Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד המערבי סופג ו immunocytochemistry בשילוב עם עיכוב של אנזימים ליזוזומלית ניתן להשתמש כדי להדגים את downregulation של פקטור ריסי נוירוטרופי קולטן α (CNTFRα), והיא מועברת על ידי האינטראקציה בין ציטוקין דמוי Factor-1 (CLF-1 ) לבין הקולטן endocytic sorLA.
Abstract
ציטוקינים heterodimeric ציטוקין Cardiotrophin דמוי: ציטוקין דמוי Factor-1 (CLC: CLF-1) מטרות glycosylphosphatidylinositol (GPI) -anchored CNTFRα להקים קומפלקס trimeric כי לאחר מכן הטירונים גליקופרוטאין 130 / לוקמיה מעכבות פקטור קולטן β (gp130 / LIFRβ) לאיתות. שניהם CLC ו CNTFRα נחוצים איתות אך עד כה CLF-1 כבר ידוע רק כמנחה משוערת של הפרשת CLC. עם זאת, לאחרונה הוכח כי CLF-1 מכיל שלושה אתרי קישור: אחד עבור CLC; אחד עבור CNTFRα (שעשוי לקדם הרכבה של מתחם trimeric); ואחד עבור קולטן endocytic sorLA. האתר האחרון מספק זיקה גבוהה המחייבת של CLF-1, CLC: CLF-1, כמו גם את trimeric (CLC: CLF-1: CNTFRα) המורכב sorLA, ובשנת sorLA להביע תאי הליגנדים המסיסים CLF-1 ו CLC : CLF-1 במהירות נלקח והפנים. בתאים שיתוף להביע CNTFRα ו sorLA, CNTFRα הראשון נקשר CLC: CLF-1 כדי ליצורקומפלקס trimeric קרום קשור, אבל זה גם מתחבר sorLA באמצעות האתר בחינם מחייב sorLA ב CLF-1. כתוצאה מכך, CNTFRα, אשר לא ניתן להכניס אנדוציטוזה בכוחות עצמו, הוא נמשך לאורך התפרים והפנימו על ידי אנדוציטוזה בתיווך sorLA של CLC: CLF-1.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הפרוצדורות משמשות כדי להדגים i) sorLA בתיווך CLC: CLF-1-תלוי downregulation ביטוי CNTFRα משטח-קרום; ii) sorLA בתיווך אנדוציטוזה ו ליזוזומלית מיקוד של CNTFRα; ו- III) את תגובת התאים הוריד ל CLC: CLF-1-גירוי על downregulation בתיווך sorLA של CNTFRα.
Introduction
את CLC ו CLF-1 מהווים שתי יחידות משנה של CLC ציטוקינים heterodimeric: CLF-1 1-3. לזירוז האות הסלולרי, CLC: המטרות הראשונות CLF-1 CNTFRα, הקולטן העיקרי ו GPI מעוגני שלה, להקים קומפלקס trimeric קרום הנכנס. את CLC: CLF-1: מורכבים CNTFRα ובהמשך מגייס gp130 / LIFRβ אשר מתווכת הטרנסממברני איתות באמצעות מתמרים יאנוס קינאז / אותות מטהרי 3 תמלול (JAK / STAT3) מסלול 4. עכברים לקוי בכל אחת משלוש יחידות משנה להציג היינו הך פנוטיפ ולמות תוך 24 שעות לאחר הלידה בשל מספר מופחת של נוירונים פנים 5-8 יונק מספיק. ממצאים בבני האדם גם מדגישים את הלכידות התפקודית של שלוש יחידות המשנה. לפיכך, מוטציות אנושיות (הומוזיגוטי או תרכובת) גרימת תפקוד לקוי של CLC: CLF-1 או CNTFRα, כל תוצאה של תסמונת שמכונה קר הנגרמת הזעה / Crisponi, מצב המאופיין בתסמינים כגון impaiיונק אדום ובליעה, תכונות dysmorphic שונות, דוקרנים טמפרטורה, פרדוקסלית Perfuse מזיעים בטמפרטורות נמוכות 9-11.
במבחנה, השילוב של CLC ו CNTFRα הוא גם הכרחי ומספיק אינטראקציה עם gp130 / LIFRβ ואת האינדוקציה של איתות תא 12. תפקידו של CLF-1 מצד שני הוא פחות ברור. הוא לא מעורב ישירות איתות, והפך זה מכבר נחשב כנספח שבעיקר משמש כדי להקל על הפרשת הסלולר של CLC 1. עם זאת, הממצאים אחרונים מראים כי יש CLF-1 פונקציות נוספות ועוד חשובות להפליל הוא איתות המחזור של CLC ו CNTFRα. לפיכך, נראה כי CLF-1 מכיל שלושה אתרי קישור תלויים זה בזה: על הידידות שלה ידוע קשירת CLC; ובכך הוא מתווך ישיר מחייב את CNTFRα; ואתר שלישי (גבוהה זיקה) לאינטראקציה עם קולטן endocytic sorLA. כפי שניהם CLC ו CLF-1 נראה & #160; למקד CNTFRα עם קירבה רבה נמוך CLC: מורכבים CLF-1, ניתן לשער כי CLF-1 (דרך האתר שלה CNTFRα מחייבת) מקדם איחוד CLC ו CNTFRα ובכך מקלה איתות 13.
אינטראקציה של CLF-1 עם sorLA, הסוגיה העיקרית של ההצגה הנוכחית, ממלא תפקיד שונה לחלוטין. SorLA הוא אחד מחמשת סוג 1 קולטנים המהווים את המשפחה הקולטן Vps10p-מושלם 14. היא באה לידי ביטוי במגוון של רקמות אך בפרט במוח וברקמות עצביות 15. בדומה לשאר בני המשפחה sorLA נושאת ליגנד N-terminal מחייב Vps10p-מושלם, אבל בנוסף, הוא גם כולל סוגים תחום אחרים כולל אלמנטים ליגנד מחייב למצוא בני משפחת קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה 15. הזנב ציטופלסמית שלה אינטראקציה עם חלבוני מתאם כמה, למשל, מתאם חלבון-1 ו -2, ו sorLA מעבירה endocytos ביותרגם הוא כמו מיון תאי והובלה של חלבונים מאוגדים 16-18. Vps10p-התחום מורכב β-מדחף גדול עשר להב 19,20, אשר נקשר סדרה של הליגנדים קשורים כולל CLF-1 (אך באופן בולט, לא CLC) 13. האתר מחייב CLF-1 הוא נגיש גם לאחר היווצרות מורכבת עם CLC ו CNTFRα כלומר sorLA נקשר לא רק חינם CLF-1, אבל גם CLC: CLF-1 ואת CLC מורכב trimeric: CLF-1: CNTFRα 13. SorLA מעבירה אנדוציטוזה המהירה של CLF-1 ו CLC: CLF-1, אבל אלה הם חלבונים מסיסים ואילו CNTFRα מקובע קרום פני השטח על ידי א-עוגן GPI. השאלה היא אפוא אם עקדת CLC: CLF-1: CNTFRα מאפשר sorLA להפנים את המתחם כולו ובכך לשנות את הביטוי קרום פני CNTFRα (ואת הרגישות הסלולר לאחר CLC: אינדוקציה אות CLF-1), ו / או מחזור של CNTFRα.
הניסויים שתוארו בהווהדו"ח נועד להבהיר את השאלות הבאות:
האם sorLA לתווך CLC: downregulation CLF-1-תלוי של משטח-קרום CNTFRα? כדי לברר זאת, שזה היה בהתחלה ניסה לקבוע את המחזור של CNTFRα (בהיעדר ונוכחות של sorLA) באמצעות תיוג מטבולית וניסויים הדופק מרדף כמתואר 21. עם זאת, ניסיונות לתייג CNTFRα באמצעות תערובת של [S 35] ציסטאין [S 35] מתיונין הראה התאגדות עניה של רדיואקטיביות. זה הציע תואר נמוך מאוד של סינתזה חדשה, אשר ככל הנראה לא יוכל לפצות על אובדן פתאומי ומשמעותי של קולטנים. כדי לקבוע אם CNTFRα היה downregulated כאשר ביניהם באמצעות CLC: CLF-1 עד sorLA, ולכן הוחלט פשוט למדוד (באמצעות המערבי סופג) בבריכה הסלולר הכולל של CNTFRα לפני ואחרי החשיפה CLC: CLF-1 - ולהשוות תוצאות בתאים transfected או לא טרנספקציה עםsorLA.
האם sorLA למקד CNTFRα כדי lysosomes? כדי לענות על שאלה זו, הלוקליזציה של CNTFRα - הפנים באמצעות CLC שלה: CLF-1 בתיווך קשירת sorLA - נבדק באמצעות immunocytochemistry, וסימון עם נוגדנים המכוונים כלפי CNTFRα ואת אנדוזום-מאוחר / ליזוזום סמן ליזוזומלית הקשורים חלבוני ממברנה 1 (LAMP-1). הניסוי בוצע על תאים שטופלו כמו גם מטופלים עם מעכבי אנזימים ליזוזומלית. הרעיון היה כמובן שאם CNTFRα היה מושפל lysosomes, בתאים שטופלו מעכבי אנזים יציגו CNTFRα מכתים המצטבר LAMP-1 שלפוחית חיובית, ואילו בתאים שלא טופלו נראים מעט או ללא מכתים עבור CNTFRα.
האם downregulation CNTFRα להפחית את תגובת התאים CLC: CLF-1 גירוי? המתחם trimeric המורכב CLC, CLF-1, ואותות CNTFRα באמצעות heterodimer gp130 / LIFRβ באמצעות STAT3 JAK /נָתִיב. בהתאם לכך, את היכולת של התאים להגיב CLC: CLF-1 איתות על downregulation של CNTFRα שנחקר על ידי זיהוי כתם המערבי ו quantitation של phospho-STAT3 (pSTAT3) / רמת STAT3 סך transfectants sorLA.
Protocol
1. המערבי סופג של CNTFRα Lysates
- אין מהיר באורך מלא sorLA ו myc-tagged CNTFRα בונים בכליה עוברית אנושית 293 (HEK293) תאים באמצעות pcDNA3.1 / Zeo (-) ו pcDNA3.1 / מוצרי היגיינה (-), בהתאמה. Transfect התאים HEK293 עם המבנים באמצעות מגיב transfection מסחרי לפי פרוטוקול manufacturer's. בחר שיבוטים יציב במדיום המכיל 150 מיקרוגרם / מ"ל Zeocin ו / או 500 מיקרוגרם / מ"ל hygromycin B זהב 13.
- מספר שווה זרע HEK293 transfectants להביע או CNTFRα-Myc או שיתוף להביע CNTFRα-Myc / sorLA בשתי צלחות 4-היטב כפי שמוצג באיור 1. התרבות התאים Dulbecco השתנה Eagle's בינוני (DMEM) בתוספת 10% עוברי בסרום שור (FBS), 100 U / mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין (בינוני מלא) בתוך חממה פחמן דו חמצני 5% ב 37 ג.
- מתן עד שהתאים הם 50 - 80% ומחוברות.
- הסר את המדיום מןבארות, ולשטוף פעם עם Dulbecco בופר פוספט (DPBS), ולהוסיף בינוני מלא טרי עם או בלי (שליטה) 10 ננומטר CLC: CLF-1 כמצוין באיור 1. דגירת התאים ב 37 ג.
- אחרי 0 ו -5 שעות של דגירה, לשחזר המדיום ולאחסן אותו ב 4 C ב 1.5 צינורות מ"ל. לאחר מכן להוסיף 1% Triton X-100 חיץ תמוגה (20 mM Tris-HCl, 10 מ"מ EDTA, pH 8.0) השלימו עם קוקטייל מעכב proteinase היטב כל (1 דק ', 4 ג). בהמשך לכך, להעביר את lysates התא 1.5 צינורות מ"ל (4 ג).
- ספין צינורות המכיל את lysate בינוני ותא (3,000 XG, 3 דקות, 4 ג) ולהעביר את supernatants 1.5 צינורות מ"ל (4 ג). וזורק את הכדור. העברת 5 μL של כל supernatant התא lysate צינורות 1.5 מ"ל חדש - להשתמש בהם כדי למדוד את תכולת החלבון מאוחר יותר (שלב 1.7). מיד, להוסיף למאגר מדגם LDS nonreducing לכל supernatants מערבולת הדגימות.
- השתמש ב -5 aliquots μL למדוד את protתוכן ein ב supernatants התא lysate באמצעות assay חלבון מסחרי על פי פרוטוקול של היצרן.
- מחמם את הדגימות ב 95 צלזיוס למשך 5 דקות.
- נושא כמות שווה של חלבון מכל מדגם לצמצום SDS-PAGE 13 ו המערבי סופג 13 ולדמיין את התוכן של sorLA, β-אקטין, ו CNTFRα-Myc בטווח הבינוני ב lysates התא באמצעות ארנבת אנטי sorLA 16 (5 מיקרוגרם / מיליליטר), אנטי-β-יקטין עכבר (0.4 מיקרוגרם / מיליליטר), ועכבר אנטי-Myc (1 מיקרוגרם / מיליליטר) נוגדנים ואת הנוגדנים משני HRP הצמוד המתאימים (1: 2,000).
- לכמת את הלהקות ידי צפיפות על פי הפרוטוקול של היצרן.
2. Immunocytochemistry לשלב עם ליזוזומלית מעכבים
- תאי זרע HEK293 transfected ביציבות עם CNTFRα-Myc / sorLA בשקופיות כיסוי בצלחת 4-היטב כפי שמוצג באיור 2. התרבות התאים בינוני מלא כאמור לעיל.
- חכה עד מפגש תא הוא 20 - 40%.
- הסר בינוני מבארות ולהוסיף בינוני מלא עם או בלי 50 מיקרוגרם / מ"ל של leupeptin ושל pepstatin (Leu / עידוד) (מעכב hydrolases ליזוזומלית) לתאי כמצוין באיור 2. דגירת התאים ב 37 ג. המדיום חייב להיות מוחלף כל 6 שעות במהלך דגירה 24 השעות של הבאים.
- לאחר 24 שעות של דגירה, שוב להחליף את המדיום (עם או בלי Leu / עידוד) והפעם להוסיף 10 CLC ננומטר: CLF-1. דגירת התאים ב 37 צלזיוס למשך 5 שעות.
- שוטפים את התאים פעם PBS ולתקן אותם paraformaldehyde 4%, pH 7 במשך 15 דקות ב RT.
זהירות: Paraformaldehyde היא רעילה ביותר, להימנע ממגע עם עור, עיניים, רירי. כפפות ומשקפי בטיחות צריכים להיות משוחק ופתרונות עשו בתוך במנדף. - שוטפים את התאים פעם ב PBS permeabilize התאים למשך 5 דקות ב RT ב saponin מדולל PBS (saponin 0.5%).
- לדלל עז נגד CNTFRα (1 מיקרוגרם / מ"ל) (יש לצייןלא העכבר אנטי-Myc המשמש המערבי סופג) ועכבר אנטי-LAMP-1 (15 מיקרוגרם / מ"ל) נוגדנים saponin 0.5% ו דגירה התאים עם נוגדנים עבור 2 שעות ב RT.
- שטפו את 4x תאים (5 דק ') ב saponin 0.5% ו דגירה התאים עם 488- וחמור נגד עז החמור Alexa נוגדנים משני אנטי עכבר Alexa 568 מצומדות (6 מיקרוגרם / מ"ל) עבור 2 שעות ב RT.
- שוטפים את התאים 4x (5 דק ') ב saponin 0.5%, פעמיים מים ללא יונים (1 דקות), ואת הר שקופיות כיסוי על מיקרוסקופ שקופיות באמצעות התקשורת הרכבה.
- נתח את מכתים נוגדן של תאים על ידי מיקרוסקופ confocal באמצעות מיקרוסקופ confocal לייזר סריקה עם מטרה טבילה במים 63X C-Apochromat, NA 1.2.
כתם איתור 3. המערבי של pSTAT3 רמה
- תאי זרע HEK293-sorLA (המבטאים רמות אנדוגני של CNTFRα) בצלחת 4-היטב כפי שמוצג באיור 3. התרבות התאים בינוני מלא כאמור לעיל.
- מתן עדתאים הם 50 - 80% ומחוברות.
- הסר בינוני מבארות, ולשטוף פעם PBS, ולהוסיף בינוני מלא טרי עם או בלי 10 ננומטר CLC: CLF-1 אל התאים כמצוין באיור 3. דגירת התאים ב 37 צלזיוס למשך 5 שעות.
- הסר בינוני, לשטוף את התאים פעמיים DMEM unsupplemented (בינוני ריק; ללא FBS ואנטיביוטיקה), ולאחר מכן reincubate התאים למשך 90 דק '(37 ג) במדיום ריק.
- שוב, להסיר את בינונית ומוסיפים בינוני ריק טרי עם או בלי 5 ננומטר CLC: CLF-1 (ליזום זירחון STAT3) כמצוין באיור 3. דגירה במשך 15 דקות ב 37 ג.
- להסיר במהירות הבינוני lyse התאים (1 דק ', 4 ג) על ידי הוספת חיץ תמוגה 1% Triton X-100 (20 mM Tris-HCl, 10 מ"מ EDTA, pH 8.0) השלימו עם קוקטייל מעכב proteinase ו מעכב phosphatase קוקטייל זה טוב. בהמשך לכך, להעביר את lysates התא 1.5 צינורות מ"ל (4 ג).
- העברת 5 μL of כל supernatant לצינורות 1.5 מ"ל חדש - להשתמש בהם כדי למדוד את תכולת החלבון מאוחר יותר (שלב 3.8). מיד, להוסיף למאגר מדגם LDS nonreducing לכל supernatants מערבולת הדגימות.
- מדוד את תכולת החלבון של 5 aliquots μL באמצעות assay חלבון מסחרי על פי פרוטוקול של היצרן.
- Sonicate מדגם ב RT עד שהם כבר לא צמיגות (כ 1 דקות) ולאחר מכן לחמם אותם ב 95 צלזיוס למשך 5 דקות.
- נושא כמות שווה של חלבון מכל מדגם כדי SDS-PAGE 13 ו המערבי סופג 13 ולדמיין את התוכן של pSTAT3 ו STAT3 סך lysates התא באמצעות ארנבת אנטי pSTAT3 (1: 2000) ועכבר אנטי STAT3 (1: 1,000 נוגדנים) לבין הנוגדנים משני עכבר ארנב המתאים צמוד HRP (1: 2,000).
- לכמת את הלהקות ידי צפיפות על פי הפרוטוקול של היצרן.
Representative Results
איור 1 מציג ייצוג סכמטי של זריעת התא CLC: הדגירה CLF-1 בפרוטוקול 1. איור 2 מראה ייצוג סכמטי של זריעת התא Leu / עידוד ו CLC: הדגירה CLF-1 בפרוטוקול 2. איור 3 מראה ייצוג סכמטי של זריעת התא CLC: הדגירה CLF-1 וגירוי באיור 4 פרוטוקול 3. מראה את CLC בתיווך sorLA: downregulation CLF-1-תלוי של CNTFRα. איור 5 מראה את ליזוזומלית אנדוציטוזה ו בתיווך sorLA מיקוד של CNTFRα. איור 6 מציג את התגובה הנמוכה כדי CLC: גירוי CLF-1 לאחר downregulation CNTFRα.
שים לב להקות מסמל CNTFRα-Myc יש צפיפות דומה בזמן אפס, בעוד downregulation של CNTFRα-Myc מודגם על ידי הלהקה החלשה sorLA transfectants after 5 שעות (איור 4). איור 5 מראה כי CNTFRα-Myc שהצטבר LAMP-1 שלפוחית חיובית של תאים שטופלו Leu / עידוד. בניגוד לכך, לא הצטברות של CNTFRα-Myc נתפסת בתאים לא ליחס Leu / עידוד. מכך ניתן להסיק כי CNTFRα-Myc ממוינת כדי lysosomes והשפילו. כפי שניתן לראות באיור 6, רמת pSTAT3 מצטמצם משמעותית בתאים טרום מגורה לעומת הרמה הממוצעת תאים שלא נחשפו CLC: CLF-1. זהו בהתאם downregulation sorLA בתיווך הנצפה של CNTFRα בתאים טרום מגורה (איור 4).
איור 1: ייצוג סכמטי של זריעת התא CLC: CLF-1 הדגירה בפרוטוקול 1. זרע HEK293-CNTFRα-Myc ו HEK293-CNTFRα-Myc / sorLA תאים בשני 4-גם צלחות (0 ו -5 ח) דגירה תאים עם CLC: CLF-1 כמצוין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: ייצוג סכמטי של זריעת התא Leu / עידוד ו CLC: CLF-1 הדגירה זרע פרוטוקול 2. HEK293-CNTFRα-Myc / תאים sorLA בשקופיות כיסוי בצלחת 4-היטב דגירה תאים עם או בלי Leu / עידוד ו CLC: CLF-1 כמצוין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: ייצוג סכמטי של זריעת התא CLC: הדגירה CLF וגירוי ב זרע פרוטוקול 3. HEK293 תאים-sorLA בצלחת אחת 4-היטב דגירה תאים עם או בלי CLC: (.-exp מראש) CLF-1 עד downregulate CNTFRα ואחריו CLC: גירוי CLF-1 (. Stim) ליזום זירחון STAT3 כמצוין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: תוצאות שהראו כי SorLA מתווכת CLC: downregulation CLF-1-תלוי של CNTFRα. (א) HEK293-CNTFRα-Myc ו (ב) HEK293-CNTFRα-Myc / תאי sorLA הודגרו בהעדר (עמודים לבנים) או נוכחות (עמודות אפורות) של CLC 10 ננומטר: CLF-1. אחרי 0 ו5 שעות, הדגירה הופסקו והתוכן של CNTFRα-Myc המדיום (מ ') וב lysates התא (L) זוהתה על ידי מערבי סופג לכמת ידי צפיפות. הפנלים העליונים להראות תוצאות כתם מערביות מניסויים יציגים ונוגעים הפנלים התחתונים מראים את הרמות המזוהות של CNTFRα-Myc נמצאות lysates התא. הרמות מוצגות ביחס לרמת CNTFRα-Myc ב transfectants היחיד והכפול ב 0 h. כל טור מייצג SEM ± הממוצע (n = 3). p-ערכים מחושבים באמצעות מבחן t. לשכפל לאחר נתון מקורי 13. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5:תוצאות מראה כי SorLA מתווכת אנדוציטוזה ו ליזוזומלית מיקוד של CNTFRα. HEK293-CNTFRα-Myc / תאים sorLA טופלו עם או בלי Leu / עידוד, מודגרות עם 10 CLC ננומטר: CLF-1 עבור 5 שעות, קבוע, ולבסוף מוכתמים באמצעות-CNTFRα אנטי ואנטי-LAMP-1 נוגדנים כמתואר בפרוטוקול 2. ברי סולם: 5 מיקרומטר. לשכפל לאחר נתון מקורי 13. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: downregulation בתיווך SorLA של CNTFRα מלווה תגובה תאית הורידה ל CLC: גירוי CLF-1.
HEK293 תאים-sorLA מולאו מראש וטופחו על ידי העדר או נוכחות של CLC 10 ננומטר: (.-exp מראש) CLF-1 עבור 5 שעות, מורעבים ב blanבינוני k עבור 90 דקות, ולאחר מגורה עם 5 ננומטר CLC: (. Stim) CLF-1 במשך 15 דקות. (משמאל) העמודות מראות את הרמות היחסיות של pSTAT3 בתאים. כל עמודה מייצגת ממוצע ± SEM (n = 3) ביחס לרמת pSTAT3 בתאים preincubated בהעדר CLC: CLF-1 אך מגורה עם CLC: CLF-1. p-value מחושב באמצעות מבחן t. (מימין) את הכתם המערבי מציגה את התגובה של pSTAT3 ו STAT3 שהושגה בניסוי נציג. לשכפל לאחר נתון מקורי 13. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להשתמש במיוחד כדי להדגים את CLC בתיווך sorLA: CLF-1-תלוי downregulation ו ליזוזומלית מיקוד של CNTFRα, כמו גם התגובה נחלש המצורפים CLC: גירוי CLF-1.
שורת תא HEK293 היא מתאימה היטב בפרוטוקול זה, כפי שעשה רק ביטוי אנדוגני קטין של CNTFRα ו sorLA, קלים transfect, מפורשת gp130 / LIFRβ, ויש לי גוף תא גדול, אשר מתאים עבור immunocytochemistry. עם זאת, בתאוריה כל שורת תאים בעלי תכונות דומות אמורה לעבוד גם כן.
יש הפרוטוקול שני שלבים קריטיים. הראשונה נוגעת לשלב 2.3, שבו המדיום Leu / עידוד חייב להיות מוחלף בערך כל 6 שעות במשך 24 שעות. אי ביצוע הוראה זו עלולה לגרום אנזימים ליזוזומלית פעילים ופחות או לא הצטברות לגילוי חלבון lysosomes. השלב הקריטי השני (3.4) חששות שטיפת אפון-הדגירה מראש עם CLC: CLF-1. זה important כדי להסיר כל ליגנד מאוגד, ולאפשר זמן לתאים להתאושש (הימנעות גירוי המשך) ב DMEM unsupplemented (בינוני ריק). פעולה זו תבטיח רמת רקע נמוכה של pSTAT3 במהלך מחדש הגירוי לאחר מכן עם CLC: CLF-1 (שלב 3.5).
יש לציין, איור 6 מראה כי התגובה התאית (pSTAT3) יורדת במקביל downregulation sorLA בתיווך של CNTFRα. יודגש עם זאת, כי למרות תגובה מופחתת בהתאם (וכדי לצפות על) הפחתה של ברכת CNTFRα, שהוא אינו מוכיח כי ביטוי CNTFRα הנמוך לבד מסביר את התגובה התאית המופחתת. לפיכך, שינויים - נובע גירוי מראש או transfection - בכל האלמנטים הפונקציונליים של מסלול איתות זרם pSTAT3 אולי תרמו התגובה השונה.
הרעיון הבסיסי של הפרוטוקול אינו מוגבל particu זהמערכת הקולטן Lar. (. כלומר עוד קו התא, נוגדנים אחרים, הליגנדים אחרים, וכו ') על ידי שינוי פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבוע את downregulation המושרה ליגנד של קולטנים אחרים גם כן - ללא קשר למעורבות sorLA's. עם זאת, ראוי לציין כי ניתוח של-downregulation הקולטן על ידי מערבי סופג מתאים בעיקר עבור קולטנים, למשל, קולטנים מעוגני GPI, אשר תערוכת מחזור איטי על מידה נמוכה של סינתזה חדשה בתאי unstimulated. כך, קולטנים מראה רמה גבוהה של סינתזה חדשה, downregulation הנגרמת ליגנד ניתן יהיה לשלם עבור בסינתזה של קולטנים חדשים. בנסיבות אלה, downregulation של ברכת קולטן ניתן לקבוע במקום באמצעות ניסויי תיוג מטבולית ודופק-מרדף כמתואר 21. לחלופין, נוגדנים עם יוד (רצוי Fc-שברים) כי אינם מפריעים קולטן כריכה יכולים לשמש "תג" את ectodomain של receptאו, ואת downregulation הצפוי ניתן לקבוע מכן על ידי ספירת רדיואקטיבי של גלולה ו המדיום הסלולרי.
מסיבות לוגיסטיות אנו transfected התאים שלנו עם CNTFRα לבנות נושאת תג Myc, ובסופו של הפרוטוקול הנוכחי נוגדן עכבר אנטי-Myc שימש כתם איתור המערבי של הקולטן. לעומת זאת, נוגדן עז נגד CNTFRα שמש immunocytochemistry וסימון כפול כמו LAMP-1 זוהה על ידי נוגדן עכבר - וכמובן להשתמש של שני נוגדני עכבר ראשיים יגרום מכתים נוקב (חופפים) עם נוגדנים משני. שים לב מאז העז נגד CNTFRα גם עובד במערב סופג (לא מוצג), הפרוטוקול יכול בקלות להיות שונה וכן להחיל תאי transfected עם CNTFRα מתויג.
לבסוף, לאחרונה הוכח כי גם sortilin קולטן endocytic נקשר CLC: CLF-1 עם זיקה גבוהה 22. לכן, לא מן הנמנע כי sortilin, כמוsorLA, חיבורים כדי CLC: CNTFRα באמצעות CLF-1 והוא מסוגל לתווך אנדוציטוזה ו ליזוזומלית מיקוד של CNTFRα גם כן. שימוש sortilin במקום sorLA, בפרוטוקול הנוכחי ניתן להשתמש כדי להבהיר את השאלה הזאת.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
| 4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
| Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| Dulbecco Modified Eagle´s Medium (DMEM) | Lonza | BE12-604F/U1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10270106 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
| Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
| Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
| Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
| Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
| Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
| Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
| Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
| Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
| Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
| Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
| Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
| Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
| Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
| Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
| Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
| EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
| cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
| LDS sample Buffer (4x) | Novex | NP0007 | |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | VWR | 97,135,000 | |
| Saponin | Sigma | S7900-100G | |
| Mounting Media | Dako | S3023 |
References
- Elson, G. C., et al. CLF associates with CLC to form a functional heteromeric ligand for the CNTF receptor complex. Nat Neurosci. 3 (9), 867-872 (2000).
- Senaldi, G., et al. Novel neurotrophin-1/B cell-stimulating factor-3: a cytokine of the IL-6 family. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 11458-11463 (1999).
- Elson, G. C., et al. Cytokine-like factor-1, a novel soluble protein, shares homology with members of the cytokine type I receptor family. J Immunol. 161 (3), 1371-1379 (1998).
- Lelievre, E., et al. Signaling pathways recruited by the cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor-1 composite cytokine: specific requirement of the membrane-bound form of ciliary neurotrophic factor receptor alpha component. J Biol Chem. 276 (25), 22476-22484 (2001).
- Zou, X., et al. Neonatal Death in Mice Lacking Cardiotrophin-Like Cytokine (CLC) is Associated with Multifocal Neuronal Hypoplasia. Vet Pathol. 46 (3), 514-519 (2008).
- Forger, N. G., et al. Cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor 1 is an essential trophic factor for lumbar and facial motoneurons in vivo. J Neurosci. 23 (26), 8854-8858 (2003).
- Alexander, W. S., et al. Suckling defect in mice lacking the soluble haemopoietin receptor NR6. Curr Biol. 9 (11), 605-608 (1999).
- DeChiara, T. M., et al. Mice lacking the CNTF receptor, unlike mice lacking CNTF, exhibit profound motor neuron deficits at birth. Cell. 83 (2), 313-322 (1995).
- Crisponi, L., et al. Crisponi syndrome is caused by mutations in the CRLF1 gene and is allelic to cold-induced sweating syndrome type 1. Am J Hum Genet. 80 (5), 971-981 (2007).
- Crisponi, G. Autosomal recessive disorder with muscle contractions resembling neonatal tetanus, characteristic face, camptodactyly, hyperthermia, and sudden death: a new syndrome. Am J Med Genet. 62 (4), 365-371 (1996).
- Sohar, E., Shoenfeld, Y., Udassin, R., Magazanik, A., Revach, M. Cold-induced profuse sweating on back and chest. A new genetic entity. Lancet. 2 (8099), 1073-1074 (1978).
- Guillet, C., et al. Functionally active fusion protein of the novel composite cytokine CLC/soluble CNTF receptor. Eur J Biochem. 269 (7), 1932-1941 (2002).
- Larsen, J. V., et al. Cytokine-Like Factor 1, an Essential Facilitator of Cardiotrophin-Like Cytokine:Ciliary Neurotrophic Factor Receptor alpha Signaling and sorLA-Mediated Turnover. Mol Cell Biol. 36 (8), 1272-1286 (2016).
- Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function. Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).
- Jacobsen, L., et al. Molecular characterization of a novel human hybrid-type receptor that binds the alpha2-macroglobulin receptor-associated protein. J Biol Chem. 271 (49), 31379-31383 (1996).
- Nielsen, M. S., et al. Sorting by the cytoplasmic domain of the amyloid precursor protein binding receptor SorLA. Mol Cell Biol. 27 (19), 6842-6851 (2007).
- Jacobsen, L., et al. The sorLA cytoplasmic domain interacts with GGA1 and -2 and defines minimum requirements for GGA binding. FEBS Lett. 511 (1-3), 155-158 (2002).
- Klinger, S. C., et al. SorLA regulates the activity of lipoprotein lipase by intracellular trafficking. J Cell Sci. 124 (7), 1095-1105 (2011).
- Kitago, Y., et al. Structural basis for amyloidogenic peptide recognition by sorLA. Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 199-206 (2015).
- Quistgaard, E. M., et al. Ligands bind to Sortilin in the tunnel of a ten-bladed beta-propeller domain. Nat Struct Mol Biol. 16 (1), 96-98 (2009).
- Larsen, J. V., et al. Human sorCS1 binds sortilin and hampers its cellular functions. Biochem J. 457 (2), 277-288 (2014).
- Larsen, J. V., et al. Sortilin facilitates signaling of ciliary neurotrophic factor and related helical type 1 cytokines targeting the gp130/leukemia inhibitory factor receptor beta heterodimer. Mol Cell Biol. 30 (17), 4175-4187 (2010).
