Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.
Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP.
Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre+ mice with Rosa-mTmGfl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.
Desde a primeira descrição sistemática das glândulas paratireóides em humanos e em várias outras espécies por Sandström em 1880 1, a compreensão do significado deste pequeno órgão endócrino para a fisiologia humana e da doença tem melhorado continuamente. glândulas paratireóides secretam hormônio da paratireóide (PTH), o principal regulador do metabolismo do cálcio. PTH também é um hormônio importante para a homeostase de fosfato e remodelação óssea, 1, 2. Remoção acidental ou danos das paratireóides durante a cirurgia no pescoço é a causa mais comum de hipotireoidismo, uma doença caracterizada por níveis baixos de cálcio no sangue, baixa de PTH e fósforo elevados 1.
Para melhor estudo adquiriu hipoparatireoidismo e testar novas terapias, fiáveis e facilmente são necessários modelos de ratos acessíveis. Os ratos são amplamente utilizado em pesquisa, porque uma grande variedade de ferramentas genéticas são umvailable nesta espécie que permitem estudos sobre os mecanismos sofisticados in vivo. No entanto, enquanto paratireoidectomia cirúrgica (PTX) pode ser usado em ratos 2, 3, 4, 5 e mamíferos maiores 6, 7, 8, é tecnicamente muito desafiante em ratos por causa do pequeno tamanho das glândulas e sua distribuição anatômica variável 9. Portanto, thyro-paratireoidectomia (TPTX) é normalmente realizada em ratinhos, em que a tireóide e glândulas paratireóides são removidos em conjunto 10. No entanto, os baixos níveis de hormônio da tireóide são um fator de confusão em potencial em experimentos, o que complica este modelo. Além disso, células C da glândula tiróide, que produzem calcitonina, uma hormona importante na homeostase do cálcio em roedores, também são perdidas após a remoção dos thyroids 11.
Vários modelos genéticos do rato de hipoparatireoidismo existe, que incluem o mouse PTH-nula 12, o mouse GCM2 nulo 13, eo rato Nuf com uma mutação ativadora no receptor sensível ao cálcio (CaSR) 14, 15. No entanto, estes defeitos genéticos já estão presentes durante o desenvolvimento embrionário, e a função das paratiróides é, por conseguinte, já prejudicado durante a embriogénese. Isto pode afectar o desenvolvimento dos órgãos, tais como o esqueleto. Isto contrasta com pacientes com hipoparatireoidismo pós-cirúrgico que adquirem a doença mais tarde na vida. Além disso, alguns desses modelos de ratos apresentam letalidade precoce e fertilidade reduzida, o que complica ainda mais a sua utilização 12, 13, 14.
Nós desenvolvemos dois novos rato modelos para hypoparathyroidism adquiridos. Usando ratos geneticamente modificados que expressam GFP especificamente nas paratiróides permite que as glândulas paratiróides para ser facilmente identificados por remoção cirúrgica sem remover a glândula tiróide. Este ratinho foi gerado através do cruzamento do rato PTH-Cre, que expressa a recombinase Cre sob o controle do promotor de 5,5 kb de PTH 16 com o rato ROSA mTmG. Os PTHcre resultantes; ratos mTmG expressar a proteína verde fluorescente especificamente em células paratireóides. O segundo modelo de ratinho usa o mesmo PTH-Cre, desta vez para remover uma cassete STOP proveniente do rato DTR indutivel, resultando na expressão do receptor da toxina da difteria especificamente nas paratiróides. administração sistêmica de DT destrói as células paratireóides, tornando os animais hypoparathyroid sem cirurgia.
Os dois modelos de mouse apresentados neste estudo demonstram um fenótipo hypocalcemic estável ao longo dos peri de observação de três mesesOD. Os procedimentos são fáceis de executar, o fenótipo é reprodutível, e os ratos hypoparathyroid exibem uma alta taxa de sobrevivência 17.
Nós demonstramos a técnica de paratireoidectomia guiada-GFP utilizando camundongos transgênicos com expressão GFP seletivamente nas glândulas paratireóides. Nos PTHcre; ratos mTmG, a fluorescência de casal (a GFP verde em células Cre-expressas e tomate vermelho na não-Cre células expressaram) nos permitiu identificar claramente, e para remover precisamente todas as glândulas paratireóides sem remover os tireóide. Enquanto nós preferimos o uso dos ratinhos mTmG dupla fluorescência para identificar a capacidade de um tecido não-paratiróide vermelho fluorescente, o nosso procedimento também deve funcionar bem com animais individuais fluorescentes tais como vermelho do tomate (B6.Cg-Ct (Rosa) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) Hze / J) mouse. O procedimento é relativamente fácil de realizar, requer cerca de 20 minutos por rato, e resulta num fenótipo hypoparathyroid grave e prolongada.
Além disso, outra vantagem das glândulas paratiróides GFP-positiva é a facilidade de detecção das glândulas paratiróides aberrantes. Os nossos estudos demonstrammislocalization das paratiróides em cerca de um quarto de ratinhos B6 (Figura 1), que são facilmente detectadas no nosso modelo de ratinho pela fluorescência verde. Contrariamente ao tíreo-paratiroidectomia, a nossa técnica evita a remoção da tiróide com consequente necessidade de substituição da hormona da tiróide e o efeito desconhecido de remoção de células C da tiróide produtoras de calcitonina. glândulas paratiróides marcado por fluorescência pode também ser utilizado para outras investigações que requerem o isolamento das glândulas paratiróides. A limitação deste modelo inclui a exigência para a cirurgia. habilidades de microcirurgia básicas e um microscópio de dissecação com uma fonte de luz fluorescente são obrigatórios.
Uma segunda técnica para gerar ratinhos hypoparathyroid que elimina a necessidade de cirurgia é demonstrada. Difteria toxina-ratinhos tratados PTHcre-IDTR exibem um fenótipo hypoparathyroidism mais suave, mas simplesmente exigir injetar DT intraperitoneal no rato. A parte crítica for gerando este modelo foi a otimização da dose e regime de dosagem. Altas doses de DT, levou a toxicidade mas doses baixas diminuiu a eficácia da abordagem. Nós determinamos que o regimento dose de 2 injeções com 5 mg / kg, administrada 3 dias de intervalo, resultou em hipocalcemia confiável e estável sem mortalidade / mínima.
Em última análise, esperamos que estas duas abordagens fornecem modelos úteis de mouse para hypoparathyroidism adquirido. Usando um romance PTH de ação prolongada, que relataram o primeiro uso de ambos os modelos para determinar a eficácia de novas drogas para o hipoparatireoidismo 17.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01-DK100584 e China State chave do Laboratório de Doenças Orais Abrir SKLOD2015OF01 Financiamento (RB). Agradecemos Wenping Zhao, Tadatoshi Sato, e Kelly Lauter para obter ajuda.
ROSAmT/mG mice | The Jackson Laboratory | 7676 | |
PTH-Cre mice | The Jackson Laboratory | 5989 | |
iDTRmice | The Jackson Laboratory | 7900 | |
6-0 polyglactin 910 suture with needle | Ethicon, Inc | J510G | |
Safety Single Edge Razor Blades | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co., LTD | 72042-11 | |
Povidone-Iodine Prep Pads | Dynarex Corporation | 1108 | |
Ply gauze | Busse. Inc | BHD707 | |
0.9% Sodium Chloride Solution | HOSPIRA Worldwide, Inc | 07983-09 | |
1mL 29G Insulin Syringe | BECTON DICKINSON | 329622 | |
Surgical Incise Drapes | 3M | 6640EZ | |
Dumstar Biology forceps | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-4984 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5605 | |
Needle Holder | MILTEX.,Inc | V98-42 | |
2,2,2-Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
2-Methyl-2-Butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | For dissolve the 2,2,2-Tribromethanol |
Diphtheria Toxin Powder | Sigma-Aldrich | D0564 | Dissolve in 0.9% sodium chloride solution at 1mg/mL as the stock solution in -80C |
Multicap Blood Collection Capillary tubes | Siemens Healthcare Diagnostics Ltd | 855578 | For collecting blood in iCa2+ analysis using RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer |
RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer | Siemens Healthcare | For iCa2+ analysis |