Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.
Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP.
Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre+ mice with Rosa-mTmGfl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.
인간의 생리 및 질병이 작은 내분비 기관의 중요성을 이해 1880 (1) 인간과 Sandström에 의해 여러 다른 종의 부갑상선의 첫 번째 체계적인 설명, 이후 지속적으로 개선되었다. 부갑상선은 부갑상선 호르몬 (PTH), 칼슘 대사의 주요 레귤레이터를 분비한다. PTH는 인산 항상성 및 골대사 1,2 중요한 호르몬이다. 목 수술 중 부갑상선의 사고 제거 또는 손상 부갑상선 기능 저하증의 가장 흔한 원인, 낮은 혈중 칼슘, 낮은 PTH 및 고가 인 1을 특징으로하는 질환이다.
더 나은 연구에 안전하고 쉽게 접근 할 수 마우스 모델이 필요 부갑상선 기능 저하증 및 테스트 새로운 치료를 인수했다. 유전 다양한 도구가이기 때문에 마우스는 널리 연구에서 사용생체 내에서 정교한 기계적인 연구를 허용하는이 종로만 제공. 수술 부갑상선 (PTX)은 래트 2, 3, 4, 5, 더 큰 포유 동물 6, 7, 8에서 사용할 수 있지만 그러나, 기술적으로 인해 동맥의 작은 크기와 그 변수 해부학 적 분포의 마우스에서 매우 도전 9. 따라서, 등 Thyro-부갑상선 (복강 내 투여)는 일반적 갑상선 부갑상선과 함께 열이 제거 된 쥐에서 수행된다. 그러나, 낮은 갑상선 호르몬이 모델을 복잡 실험 잠재적 교란 요인이된다. 또한, 칼시토닌, 설치류 칼슘 항상성에 중요한 호르몬을 생산하는 갑상선 내에서 C 세포는 또한 제의 제거시 손실yroids 11.
부갑상선 기능 저하증의 몇몇 유전자 마우스 모델은 PTH 널 마우스 (12), GCM2 널 마우스 (13)와, 칼슘 감지 수용체 (CASR) 14 (15), 활성화 돌연변이와 NUF 마우스를 포함하는 존재한다. 그러나, 이들 유전 적 결함은 이미 배아 발달 동안 존재하고, 부갑상선 기능 따라서 이미 배아 발생 동안 손상된다. 이는 골격으로 장기의 발달에 영향을 미칠 수있다. 이것은 나중에 인생에서 질병을 획득 수술 후 부갑상선 기능 저하증 환자와 대조. 또한,이 마우스 모델의 일부는 상기의 사용 12, 13, 14을 복잡 조기 치사 감소 불임을 나타낸다.
우리는 두 개의 새로운 마우스 m를 개발인수 부갑상선 기능 저하증에 대한 odels. 갑상선을 제거하지 않고 부갑상선 쉽게 제거 수술을 위해 식별 할 수 있습니다, 특히 부갑상선에서 GFP를 발현 유전자 조작 마우스를 사용. 이 마우스는 ROSA mTmG 마우스로 5.5 킬로바이트의 PTH 프로모터 (16)의 제어하에 Cre 호텔의 재조합 효소를 표현하는 PTH-Cre 호텔 마우스를 교차에 의해 생성되었습니다. 그 결과 PTHcre, mTmG 마우스는 부갑상선 세포에서 구체적으로 녹색 형광 단백질을 발현. 두번째 마우스 모델은 동일한 PTH-Cre 호텔, 부갑상선에 특히 디프테리아 독소의 수용체 발현의 결과로 유도 DTR 마우스에서 STOP 카세트를 제거하는이 시간을 사용한다. DT의 전신 투여는 동물이 수술없이 hypoparathyroid 렌더링, 부갑상선 세포를 파괴한다.
본 연구에 제시된 두 마우스 모델은 3 개월 관찰 요정 위에 안정한 hypocalcemic 표현형을 입증OD. 절차가 수행하기 쉬운, 표현형이 재현하고 hypoparathyroid 마우스는 높은 생존율 (17)을 나타낸다.
우리는 부갑상선에 선택적으로 GFP 발현과 유전자 변형 마우스를 사용하여 GFP 유도 부갑상선의 기술을 보여줍니다. PTHcre에서, mTmG 마우스, 이중 형광 (Cre 호텔 발현 세포 및 비 Cre 호텔에서 빨간 토마토의 녹색 GFP 세포를 표현) 명확하게 파악하고, 정확하게 갑상선을 제거하지 않고 모든 부갑상선을 제거 할 수있게. 우리는 형광 적색 비 부갑상선 조직을 식별 할 수있는 능력에 대해 이중 형광 mTmG 마우스의 사용이 선호되지만, 우리의 방법은 또한 토마토 레드 (B6.Cg-CT (ROSA) 26Sortm14 (같이 단일 형광 동물을 사용하여 잘 작동해야 CAG-tdTomato) Hze / J) 마우스입니다. 절차 수행 비교적 쉽게 마우스 당 약 20 분을 요구하고, 심각하고 지속적인 hypoparathyroid 표현형을 초래한다.
또한, GFP 양성 부갑상선의 또 다른 장점은 비정상적인 부갑상선의 검출 용이성이다. 우리의 연구는 보여쉽게 녹색 형광에 의해 우리의 마우스 모델에서 감지 B6 마우스 (그림 1)의 약 분기에 부갑상선의 mislocalization. 등 Thyro-부갑상선 반대로, 우리의 기술은 갑상선 호르몬 대체 및 칼시토닌을 생산하는 갑상선 C 세포의 제거 미지 효과 이후 필요에 갑상선의 제거를 방지한다. 형광 표지 된 부갑상선은 부갑상선의 절연을 필요로하는 다른 연구에 사용될 수 있습니다. 이 모델의 한계는 수술에 대한 요구 사항이 포함되어 있습니다. 기본 미세 기술과 형광 광원과 해부 현미경이 필요합니다.
수술 않아도 hypoparathyroid 마우스를 생성하는 제 2 기술이 설명된다. 디프테리아 PTHcre – IDTR 마우스는 온화한 부갑상선 기능 저하증의 표현형을 전시, 단순히 마우스에 복강 DT 주입이 필요 독소 처리. 중요한 부분 FOR 용량의 최적화는이 모델을했다 생성하고식이 요법을 투여. DT의 과다 복용은 독성 주도하지만 낮은 복용량은 접근의 효능을 감소. 우리는 관리 5 μg의 / kg,에서 2 주사의 용량 연대 3 일 간격, 아니 / 최소한의 사망률 신뢰할 수 있고 안정적인 저 칼슘 혈증의 결과 것으로 판단.
궁극적으로, 우리는이 두 가지 방법은 인수 부갑상선 기능 저하증에 대한 유용한 마우스 모델을 제공 할 수 있기를 바랍니다. 새로운 지속성 PTH를 사용하여, 우리는 부갑상선 기능 저하증 (17)에 대한 새로운 약물의 효능을 결정하는 이러한 모델 모두의 첫 번째 사용을보고했다.
The authors have nothing to disclose.
국립 보건원에 의해 지원되었다이 작품은 구강 질환 열기 자금 SKLOD2015OF01 (RB)의 R01 – DK100584 및 중국 국가 중점 실험실을 부여합니다. 우리는 도움을 Wenping 조, Tadatoshi 사토, 그리고 켈리 Lauter 감사합니다.
ROSAmT/mG mice | The Jackson Laboratory | 7676 | |
PTH-Cre mice | The Jackson Laboratory | 5989 | |
iDTRmice | The Jackson Laboratory | 7900 | |
6-0 polyglactin 910 suture with needle | Ethicon, Inc | J510G | |
Safety Single Edge Razor Blades | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co., LTD | 72042-11 | |
Povidone-Iodine Prep Pads | Dynarex Corporation | 1108 | |
Ply gauze | Busse. Inc | BHD707 | |
0.9% Sodium Chloride Solution | HOSPIRA Worldwide, Inc | 07983-09 | |
1mL 29G Insulin Syringe | BECTON DICKINSON | 329622 | |
Surgical Incise Drapes | 3M | 6640EZ | |
Dumstar Biology forceps | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-4984 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5605 | |
Needle Holder | MILTEX.,Inc | V98-42 | |
2,2,2-Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
2-Methyl-2-Butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | For dissolve the 2,2,2-Tribromethanol |
Diphtheria Toxin Powder | Sigma-Aldrich | D0564 | Dissolve in 0.9% sodium chloride solution at 1mg/mL as the stock solution in -80C |
Multicap Blood Collection Capillary tubes | Siemens Healthcare Diagnostics Ltd | 855578 | For collecting blood in iCa2+ analysis using RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer |
RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer | Siemens Healthcare | For iCa2+ analysis |