHの助成金R01-DK100584と中国国家重点実験室によってサポートされていました。我々は助けをWenping趙、忠利佐藤、とケリーLauterに感謝します。
ROSAmT/mG mice | The Jackson Laboratory | 7676 | |
PTH-Cre mice | The Jackson Laboratory | 5989 | |
iDTRmice | The Jackson Laboratory | 7900 | |
6-0 polyglactin 910 suture with needle | Ethicon, Inc | J510G | |
Safety Single Edge Razor Blades | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co., LTD | 72042-11 | |
Povidone-Iodine Prep Pads | Dynarex Corporation | 1108 | |
Ply gauze | Busse. Inc | BHD707 | |
0.9% Sodium Chloride Solution | HOSPIRA Worldwide, Inc | 07983-09 | |
1mL 29G Insulin Syringe | BECTON DICKINSON | 329622 | |
Surgical Incise Drapes | 3M | 6640EZ | |
Dumstar Biology forceps | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-4984 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5605 | |
Needle Holder | MILTEX.,Inc | V98-42 | |
2,2,2-Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
2-Methyl-2-Butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | For dissolve the 2,2,2-Tribromethanol |
Diphtheria Toxin Powder | Sigma-Aldrich | D0564 | Dissolve in 0.9% sodium chloride solution at 1mg/mL as the stock solution in -80C |
Multicap Blood Collection Capillary tubes | Siemens Healthcare Diagnostics Ltd | 855578 | For collecting blood in iCa2+ analysis using RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer |
RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer | Siemens Healthcare | For iCa2+ analysis |