Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie Western-Blotting und Immunzytochemie mit der Hemmung der lysosomalen Enzymen in Kombination verwendet werden, können die Herunterregulierung von Ciliary Neurotrophic Factor Receptor-α (CNTFR & agr;) zu demonstrieren, die durch die Wechselwirkung zwischen Cytokine-like factor-1 (CLF-1 gefördert wird, ) und der endozytotischen Rezeptors sorLA.
Abstract
Das heterodimere Cytokin Cardiotrophin-like Cytokine: Zytokin-like factor-1 (CLC: CLF-1) zielt die Glycosylphosphatidylinositol (GPI) CNTFR & agr; -verankertes eine trimere Komplex zu bilden, der anschließend rekrutiert gp130 / Leukemia Inhibitory Factor Receptor-β (gp130 / LIFR & beta;) für Signalisierung. Sowohl CNTFR & agr; CLC und sind notwendig für die Signalisierung aber bisher CLF-1 wurde nur als putative Facilitator von CLC Sekretion bekannt. Es hat sich jedoch kürzlich gezeigt worden, dass CLF-1 enthält drei Bindungsstellen: eine für CLC; eine für CNTFR & agr; (dass die Montage des trimeren Komplexes fördern kann); und eine für den endozytischen Rezeptor sorLA. Die letztere Seite bietet eine hochaffine Bindung von CLF-1, CLC: CLF-1, sowie die trimere (CLC: CLF-1: CNTFR & agr;) -Komplex zu sorLA und in sorLA-exprimierenden Zellen, die löslichen Liganden CLF-1 und CLC : CLF-1 werden schnell aufgenommen und verinnerlicht. In Zellen CNTFR & agr; und sorLA co-exprimierenden, CNTFR & agr; bindet ersten CLC: CLF-1 zu bilden,ein membranassoziiertes trimere Komplex, aber auch eine Verbindung über die freie sorLA-Bindungsstelle in CLF-1 bis sorLA. Als Ergebnis CNTFR & agr;, die von sich aus keinen Platz für die Endozytose aufweist, zog entlang und durch die sorLA-vermittelte Endozytose internalisiert CLC: CLF-1.
Das vorliegende Protokoll beschreibt die experimentellen Verfahren verwendet i zu demonstrieren) die sorLA-vermittelte und CLC: CLF-1-abhängige Herunterregulieren der Oberflächenmembran CNTFR & agr; Ausdruck; ii) sorLA vermittelte Endozytose und lysosomalen von CNTFR & agr; ausgerichtet sind; und iii) die abgesenkte zelluläre Antwort auf CLC: CLF-1-Stimulation auf sorLA vermittelte Herunterregulieren der CNTFR & agr;.
Introduction
Die CLC und CLF-1 bilden die beiden Untereinheiten des heterodimeren Cytokins CLC: CLF-Januar 1-3. Für zellulären Signal Induktion, CLC: CLF-1 erste Ziele der CNTFR & agr;, ihren primären und GPI-Anker-Rezeptor, ein membrangebundenes trimere Komplex zu bilden. Die CLC: CLF-1: CNTFR & agr; Komplex anschließend rekrutiert gp130 / LIFR & beta; die Trans über die Janus - Kinase / Signalgeber und Aktivatoren der Transkription 3 (JAK / STAT3) -Weg 4 Signalisierung vermittelt. Mäuse defizient in einer der drei Untereinheiten zeigen ein und denselben Phänotyp und sterben innerhalb von 24 h nach der Geburt aufgrund einer reduzierten Anzahl von Gesichts Neuronen und unzureichende Säugen 5-8. Befunde beim Menschen ebenfalls unterstreichen den funktionalen Zusammenhang der drei Untereinheiten. So menschliche Mutationen (homozygot oder Verbindung) verursacht Dysfunktion von CLC: CLF-1 oder CNTFR & agr;, alle Ergebnis in der sogenannten kälteinduzierten Schwitzen / Crisponi-Syndrom, einer durch Symptome wie impai gekennzeichnet istrot Säugen und Schlucken, verschiedene Dysmorphiezeichen, Temperaturspitzen und paradox und perfuse bei niedrigen Temperaturen 9-11 Schwitzen.
In vitro ist die Kombination von CLC und CNTFR & agr; sowohl notwendig als auch ausreichend für die Interaktion mit gp130 / LIFR & beta; und der Induktion von Signalisierungs in Zellen 12. Die Rolle der CLF-1 auf der anderen Seite ist weniger klar. Es ist nicht direkt in Signalgebung beteiligt, und ist seit langem als Anhang angesehen worden , die hauptsächlich die zelluläre Sekretion von CLC 1 zu erleichtern , dient. jüngsten Ergebnisse zeigen jedoch, dass CLF-1 hat zusätzliche und wichtige Funktionen Verwicklung sowohl die Signalisierung und einem Umsatz von CLC und CNTFR & agr;. So scheint es, dass CLF-1 drei unabhängigen Bindungsstellen enthält: eine für seine gut bekannt CLC binden; eine, die auf die CNTFR & agr; die direkte Bindung vermittelt; und eine dritte (hohe Affinität) -Stelle für die Wechselwirkung mit dem Rezeptor endocytic sorLA. Da beide CLC und CLF-1 scheinen & #160; CNTFR & agr; mit einem beträchtlichen niedrigeren Affinität als die CLC Ziel: CLF-1 - Komplex, ist es denkbar , dass CLF-1 (über seine CNTFR & agr;-Bindungsstelle) , die Vereinigung und CNTFR & agr; CLC fördert und erleichtert dadurch 13 signalisiert.
CLF-1-Interaktion mit sorLA, das Hauptproblem der vorliegenden Präsentation, spielt eine ganz andere Rolle. SorLA ist eine der fünf Typ - 1 - Rezeptoren, die die Vps10p-Domäne - Rezeptor - Familie 14 bilden. Es wird in einer Vielzahl von Geweben exprimiert , aber insbesondere in Gehirn- und neuronalen Geweben 15. Ähnlich wie bei den anderen Familienmitgliedern sorLA trägt einen N-terminalen Liganden Vps10p-Bindungsdomäne, sondern darüber hinaus umfasst es auch andere Domain - Typen einschließlich Ligand-bindenden Elemente in Mitglieder des Low-Density - Lipoprotein - Rezeptor - Familie 15 gefunden. Ihre zytoplasmatischen Schwanz interagiert mit mehreren Adapterproteine, beispielsweise Adaptor - Protein-1 und -2 und sorLA vermittelt effiziente endocytosist sowie intrazelluläre Sortierung und Transport von gebundenen Proteine 16-18. Die Vps10p-Domäne umfasst eine große zehn beschaufelten β-Propeller 19,20, die eine Reihe von nicht verwandten Liganden einschließlich CLF-1 bindet (aber insbesondere nicht CLC) 13. Die Bindungsstelle in CLF-1 ist zugänglich , auch nach der Komplexbildung mit CLC und CNTFR & agr; das bedeutet , dass sorLA nicht nur frei CLF-1 bindet, aber auch CLC: CLF-1 und die trimere Komplex CLC: CLF-1: CNTFR & agr; 13. SorLA vermittelt rasche Endocytose von CLF-1 und CLC: CLF-1, aber diese sind lösliche Proteine während CNTFR & agr; an die Oberflächenmembran durch einen GPI-Anker befestigt ist. Die Frage ist daher, ob die Bindung von CLC: CLF-1: CNTFR & agr; sorLA ermöglicht den gesamten Komplex zu internalisieren und dadurch die Oberflächenmembran-Expression von CNTFR & agr; (und die nachfolgende zelluläre Anfälligkeit für CLC: CLF-1-Signal Induktion) zu verändern und / oder der Umsatz von CNTFR & agr;.
Die Experimente in der Gegenwart beschriebenBericht wurden entwickelt, um die folgenden Fragen zu klären:
Hat sorLA CLC vermitteln: CLF-1-abhängige Herunterregulieren der Oberflächenmembran CNTFR & agr;? Um dies zu verdeutlichen, wurde sie zunächst versucht , den Umsatz von CNTFR & agr; (in der Abwesenheit und Anwesenheit von sorLA) mittels metabolischer Markierung und Puls-Chase - Experimente , um zu bestimmen , wie in 21 beschrieben. Jedoch versucht CNTFR & agr; unter Verwendung einer Mischung von [S 35] Cystein und [S35] Methionin zeigten schlechte Inkorporation von Radioaktivität zu etikettieren. Dies legte nahe, einen sehr niedrigen Grad der new-Synthese, die aller Wahrscheinlichkeit nach nicht in der Lage sein würde, für einen plötzlichen und erheblichen Verlust von Rezeptoren zu kompensieren. Um festzustellen, ob CNTFR & agr; nach unten reguliert wurde, wenn über CLC miteinander verbunden sind: CLF-1 bis sorLA, es wurde daher beschlossen, einfach zu messen (unter Verwendung von Western-Blot), um den gesamten zellulären Pool von CNTFR & agr; vor und nach der Exposition gegenüber CLC: CLF-1 - und vergleichen Sie die Ergebnisse in Zellen transfiziert oder nicht transfiziert mitsorLA.
Hat sorLA CNTFR & agr; zu Lysosomen Ziel? Um diese Frage zu beantworten, die Lokalisierung von CNTFR & agr; - über seine CLC verinnerlicht: CLF-1-vermittelten sorLA Bindung - wurde mit Immunzytochemie untersucht, und die Kennzeichnung mit Antikörpern gegen CNTFR & agr; und der spät Endosomen / Lysosomen Marker lysosomale-assoziierten Membrane Protein 1 (LAMP-1). Das Experiment wurde an Zellen durchgeführt, sowie unbehandeltem mit Inhibitoren von lysosomalen Enzymen behandelt. Die Idee war natürlich, dass, wenn CNTFR & agr; in Lysosomen abgebaut wurde, mit Enzym-Inhibitoren behandelten Zellen würden CNTFR & agr;-Färbung der sich in den LAMP-1-positive Vesikel präsentieren, während unbehandelte Zellen wenig oder keine Färbung für CNTFR & agr; zeigen würde.
CLF-1-Stimulation: Hat CNTFR & agr; Herabregulation der zellulären Antwort auf CLC senken? Der trimere Komplex, bestehend aus CLC, CLF-1 und CNTFR & agr; Signale über den gp130 / LIFR & beta; Heterodimer die JAK / STAT3 mitWeg. Entsprechend reagieren die Fähigkeit der Zellen zu CLC: CLF-1-Signalisierung auf Herabregulation von CNTFR & agr; durch Western-Blot-Nachweis und die Quantifizierung des phospho-STAT3 (pSTAT3) / Gesamt STAT3 Ebene in sorLA Transfektanten erforscht.
Protocol
1. Western Blotting von CNTFR & agr; Lysate
- Express in voller Länge sorLA und Myc-markierte CNTFR & agr; Konstrukte in humanen embryonalen Nieren-293 (HEK 293) Zellen unter Verwendung von pcDNA3.1 / Zeo (-) und pcDNA3.1 / Hyg (-), respectively. Transfizieren die HEK293-Zellen mit den Konstrukten Kommerzielle Transfektionsreagenz nach Hersteller Protokoll. Wählen stabile Klone in Medium , enthaltend 150 ug / ml Zeocin und / oder 500 ug / ml Hygromycin B Gold - 13.
- Seed gleiche Anzahlen von HEK293 Transfektanten exprimieren entweder CNTFR & agr;-Myc oder co-exprimierenden CNTFR & agr;-Myc / sorLA in zwei 4-Well - Platten , wie in 1 gezeigt Kultur die Zellen in Dulbecco Modified Adler Medium (DMEM) , ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (Vollmedium) in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 ° C.
- Warten Sie, bis die Zellen 50-80% konfluent.
- Entfernen Sie das Medium aus derBrunnen, waschen Sie einmal mit Dulbecco Phosphat - gepufferte Saline (DPBS) und frisch mit oder ohne (Kontrolle) 10 nM CLC volle Medium hinzu: CLF-1 , wie in Abbildung 1 dargestellt. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C.
- Nach 0 und 5 h Inkubation erholen das Medium und speichern sie bei 4 ° C in 1,5 ml-Röhrchen. Dann fügen 1% Triton X-100 Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0), ergänzt mit einem Proteinase-Inhibitor-Cocktail zu jeder Vertiefung (1 min, 4 C). Anschließend übertragen die Zelllysate auf 1,5 ml-Röhrchen (4 ° C).
- Drehen Sie die Rohre des Mediums und Zelllysat (3000 × g, 3 min, 4 ° C) und übertragen Sie die Überstände bis 1,5 ml-Röhrchen (4 ° C) enthält. Entsorgen Sie das Pellet. Jeweils 5 ul jeder Zelle Lysatüberstand neue 1,5 ml-Röhrchen - verwenden sie später um den Proteingehalt zu messen (Schritt 1.7). Sofort in den alle den überständen nichtreduzierende LDS-Probenpuffer und die Proben verwirbeln.
- Verwenden Sie die 5 & mgr; l-Aliquots der Prot zu messenein Gehalt in den Überständen Zelllysat Kommerzielle Proteinassay nach Herstellerprotokoll verwendet.
- Erhitzen Sie die Proben bei 95 ° C für 5 min.
- Unterwerfen eine gleiche Menge an Protein aus jeder Probe zu reduzierenden SDS-PAGE 13 und Western - 13 - Blotting und zu visualisieren , den Inhalt sorLA, β-Actin, und CNTFR & agr;-Myc in dem Medium und in den Zell - Lysaten unter Verwendung von Kaninchen - anti-sorLA 16 (5 ug / ml), Maus-anti-β-Actin (0,4 ug / ml) und Maus-Anti-Myc (1 ug / ml) Antikörper und die entsprechenden HRP-verknüpfte Sekundärantikörper (1: 2000).
- Quantifizieren Sie die Bänder durch Densitometrie nach dem Protokoll des Herstellers.
2. Immunzytochemie in Kombination mit lysosomale Hemmstoffe
- Seed HEK293 Zellen , die stabil mit CNTFR & agr;-Myc / sorLA auf Abdeckung gleitet in einer 4-Well - Platte transfiziert , wie in Abbildung 2 dargestellt. Kultur die Zellen in Vollmedium wie oben.
- Warten Sie, bis Zellkonfluenz 20 - 40%.
- Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen und fügen Sie vollen Medium mit oder ohne 50 & mgr; g / ml Leupeptin und Pepstatin A (leu / pep) (hemmt lysosomale Hydrolasen) zu den Zellen , wie in Abbildung 2 dargestellt. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C. Das Medium muss alle 6 h während der folgenden 24 h Inkubation ersetzt werden.
- Nach 24 h Inkubation ersetzen erneut das Medium (mit oder ohne leu / pep) und dieses Mal 10 nM CLC hinzu: CLF-1. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 5 h.
- Waschen Sie die Zellen einmal in PBS und fixieren sie in 4% Paraformaldehyd, pH 7 für 15 min bei RT.
Achtung: Paraformaldehyd ist hochgiftig, sollte der Kontakt mit der Haut, Augen und Schleimhäute. Handschuhe und Schutzbrille sollte innerhalb einer Abzugshaube getragen und Lösungen hergestellt werden. - Waschen Sie die einmal Zellen in PBS und Permeabilisierung der Zellen für 5 min bei RT in Saponin verdünnt in PBS (0,5% Saponin).
- Verdünnte Ziege-Anti-CNTFR & agr; (1 & mgr; g / mL) (insbesonderenicht der Maus-Anti-Myc für Western-Blotting verwendet) und Maus-anti-LAMP-1 (15 ug / ml) Antikörper in 0,5% Saponin und die Zellen mit den Antikörpern für 2 h bei RT inkubiert.
- Waschen Sie die Zellen 4x (5 min) in 0,5% Saponin und Inkubation der Zellen mit Esel anti-Ziege Alexa 488- und Esel anti-Maus-Alexa 568-konjugierten Sekundärantikörper (6 ug / ml) für 2 h bei RT.
- Waschen Sie die Zellen 4x (5 min) in 0,5% Saponin, zweimal in entionisiertem Wasser (1 min), und montieren Sie die Abdeckung gleitet auf Mikroskop Montage Medien Folien verwenden.
- Analysieren Sie den Antikörper-Färbung der Zellen durch konfokale Mikroskopie mit einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop mit einem 63X C-Apochromat Wasserimmersionsobjektiv mit NA 1.2.
3. Western-Blot-Nachweis des pSTAT3 Stufe
- Seed HEK293-sorLA Zellen in einer 4-Well - Platte (die endogenen Konzentrationen von CNTFR & agr; exprimieren) , wie in Abbildung 3 dargestellt. Kultur die Zellen in Vollmedium wie oben.
- Warten Sie, bis dieZellen sind 50-80% konfluent.
- Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen, waschen Sie einmal in PBS, und fügen Sie frisch Medium mit oder ohne 10 nM CLC: CLF-1 zu den Zellen , wie in Abbildung 3 dargestellt. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 5 h.
- Entfernen Sie das Medium, waschen Sie die zweimal Zellen in unsupplementierten DMEM (leeres Medium, ohne FBS und Antibiotika), und dann inkubieren die Zellen für 90 min (37 ° C) in leeres Medium.
- Wieder einmal, entfernen Sie das Medium und fügen Sie frische leeres Medium mit oder ohne 5 nM CLC: CLF-1 (STAT3 - Phosphorylierung zu initiieren) , wie in Abbildung 3 dargestellt. Inkubieren für 15 min bei 37 ° C.
- Schnell das Medium zu entfernen und die Zellen (1 min, 4 ° C) mit einem Proteinase-Inhibitor-Cocktail und einem Phosphatase-Inhibitor durch Zugabe von 1% Triton X-100 Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0), supplementiert lysieren Cocktail zu jeder Vertiefung. Anschließend übertragen die Zelllysate auf 1,5 ml-Röhrchen (4 ° C).
- Jeweils 5 & mgr; l of jeder Überstand auf neue 1,5 ml-Röhrchen - nutzen sie, um den Proteingehalt zu messen, später (Schritt 3.8). Sofort in den alle den überständen nichtreduzierende LDS-Probenpuffer und die Proben verwirbeln.
- Messung des Proteingehalts der 5 & mgr; l Aliquots Kommerzielle Proteinassay unter Verwendung von nach dem Protokoll des Herstellers.
- Beschallen jede Probe bei RT, bis sie nicht mehr viskos (ca. 1 min) und anschließend erwärmen sie bei 95 ° C für 5 min.
- Unterwerfen eine gleiche Menge an Protein aus jeder Probe einer SDS-PAGE 13 und Western - 13 - Blotting und zu visualisieren , den Inhalt pSTAT3 und insgesamt STAT3 in den Zelllysaten unter Verwendung von Kaninchen - anti-pSTAT3 (1: 2000) und Maus - Anti-STAT3 (1: 1,000 ) Antikörper und die entsprechenden HRP-verknüpften Maus und Kaninchen Sekundärantikörper (1: 2000).
- Quantifizieren Sie die Bänder durch Densitometrie nach dem Protokoll des Herstellers.
Representative Results
Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der Zellsäen und CLC: CLF-1 Inkubation in Protokoll 1 Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung der Zellsäen und leu / pep und CLC: CLF-1 Inkubation in Protokoll 2 3 eine schematische Darstellung der Zellsäen und CLC: CLF-1 Inkubation und Stimulation in Protokoll 3. Abbildung 4 zeigt die sorLA-vermittelte CLC: CLF-1-abhängige Herabregulation von CNTFR & agr;. Abbildung 5 zeigt die sorLA vermittelte Endozytose und lysosomale Targeting von CNTFR & agr;. Abbildung 6 zeigt die untere Reaktion auf CLC: CLF-1 - Stimulation nach CNTFR & agr; Herabregulation.
Man beachte, dass Bänder bedeutet CNTFR & agr;-Myc haben ähnliche Dichte zum Zeitpunkt Null, während die Herunterregulierung von CNTFR & agr;-Myc durch die schwächere Bande in sorLA Transfektanten nachgewiesen wird after 5 h (Abbildung 4). 5 zeigt , dass CNTFR & agr;-Myc in LAMP-1 positive Vesikel leu / pep behandelten Zellen angesammelt hat. Im Gegensatz dazu ist keine Akkumulation von CNTFR & agr;-Myc in Zellen gesehen nicht unterworfen leu / pep Behandlung. Dies zeigt, daß CNTFR & agr;-Myc ist Lysosomen sortiert und abgebaut. Wie die Höhe der pSTAT3 in Abbildung 6 zu sehen ist , ist deutlich in pre-stimulierten Zellen reduziert im Vergleich zu dem Niveau in Zellen, die CLC nicht ausgesetzt: CLF-1. Dies ist in Übereinstimmung mit der beobachteten sorLA vermittelte Herunterregulieren der CNTFR & agr; in der Pre-stimulierten Zellen (Abbildung 4).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Zellsäen und CLC: CLF-1 Inkubation in Protokoll 1. Seed HEK293-CNTFR & agr;-Myc und HEK293-CNTFR & agr;-Myc / sorLA Zellen in zwei 4-Well-Platten (0 und 5 h) und inkubieren Zellen mit CLC: CLF-1 angegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Zellsäen und leu / pep und CLC: CLF-1 Inkubation in Protokoll 2. Seed HEK293-CNTFR & agr;-Myc / sorLA Zellen auf Abdeckung gleitet in einer 4-Well - Platte und inkubieren Zellen mit oder ohne leu / pep und CLC: CLF-1 angegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 3: Schematische Darstellung der Zellsäen und CLC: CLF Inkubation und Stimulation in Protokoll 3. Seed HEK293-sorLA Zellen in einem 4-Well - Platte und inkubieren Zellen mit oder ohne CLC: (. Pre-exp) CLF-1 die herunter zu regulieren CNTFR & agr; gefolgt von CLC: CLF-1-Stimulation (. stim) STAT3-Phosphorylierung zu initiieren, wie angegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Ergebnisse zeigen , dass SorLA vermittelt CLC: CLF-1-abhängige Herabregulation von CNTFR & agr;. (A) HEK293-CNTFR & agr;-Myc und (B) HEK293-CNTFR & agr;-Myc / sorLA Zellen wurden in Abwesenheit (weiße Säulen) inkubiert oder in Gegenwart (graue Säulen) von 10 nM CLC: CLF-1. Nach 0 und5 h wurde die Inkubation gestoppt und der Gehalt an CNTFR & agr;-Myc in dem Medium (m) und in den Zelllysaten (l) wurde durch Western Blotting und quantifiziert durch Densitometrie festgestellt. Die oberen Felder zeigen Western-Blot-Ergebnisse aus repräsentativen Experimenten und die unteren Felder zeigen die nachgewiesenen Gehalte an CNTFR & agr;-Myc in den Zelllysaten gefunden. Die Ebenen sind in Bezug auf die in den Einzel- und Doppel Transfektanten bei 0 h CNTFR & agr;-Myc Ebene gezeigt. Jede Spalte stellt Mittelwert ± SEM (n = 3). p-Werte unter Verwendung von t-Test berechnet. Wiedergegeben nach Originalfigur 13. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5:Die Ergebnisse zeigen , dass SorLA Endozytose und lysosomale Targeting von CNTFR & agr; vermittelt. HEK293-CNTFR & agr;-Myc / sorLA Zellen wurden mit oder ohne leu / pep behandelt, inkubiert mit 10 nM CLC: CLF-1 für 5 h, fixiert und schließlich gefärbt mit Anti-CNTFR & agr; und anti-LAMP-1-Antikörper, wie in Protokoll beschrieben 2. Maßstabsbalken: 5 um. Wiedergegeben nach Originalfigur 13. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: CLF-1 - Stimulation: SorLA-vermittelte Herunterregulation von CNTFR & agr; durch eine abgesenkte zelluläre Antwort auf CLC begleitet wird.
(. Pre-exp) CLF-1 für 5 h ausgehungert in blan: HEK293-Zellen wurden sorLA in Abwesenheit oder Gegenwart von 10 nM CLC vorinkubiertk Medium für 90 min und stimuliert mit 5 nM CLC: (. stim) CLF-1 für 15 min. (Links) Die Spalten zeigen die relativen Mengen an pSTAT3 in den Zellen. Jede Spalte stellt Mittelwert ± SEM (n = 3) relativ zu der Ebene pSTAT3 in Zellen in Abwesenheit von CLC vorinkubiert: CLF-1, aber stimuliert mit CLC: CLF-1. p-Wert t-Test berechnet. (Rechts) Der Western - Blot zeigt die Reaktion von pSTAT3 und in einem repräsentativen Experiment erhalten STAT3. Wiedergegeben nach Originalfigur 13. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
CLF-1-abhängige Herabregulation und CNTFR & agr; Targeting lysosomalen sowie die begleitende geschwächt Reaktion auf CLC: Das hier beschriebene Protokoll kann spezifisch das sorLA vermittelte CLC zu demonstrieren verwendet CLF-1 Stimulation.
Die HEK293-Zelllinie ist gut geeignet für dieses Protokoll, da sie nur eine geringe endogene Expression von CNTFR & agr; und sorLA haben, sind einfach zu transfizieren, Express gp130 / LIFR & beta; und haben einen großen Zellkörper, die für die Immunzytochemie geeignet ist. Jedoch kann jede Zelllinie mit ähnlichen Eigenschaften in der Theorie sollte auch funktionieren.
Das Protokoll hat zwei wichtige Schritte. Die erste betrifft Schritt 2.3, bei dem die leu / pep Medium muß ca. alle 6 Stunden für 24 h ersetzt. Geschieht dies nicht, so kann es zu aktiven lysosomale Enzyme und weniger oder keine nachweisbare Anreicherung von Protein in den Lysosomen. Der zweite kritische Schritt (3.4) Bedenken bei Vorinkubation mit CLC Waschen: CLF-1. Es ist imwichtige jeglichen ungebundenen Liganden zu entfernen, und die Zellen Zeit, sich zu erholen (Fortsetzung Stimulation vermieden wird) in nicht ergänztem DMEM (blank Medium). CLF-1 (Schritt 3.5): Dies wird eine geringe Hintergrundpegel von pSTAT3 während der anschließenden Wieder Stimulation mit CLC gewährleisten.
Bemerkenswert ist , Abbildung 6 zeigt , dass die zelluläre Antwort (pSTAT3) nimmt parallel mit der sorLA vermittelte Herunterregulieren der CNTFR & agr;. Es sollte jedoch betont werden, dass, obwohl eine verminderte Antwort gemäß ist mit (und voraussichtlich auf sein) eine Reduzierung des CNTFR & agr; Pool, es beweist nicht, dass die niedrige CNTFR & agr; Expression allein für die reduzierte zelluläre Reaktion ausmacht. Somit können Änderungen - resultierend aus Vorstimulation oder Transfektion - in jedem der Funktionselemente des Signalwegs stromaufwärts pSTAT3 kann der veränderten Reaktion beigetragen haben.
Das Grundkonzept des Protokolls ist nicht auf diese beschränkt insbesonlar-Rezeptor-System. (. Dh eine andere Zelllinie, andere Antikörper, andere Liganden, usw.) durch das Protokoll modifizieren kann verwendet werden , um die Ligand-induzierte Herabregulation von anderen Rezeptoren als auch zu bestimmen - unabhängig von sorLA's Beteiligung. Es sollte jedoch angemerkt werden , dass die Analyse von Rezeptor-Herabregulierung durch Western - Blotting hauptsächlich für Rezeptoren geeignet ist, beispielsweise GPI-verankerten Rezeptoren, die einen langsamen Umsatz und einen geringen Grad an Neusynthese in unstimulierten Zellen aufweisen. Damit eine hohe new-Synthese, Liganden-induzierte Herunterregulation kann kompensiert werden, indem die Synthese neuer Rezeptoren Rezeptoren zeigt. Unter diesen Umständen kann die Herunterregulierung des Rezeptors Pool anstatt durch metabolische Markierung und Puls-Chase - Experimente bestimmt werden , wie in 21 beschrieben. Alternativ jodhaltigen Antikörper (vorzugsweise Fc-Fragmente), die auf "Tag" die Ektodomäne des recept verwendet werden kann, nicht mit Rezeptor stören Bindungoder, und das erwartete Herunterregulierung kann dann durch radioaktive Zählung von Zellpellet und Medium bestimmt werden.
Aus logistischen Gründen transfizierten wir unsere Zellen mit einer CNTFR & agr; konstruieren ein Myc-Tag trägt, und im vorliegenden Protokoll ein Maus-Anti-Myc-Antikörper wurde Western-Blot-Nachweis des Rezeptors verwendet. Im Gegensatz dazu ist ein Antikörper, Ziege-anti-CNTFR & agr; wurde für Immunzytochemie und Doppelmarkierung als LAMP-1, die von einem Maus-Antikörpers nachgewiesen wurde - und natürlich zwei primären Maus-Antikörper verwenden, in unspezifischer (überlappend) Färbung mit sekundärem Antikörper führen würde. Man beachte, dass, da die Ziege anti-CNTFR & agr; arbeitet auch in Western Blot (nicht gezeigt) könnte das Protokoll leicht modifiziert und an Zellen, transfiziert mit CNTFR & agr; unmarkierte angewendet werden.
Schließlich wurde vor kurzem gezeigt worden , dass auch der endozytotischen Rezeptors bindet sortilin CLC: CLF-1 mit hoher Affinität 22. So ist es denkbar, dass sortilin, wiesorLA, Verbindungen zu CLC: CNTFR & agr; über CLF-1 und ist in der Lage Endozytose und lysosomalen von CNTFR & agr; als auch gezielt zu vermitteln. Mit sortilin anstelle von sorLA kann das vorliegende Protokoll verwendet werden, um diese Frage zu klären.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
| 4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
| Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| Dulbecco Modified Eagle´s Medium (DMEM) | Lonza | BE12-604F/U1 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10270106 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
| Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
| Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
| Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
| Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
| Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
| Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
| Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
| Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
| Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
| Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
| Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
| Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
| Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
| Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
| Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
| EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
| cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
| LDS sample Buffer (4x) | Novex | NP0007 | |
| Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | VWR | 97,135,000 | |
| Saponin | Sigma | S7900-100G | |
| Mounting Media | Dako | S3023 |
References
- Elson, G. C., et al. CLF associates with CLC to form a functional heteromeric ligand for the CNTF receptor complex. Nat Neurosci. 3 (9), 867-872 (2000).
- Senaldi, G., et al. Novel neurotrophin-1/B cell-stimulating factor-3: a cytokine of the IL-6 family. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 11458-11463 (1999).
- Elson, G. C., et al. Cytokine-like factor-1, a novel soluble protein, shares homology with members of the cytokine type I receptor family. J Immunol. 161 (3), 1371-1379 (1998).
- Lelievre, E., et al. Signaling pathways recruited by the cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor-1 composite cytokine: specific requirement of the membrane-bound form of ciliary neurotrophic factor receptor alpha component. J Biol Chem. 276 (25), 22476-22484 (2001).
- Zou, X., et al. Neonatal Death in Mice Lacking Cardiotrophin-Like Cytokine (CLC) is Associated with Multifocal Neuronal Hypoplasia. Vet Pathol. 46 (3), 514-519 (2008).
- Forger, N. G., et al. Cardiotrophin-like cytokine/cytokine-like factor 1 is an essential trophic factor for lumbar and facial motoneurons in vivo. J Neurosci. 23 (26), 8854-8858 (2003).
- Alexander, W. S., et al. Suckling defect in mice lacking the soluble haemopoietin receptor NR6. Curr Biol. 9 (11), 605-608 (1999).
- DeChiara, T. M., et al. Mice lacking the CNTF receptor, unlike mice lacking CNTF, exhibit profound motor neuron deficits at birth. Cell. 83 (2), 313-322 (1995).
- Crisponi, L., et al. Crisponi syndrome is caused by mutations in the CRLF1 gene and is allelic to cold-induced sweating syndrome type 1. Am J Hum Genet. 80 (5), 971-981 (2007).
- Crisponi, G. Autosomal recessive disorder with muscle contractions resembling neonatal tetanus, characteristic face, camptodactyly, hyperthermia, and sudden death: a new syndrome. Am J Med Genet. 62 (4), 365-371 (1996).
- Sohar, E., Shoenfeld, Y., Udassin, R., Magazanik, A., Revach, M. Cold-induced profuse sweating on back and chest. A new genetic entity. Lancet. 2 (8099), 1073-1074 (1978).
- Guillet, C., et al. Functionally active fusion protein of the novel composite cytokine CLC/soluble CNTF receptor. Eur J Biochem. 269 (7), 1932-1941 (2002).
- Larsen, J. V., et al. Cytokine-Like Factor 1, an Essential Facilitator of Cardiotrophin-Like Cytokine:Ciliary Neurotrophic Factor Receptor alpha Signaling and sorLA-Mediated Turnover. Mol Cell Biol. 36 (8), 1272-1286 (2016).
- Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function. Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).
- Jacobsen, L., et al. Molecular characterization of a novel human hybrid-type receptor that binds the alpha2-macroglobulin receptor-associated protein. J Biol Chem. 271 (49), 31379-31383 (1996).
- Nielsen, M. S., et al. Sorting by the cytoplasmic domain of the amyloid precursor protein binding receptor SorLA. Mol Cell Biol. 27 (19), 6842-6851 (2007).
- Jacobsen, L., et al. The sorLA cytoplasmic domain interacts with GGA1 and -2 and defines minimum requirements for GGA binding. FEBS Lett. 511 (1-3), 155-158 (2002).
- Klinger, S. C., et al. SorLA regulates the activity of lipoprotein lipase by intracellular trafficking. J Cell Sci. 124 (7), 1095-1105 (2011).
- Kitago, Y., et al. Structural basis for amyloidogenic peptide recognition by sorLA. Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 199-206 (2015).
- Quistgaard, E. M., et al. Ligands bind to Sortilin in the tunnel of a ten-bladed beta-propeller domain. Nat Struct Mol Biol. 16 (1), 96-98 (2009).
- Larsen, J. V., et al. Human sorCS1 binds sortilin and hampers its cellular functions. Biochem J. 457 (2), 277-288 (2014).
- Larsen, J. V., et al. Sortilin facilitates signaling of ciliary neurotrophic factor and related helical type 1 cytokines targeting the gp130/leukemia inhibitory factor receptor beta heterodimer. Mol Cell Biol. 30 (17), 4175-4187 (2010).
