Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.
Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP.
Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre+ mice with Rosa-mTmGfl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.
Desde la primera descripción sistemática de las glándulas paratiroides en humanos y en otras especies por Sandström en 1880 1, la comprensión de la importancia de este pequeño órgano endocrino para la fisiología humana y la enfermedad ha mejorado continuamente. Estas glándulas secretan la hormona paratiroidea (PTH), el principal regulador del metabolismo del calcio. La PTH es también una hormona importante para la homeostasis fosfato y el recambio óseo 1, 2. La eliminación accidental o daño de las paratiroides durante la cirugía de cuello es la causa más común de hipoparatiroidismo, una enfermedad caracterizada por niveles bajos de calcio, PTH baja, y el fósforo elevados 1.
Para un mejor estudio adquirida hipoparatiroidismo y la prueba de nuevas terapias, fiable y fácilmente se requieren modelos de ratones accesibles. Los ratones se usan ampliamente en la investigación debido a una amplia variedad de herramientas genéticas son unavailable en esta especie que permiten estudios sobre los mecanismos sofisticados in vivo. Sin embargo, mientras que la paratiroidectomía quirúrgica (PTX) se puede utilizar en las ratas 2, 3, 4, 5, y los mamíferos más grandes 6, 7, 8, es técnicamente muy difícil en los ratones, debido al tamaño pequeño de las glándulas y su distribución anatómica variable de 9. Por lo tanto, Thyro-paratiroidectomía (TPTX) se lleva a cabo normalmente en ratones, en los que la tiroides y glándulas paratiroides se retiran juntos 10. Sin embargo, los niveles bajos de la hormona de la tiroides son un potencial de confusión en los experimentos, lo que complica este modelo. Además, las células C dentro de la glándula tiroides, que producen calcitonina, una hormona importante en la homeostasis del calcio en los roedores, también se pierden después de la retirada de los THyroids 11.
Existen varios modelos genéticos de ratón de hipoparatiroidismo, que incluyen el ratón PTH-12 nulos, el ratón nulo GCM2 13, y el ratón Nuf con una mutación activadora en el receptor sensible al calcio (RSCa) 14, 15. Sin embargo, estos defectos genéticos ya están presentes durante el desarrollo embrionario, y la función de las paratiroides tanto, es ya deteriorados durante la embriogénesis. Esto puede afectar el desarrollo de órganos tales como el esqueleto. Esto contrasta con los pacientes con hipoparatiroidismo postquirúrgico que adquieren la enfermedad más adelante en la vida. Por otra parte, algunos de estos modelos de ratón exhiben letalidad temprana y reducción de la fertilidad, lo que complica aún más su uso 12, 13, 14.
Hemos desarrollado dos nuevos ratón modelos el hipoparatiroidismo adquirida. Utilizando ratones manipulados genéticamente que expresan GFP específicamente en las paratiroides permite a las glándulas paratiroideas para ser fácilmente identificados por la extirpación quirúrgica sin la eliminación de la glándula tiroides. Este ratón se generó por cruzar el ratón PTH-Cre, que expresa Cre recombinasa bajo el control del promotor de PTH 5,5 kb 16 con el ratón ROSA mTmG. Los PTHcre resultantes; mTmG ratones expresan la proteína verde fluorescente específicamente en las células paratiroideas. El segundo modelo de ratón utiliza el mismo PTH-Cre, esta vez para eliminar un casete de STOP del ratón DTR inducible, lo que resulta en la expresión del receptor de toxina de la difteria específicamente en las paratiroides. La administración sistémica de DT destruye las células paratiroideas, haciendo que los animales hipoparatiroidismo sin necesidad de cirugía.
Los dos modelos de ratón presentados en este estudio demuestran un fenotipo hipocalcemia estable en los peri observación de tres mesessobredosis. Los procedimientos son fáciles de realizar, el fenotipo es reproducible, y los ratones hipoparatiroidismo exhiben una alta tasa de supervivencia 17.
Demostramos la técnica de paratiroidectomía GFP guiada por el uso de ratones transgénicos con la expresión de GFP selectivamente en las glándulas paratiroides. En los PTHcre; mTmG ratones, el doble de fluorescencia (GFP verde en las células expresadas por Cre y tomate rojo en la no-Cre expresó células) nos ha permitido identificar con claridad, y para extraer con precisión todas las glándulas paratiroides sin la eliminación de la tiroides. Aunque preferimos el uso de la doble fluorescencia mTmG ratones para la capacidad de identificar tejido no paratiroidea rojo fluorescente, nuestro procedimiento también debería funcionar bien el uso de animales fluorescentes individuales tales como el rojo tomate (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) / J del ratón Hze). El procedimiento es relativamente fácil de realizar, requiere aproximadamente 20 min por ratón, y los resultados en un fenotipo grave hipoparatiroidismo y sostenido.
Además, otra ventaja de las glándulas paratiroides positivas para GFP es la facilidad de detección de las glándulas paratiroides aberrantes. Nuestros estudios demuestranmislocalization de las paratiroides en aproximadamente un cuarto de los ratones B6 (Figura 1), que son detectados fácilmente en nuestro modelo de ratón por la fluorescencia verde. Contrariamente a Thyro-paratiroidectomía, nuestra técnica evita la eliminación de la tiroides con la consiguiente necesidad de reemplazo de la hormona tiroidea y el efecto desconocido de la eliminación de células C de la tiroides productoras de calcitonina. glándulas paratiroides marcadas fluorescentemente se podrían también utilizar para otras investigaciones que requieren el aislamiento de las glándulas paratiroides. La limitación de este modelo incluye el requisito para la cirugía. Se requieren habilidades básicas de microcirugía y un microscopio de disección con una fuente de luz fluorescente.
Una segunda técnica para generar ratones hipoparatiroidismo que elimina la necesidad de cirugía se demuestra. La toxina de la difteria-ratones tratados PTHcre-IDTR exhiben un fenotipo más leve hipoparatiroidismo, sino que simplemente requieren la inyección de DT por vía intraperitoneal en el ratón. La parte fundamental for generando este modelo fue la optimización de la dosis y el régimen de dosificación. Las altas dosis de DT llevaron a toxicidad, pero las dosis bajas disminuyó la eficacia del enfoque. Se determinó que el regimiento dosis de 2 inyecciones a 5 mg / kg, administrada 3 días de diferencia, dio lugar a hipocalcemia fiable y estable sin mortalidad / mínima.
En última instancia, esperamos que estos dos enfoques proporcionan modelos útiles de ratón para el hipoparatiroidismo adquirida. Usando una nueva PTH de acción prolongada, se informó de la primera utilización de ambos de estos modelos para determinar la eficacia de nuevos fármacos para el hipoparatiroidismo 17.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones R01-DK100584 y Laboratorio Estatal de China de las Enfermedades Orales SKLOD2015OF01 Financiación abierta (RB). Agradecemos a Wenping Zhao, Tadatoshi Sato, y Kelly Lauter en busca de ayuda.
ROSAmT/mG mice | The Jackson Laboratory | 7676 | |
PTH-Cre mice | The Jackson Laboratory | 5989 | |
iDTRmice | The Jackson Laboratory | 7900 | |
6-0 polyglactin 910 suture with needle | Ethicon, Inc | J510G | |
Safety Single Edge Razor Blades | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co., LTD | 72042-11 | |
Povidone-Iodine Prep Pads | Dynarex Corporation | 1108 | |
Ply gauze | Busse. Inc | BHD707 | |
0.9% Sodium Chloride Solution | HOSPIRA Worldwide, Inc | 07983-09 | |
1mL 29G Insulin Syringe | BECTON DICKINSON | 329622 | |
Surgical Incise Drapes | 3M | 6640EZ | |
Dumstar Biology forceps | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-4984 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5605 | |
Needle Holder | MILTEX.,Inc | V98-42 | |
2,2,2-Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
2-Methyl-2-Butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | For dissolve the 2,2,2-Tribromethanol |
Diphtheria Toxin Powder | Sigma-Aldrich | D0564 | Dissolve in 0.9% sodium chloride solution at 1mg/mL as the stock solution in -80C |
Multicap Blood Collection Capillary tubes | Siemens Healthcare Diagnostics Ltd | 855578 | For collecting blood in iCa2+ analysis using RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer |
RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer | Siemens Healthcare | For iCa2+ analysis |