Abstract
Bone dannende osteoblasts samhandle med bein-resorbering osteoklaster å samordne omsetningen av bein matrise og å kontrollere skjelett homeostase. Medaka og sebrafisk larvene blir mye brukt til å analysere oppførselen til benceller i løpet av bendannelse, degenerasjon, og reparasjon. Deres optisk klarhet tillater visualisering av fluorescensmerkede benceller og fluorescerende fargestoffer bundet til mineralisert skjelettmassen. Vårt laboratorium har generert transgen medaka fisk som uttrykker osteoklast-induserende faktor-reseptor-aktivatoren fra Nuclear-faktor kB Ligand (RANKL) under kontroll av en varmesjokk-induserbar promoter. Ektopisk ekspresjon av RANKL resulterer i at det dannes av aktiverte osteoklaster, som kan visualiseres i reporter linjer med nlGFP ekspresjon under kontroll av cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induksjon og ektopisk osteoklastdannelse fører til alvorlig osteoporose-lignende fenotyper. Forbindelse transgen medaka lines som uttrykker ctsk: nlGFP i osteoklaster, samt mCherry under kontroll av den osterix (osx) promoter i premature osteoblaster, kan brukes til å studere interaksjonen mellom begge celletyper. Dette letter in vivo observasjon av cellulær oppførsel under betingelser med ben degenerasjon og reparasjon. Her beskriver vi bruken av dette system for å teste et medikament som vanligvis brukes i human terapi av osteoporose og beskriver en protokoll for direkte avbildning. Den medaka modell utfyller studier i cellekultur og mus, og har et nytt system for in vivo-analyse av legemiddelvirkning i skjelettsystemet.
Introduction
Virveldyr skjelett gir strukturell støtte og beskyttelse for organene, tillater bevegelighet, og tjener som en kilde til kalsium. Gjennom hele livet, er det ekstracellulære beinmatriksen kontinuerlig slått over til å opprettholde bein stabilitet og stivhet. Denne prosessen krever tett koordinert aktivitet og samspill av bendannende osteoblaster og ben-resorberende osteoklaster. Osteoblaster er avledet fra multipotente mesenkymale progenitorer og produserer kollagen for å danne osteoid, den proteinholdige del av benmatrise 10. Osteoblaster samhandler med osteoklaster for å oppnå en balansert aktivitet av begge celletyper, noe som er nødvendig for å styre benet homeostase 7. På grunn av disse intrikate regulatoriske interaksjoner, tiltak mot narkotikabehandling og bein homeostase kan ikke fullt ut undersøkt ved hjelp av in vitro studier. Derfor er det et sterkt behov for dyremodeller. Sammenlignet med de cellekultur innstillinger, in vivo-modeller kan giverdifull innsikt i flercellede nettverk i beinet miljø.
Tallrike musemodeller eksisterer for en rekke humane bensykdommer, inkludert osteoporose 16. Men størrelsen og tilgjengeligheten av museembryoer representerer betydelige begrensninger for live avbildning av skjelett prosesser. Små beinfisk, på den annen side tjener som et attraktivt alternativ for in vivo avbildning. Sebrafisk (Danio rerio) og medaka (Oryzias latipes) har blitt populære dyremodeller for skjelettundersøkelser i løpet av de siste to tiårene 17, 19, 22, 24. Ben i teleost-fisk og pattedyr er meget lik, både på en strukturell og på en fysiologisk nivå, og mange av de viktige regulatoriske gener og signaliseringsveier er konservert 3. Som hos pattedyr, teleost fish regulere aktiviteten til osteoblaster og osteoklaster for å balansere bendannelse og resorpsjon 26 nøye. Viktigst, den optiske klarheten av fish larver tillater bruk av fluorescerende reportere å merke benceller og forkalket skjelett matrise 8, 9, 12, 21, 23, som muliggjør observasjon av cellulære prosesser i levende dyr. I tillegg har en rekke genetiske verktøy blitt generert for å forenkle biomedically relevant forskning på fisk. For medaka spesielt, metoder for målrettet genmutasjon av CrispR / Cas9 2, celle-avstamning tracing 6, og stedsspesifikke transgenesis 14 har nylig blitt etablert, og er nå mye i bruk 15.
Liten teleost larver har blitt brukt for kjemiske skjermer, noe som førte til oppdagelsen av flere farmakologisk relevante legemidler 1, 18.
Fiskelarver er tolerante overfor lave konsentrasjoner av DMSO og er i stand til å absorbere forbindelser fra deres vannmiljøet, enten gjennom huden eller gjennom mage-tarmkanalen 1, 5. Vår lab tidligere repunderstøttes transgene Medaka linjer som uttrykker fluorescerende reportere i beinceller under kontroll av ulike osteoblast- og osteoklastene spesifikke arrangører. Disse inkluderer premature osteoblaster (kollagen 10A1, col10a1, osterix, OSX) 20, 21, modne osteoblaster (osteocalcin OSC) 27, og osteoklaster (cathepsin K, ctsk) 24. Vi har også generert en transgen linje som uttrykker osteoklast-induserende faktor-reseptor-aktivatoren fra Nuclear-faktor kB Ligand (RANKL) under kontroll av en varmesjokk-induserbar promoter 24.
Induksjon av RANKL i dette systemet resulterer i en ektopisk dannelse av aktive osteoklaster. Dette fører til økt benresorpsjon og en alvorlig osteoporose-lignende fenotype, med drastisk redusert mineralisering i ryggvirvel organer. Vi har nylig viste at osteoclastaktivitet i denne modellen kan bli blokkert av bisfosfonater etidronate og alendronat, two legemidler som vanligvis brukes i human osteoporoseterapi, således validere medaka som et passende modellsystem for osteoporose 27.
På grunn av sin store kullstørrelse, rask utvikling, og liten størrelse av befruktede egg, transgen medaka larvene er unikt egnet for storskala screening for osteoporose narkotika og for in vivo-analyse av bein celle atferd. Studier i medaka dermed effektivt kan utfylle eksperimenter i cellekulturer og i mus som er rettet mot å finne nye terapeutiske mål og nye behandlingsformer for menneske skjelett.
I denne studien beskriver vi en protokoll for å behandle medaka bein-reporter larver med felles osteoporose narkotika, alendronat. Vi beskriver også i detalj hvordan behandlet larver er montert og klargjort for live avbildning av bein matrise og beinceller. Disse protokollene kan lett tilpasses andre små kjemiske forbindelser som enten arbeid som bein anabole eller antiresorptive narkotika. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøkene ble utført i henhold til godkjente Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) protokoller fra National University of Singapore (R14-293).
1. Fisk Husbandry og innsamling av embryoer
- Hev WT, ctsk: nlGFP 24, RANKL: HMS: CFP 24, og osx: mCherry 21 enkelt- eller sammensatte-transgen medaka fisk ved 26 ° C under en kontrollert lys syklus (14 t lys, 10 timer mørke) for å indusere gyting.
- Daglig gyting foregår i løpet av første 30 min etter at lyset er slått på. Eggene holde sammen gjennom filamenter og fest til kvinnens underliv i flere timer. Bruk en finmasket nett for å fange en kvinnelig voksen bærer et egg klynge. La fisken kort hvile i nettet, og deretter forsiktig massasje fiskens buk å nøye strippe det befruktede egget klyngen fra magen av den kvinnelige.
MERK: En sunn medaka kvinneligkan fremstille 10 - 20 egg hver dag i omtrent 5 måneder. - Sett eggene i en 60 mm plast petriskål. Bruk en plastpipette å skylle embryoene med 5 - 10 mL 0.3x Danieau løsning (fisk medium; 19,3 mM NaCl, 0,23 mM KCl, 0,13 mM MgSO4, 0,2 mM Ca (NO 3) 2 og 1,7 mM HEPES, pH 7,0). Tilsett 1 ml av en 0,25% (w / v) metylen blå lagerløsning til 2,5 l av fisk medium for å forhindre soppvekst.
- Forsiktig rulle egg klynge for å danne en knute av festefilamenter. Bruk pinsett til å forsiktig fjerne festefilamenter fra det befruktede egget klynger for å få enkelte embryoer (Figur 1a).
- Stage embryoene i henhold til Iwamatsu 2004 13.
- Kultur 20 - 30 embryoer per 60 mm plast petriskål i en 28 ° C inkubator. Endre medium daglig for å sikre normal utvikling av embryoer.
MERK: Tiden rundt klekkestadiet (8-9 d postfertilization,DPF) er spesielt kritisk for å overleve. Fjern frittflytende chorions å holde mediet rent og for å sikre gode larver overlevelse.
2. Transgene Embryo Screening
- Bruk en stereomikroskop utstyrt med en kvikksølvlampe for fluorescens bildebehandling og GFP, RFP og CFP filtrene til å screene transgene embryoer for fluorescerende reporter uttrykk ved hjelp 40X forstørrelse.
- Visuelt identifisere osx: mCherry embryoer ved mCherry reporter uttrykk i tidlig dannende kraniale bein, for eksempel cleithrum, på begge sider av bakre hodet (figur 1B, pil), og parasphenoid, i en sentral posisjon i ventral kraniet ( Figur 1B, pilspiss).
MERK: Reporter uttrykk starter fra 5 DPF utover 21. - Identifiser ctsk: nlGFP embryoer ved sterk nlGFP uttrykk i hodet (figur 1C, pil) og hale (figur 1C, pilspiss), fra6 DPF.
MERK: Endogene osteoklaster bare danne etter 21 DPF. nlGFP-uttrykke celler på dette tidlige stadiet (6 DPF) er ikke osteoklaster, men andre, så langt uncharacterized, ctsk-positive celler 24. - Identifisere RANKL: HMS: CFP transgene embryoer etter allestedsnærværende CFP uttrykk etter en kort varmesjokkbehandling i 20 minutter ved 39 ° C, utføres ved to DPF eller senere for screeningformål.
MERK: RANKL og CFP transgener er under kontroll av den samme toveis Heat Shock element (HSE). CFP uttrykk indikerer vellykket RANKL induksjon 24. - Utfør en 1,5 til 2 h varmesjokkbehandling på 9 DPF eller nyere for å indusere et stort antall ektopisk osteoklaster i bagasjerommet regionen, som dermed resulterer i en osteoporose-lignende fenotype 24.
MERK: Transgene RANKL uttrykk indusert 9 DPF resultater i en graviditet utenfor aktivering av sovende osteoclast stamceller, som endogent ikke utløsesfør 21 DPF. Bruke et vannbad for å oppnå en stabil 39 ° C forhold. La petriskål inneholdende medakafostre flyter på vannoverflaten. Pass på at lokket på petriskålen er tørr å hindre senkingen av parabolen. - Screen embryoer fra sammensatte linjer, for eksempel RANKL: HMS: CFP / ctsk: nlGFP dobbelttransgene og osx: mCherry / RANKL: HMS: CFP / ctsk: nlGFP trippel-transgene, i henhold til uttrykket mønster av hver enkelt transgenet.
MERK: hemizygous og homozygote transgene embryoer ble preget av ulike fluorescens nivåer av reporteren transgenet. Homozygot embryoer hadde en fluorescens intensitet som omtrent ble doblet sammenlignet med hemizygous transgene. Sammensatte linjer som var homozygot for begge RANKL: HMS: CFP og ctsk: nlGFP ble oppnådd ved gjentatt incrossing over flere generasjoner. For trippel-transgen osx: mCherry / RANKL: HMS: CFP / ctsk: nlGFP fisk, homozygot RANKL: HMS: CFP / ctsk: nlGFP fisk ble krysset med homozygot osx: mCherry bærere. Den resulterende heterozygot triple-transgen avkom ble hevet og incrossed å skaffe embryoer homozygote for RANKL: HMS: CFP. Den RANKL: HMS: CFP transgen må være homozygot for å oppnå effektiv induksjon av ektopisk osteoklaster.
Figur 1: WT og transgene medakafostre på 7 D Postfertilization (DPF). A. WT embryoer observert med lysfelt belysning. B. Transgene embryoer som viser osx: mCherry uttrykk rundt cleithrum (pil) og parasphenoid (pilspiss). C. Transgene embryoer som viser ctsk: nlGFP uttrykk i hodet (pil) og hale (pilspiss). Skala barer: 500 mikrometer.025 / 55025fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. bisfosfonatbehandlingen av Medaka Larver
- Forbered løsninger som inneholder ulike konsentrasjoner av bisfosfonater (bps) for dose-responsstudier.
MERK: eksemplarisk BP brukt i denne protokollen er alendronat.- Oppløs alendronat i fisk medium ved en konsentrasjon på 100 ug / ml for å fremstille en stamoppløsning.
- Bruke en vortex-blander for å sikre fullstendig oppløsning. Oppbevar stamløsning ved 4 ° C.
- Fremstille forskjellige arbeids oppløsninger ved å fortynne stamløsningen med fisk medium til en serie av konsentrasjoner (det vil si, 25, 37,5, 50, 62,5 og 75 ug / ml).
MERK: Ulike medikamenter kan ha ulike absorpsjon, distribusjon, metabolisme og utskillelse (ADME) parametere som må vurderes under testing ved hjelp av denne medaka larver system. Dessuten kan stoffet oppløselighet og stabilitet variere nårpåført som en vandig oppløsning. Mindre vannoppløselige forbindelser som kanskje må først bli oppløst i organiske oppløsningsmidler, slik som DMSO. I dette tilfellet er en stamoppløsning fremstilt i DMSO, som deretter ytterligere fortynnet i fisk medium. Legg merke til at arbeids oppløsninger i vann (fisk medium) kan lagres i kjøleskap i flere wk. Imidlertid må oppløsninger inneholdende DMSO oppbevares ved romtemperatur for å hindre krystallisering.
- Overføring medaka larver i seks-brønns plater (seks larver / brønn) for etterfølgende BP (alendronat) behandling.
- Ta fisken medium forsiktig med en ren plast pipette og legge et lite volum (ca. 0,5 ml) av alendronat løsning til hver brønn.
- Unngå left fisk medium, som den ekstra BP løsning kan bli utvannet, noe som er spesielt viktig for mindre konsentrerte alendronat løsninger.
- Fjerne en liten mengde av alendronat-løsning (opp til 0,5 ml) fra hver brønn med en ren plastpipette og erstatte den med en større volumeg (4 ml) av alendronat-løsning.
- Endre medium daglig for å sikre normal embryo utvikling.
4. Levende Farging av mineralisert bein Matrix
- Oppløs 0,5 g av Alizarin complexone (ALC, alizarin-3-methyliminodiacetic syre) eller 0,05 g av calcein i 50 ml fisk medium for å fremstille 1% og 0,1% stamløsninger, henholdsvis. Bruke en vortex-blander for å sikre fullstendig oppløsning.
MERK: Fisk medium uten tilsetning av metylenblått er brukt i dette og de etterfølgende trinn for å redusere autofluorescens i larvene. - Bruke en sprøyte og engangsfilter (0,2 pm) for å filtrere den fargeløsning. Lagre den filtrerte oppløsningen i mørke ved RT.
MERK: Fargen på filtrert klar ALC farging løsningen er mørk gul til oransje. Fargen av den filtrerte, klare oppløsning calcein er lys gul. Oppløsninger kan anvendes i flere måneder. - Fortynn filtrert ALC eller calcein stamløsning 1:10 i fisk mediumog inkuber medaka larver i 1,5 - 2 timer (0,1% ALC oppløsning) eller 2 - 2,5 timer (0,01% calcein oppløsning) i en 28 ° C inkubator hvis larver mellom 9 og 17 DPF anvendes. Hold prøvene i mørket.
- Overfør larvene til fersk fisk medium med en ren plast pipette.
- Ta fisken medium med en ren plast pipette og tilsett fersk fisk medium. Gjenta dette trinnet for 3 - 4 ganger til ingen rød- eller gul-farget løsning (ALC eller calcein, henholdsvis) er igjen over. La larvene i fisk medium i 30 - 60 min før de monteres for bildebehandling for å unngå epifluorescence fra mediet.
MERK: 0,1% ALC farging løsningen er skadelig for medaka larver i lengre eksponeringstider. Inkubasjonstider på mer enn 2 timer påvirke overlevelsen av larvene. Konsentrasjon og farging tid må derfor være optimalisert for ulike trinn for å oppnå optimale embryo overlevelse og fargingsresultater.
5. Levende Fluorescens Imaging p>
- Bedøve medaka larvene med 0,01% Tricaine (etyl-3-aminobenzoat metansulfonat) i fisk medium.
MERK: bedøves larver blir immobilisert etter 5-10 min i Tricaine løsning og vanligvis blir liggende enten på sine sider eller ryggen. - Bruk en plast microloader å orientere larvene i henhold til regionen av interesse. Orienteringen av larvene anvendt i denne protokollen er sideveis.
- Bruk en stereomikroskop med fluorescens belysning for bildebehandling. Bruk høy forstørrelse når du tar bilder, med fokus på ulike deler av larver (hode, anterior trunk, posterior bagasjerommet, og hale). Stitch enkeltbilder sammen i overlappende områder ved hjelp av et egnet bildebehandlingsprogramvare (innfellinger i figur 3G).
MERK: Dette bidrar til å forbedre bildekvaliteten av alle relevante kroppsdeler i riktig fokusplan. - Returner larvene til fisken medium for gjenoppretting etter bildebehandling.
- Anesthetize larver med 0,01% Tricaine i fisk medium i 5 - 10 min til de blir immobilisert.
- Oppløs lavtsmeltende agarose til 1,5% i fiske medium ved oppvarming i en mikrobølgeovn. Cool denne løsningen til ca 30 ° C.
- Legg 0,5 til 1 ml flytende 1,5% lavtsmeltende agarose i fisk medium til en glass-bunn petriskål. Overfør bedøvet larver i løsningen ved anvendelse av en ren plastpipette.
MERK: ta spesielle forholdsregler at temperaturen av det flytende lavtsmeltende agarose er lav nok til ikke å skade den larver. - Før agarose størkner ved å bruke en plast microloader å presse larvene til bunnen av petriskålen og orientere larvene i henhold til området av interesse. Orienteringen av larvene anvendt i denne protokollen er sideveis.
MERK: Prøvene er klare for konfokal levende avbildning etter agarose helt stivner. - Bruk en konfokalmikroskop til ACQuire bilder.
- Bruk en 543 nm laser linje for mCherry og ALC farging analyser. Bruk en 488 nm laser linje for nlGFP og calcein farging analyser.
- Etter bildebehandling, legg fisken medium til petriskål og bruke et par av fine sprøyte nåler (27 G x 1 ½ ") for å fjerne larvene nøye fra agarose. Overfør larvene med residualt festet agarose til en petriskål med fisk medium for å gjenopprette .
- Behandle bildene ved hjelp av en bildeanalyse programvare 27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rikelig egg tall, samt den lille størrelsen på larvene, gjør medaka en utmerket modell for medikament-screening. En enkelt seks-brønns plate ble anvendt for å dyrke opp til 36 larver, som var tilstrekkelig til å tilveiebringe statistisk signifikante data. En annen stor fordel med å bruke fisk for skjelettanalyse er muligheten for å gjøre levende avbildning. Gjennomsiktigheten av fiskelarver tillater bruk av fluorescerende proteiner for å merke benceller, så vel som anvendelsen av fargestoffer som binder seg til benmatrise for å visualisere mineralisering. Fiskelarver er enkle å håndtere, og prøveopparbeidelse for bildebehandling er enkel (figur 2).
En RANKL: HMS: CFP / ctsk: nlGFP dobbelttransgene linjen ble brukt til å visualisere ektopisk dannelsen av RANKL-indusert osteoklaster. I tillegg osx: mCherry / RANKL: HMS: CFP / ctsk: nlGFP trippel-transgen larver ble brukt for samtidig oppdageion av premature osteoblaster og differensierte osteoklaster (figur 3). Oversikt bildene ble tatt med et stereomikroskop (figur 3A - C og F - H), mens konfokalmikroskopi ble brukt til å visualisere prosesser på cellenivå (Figur 3D, E, I, J pilspisser). ALC-farget benmatriks langs nerve buene (na) og centra (c) (figur 3D) ble anvendt som en referanse for å bestemme posisjonen til fluorescensmerkede benceller (figur 3D og I).
En fordel med samtidig visualisere osteoklaster og osteoblaster i samme intakt larver er at antiresorptive vs. bein-anabole aktiviteter av en testet forbindelsen kan skilles. For dette, er fordelingen av osteoklaster og osteoblaster bestemmes sammen pre-eksisterende og nydannede mineralisert bein matrise. Sucspring farging av bein matrise med ALC (red) (figur 4A, B) etterfulgt av calcein (grønn) (figur 4C, D) avslører de novo mineralisert bein matrise (grønn) (Figur 4E, F pilspisser). Denne analyse gjør det mulig for kvantifisering av hastigheten av bendannelse. Økte de novo priser etter behandling indikere et bein-anabole effekten av testforbindelsen. I kontrast, utholdenhet av eksisterende bein matrix poeng til en antiresorptive aktiviteten til stoffet 27. Både ALC og calcein etiketter i larvene er stabile i minst to uker, slik at en kontinuerlig observasjon av ny bendannelse i medaka larver in vivo.
Figur 2: Prinsippskisse av Drug Treatment, Live ALC Farging og montering for Confocal Levende Imaging. A. En seks-brønns platebrukes for behandling for å sikre tilstrekkelig plass for larvene. Den mineralisert benmatriks-er farget ved å inkubere medaka larver i 0,1% ALC i 1,5 - 2 timer i mørke. Farget larver skylles flere ganger med fisk medium. 0,01% Tricaine blir brukt til å bedøve larver. B. Etter overføringen av bedøvd larver til lunken væske og 1,5% lavtsmeltende agarose, er deres stilling reguleres med et plast microloader. Larvene er så montert i henhold til regionen av interesse (f.eks, er virveldyr kolonnen beste avbildes i sidevisning). Etter at agarose har stivnet, er det montert prøven klar for confocal bildebehandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:
Figur 4: Analyse av De Novo mineralisering av Bone Matrix av den suksessive Farging av larver med ALC og Calcein på 12 og 15 DPF, Henholdsvis. A, B. ALC-farget skjelett matrise på 12 DPF. C, D. Calcein-farget skjelettmassen ved 15 DPF i samme larver. E, F. Sammenslåtte bildet som viser den nylig Mineralized bein matrise på tuppen av nevrale buer (grønn, piler). B, D, og F. Konfokalt stabel av området innrammet i A, C og E, respektivt. Skala barer i A, C og E: 100 mikrometer. Skala barer i B, D og F: 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Representative Images Viser en mislykket og en vellykket montering for Confocal Imaging. AC. Mislykket montering i lavtsmeltende agarose resulterer i en del av prøven (til venstre) som ligger utenfor fokalplanet. DF. Vellykket montering viser alle regions av interesse i samme fokusplan. Skala barer: 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Alendronat behandling forebygger benresorpsjon. ALC-farget skjelett matrise og ctsk: nlGFP-uttrykkende osteoklaster i transgen medaka larver uten RANKL induksjon (AC), med varmesjokk-indusert RANKL uttrykket (DF), og med tillegg av alendronat på samme dag som RANKL induksjon (GI) . C, F, og jeg. Konfokale stabler av områdene eske i A og B, D og E, G og H, henholdsvis.C. ALC-farget intakt ryggvirvel kolonner uten RANKL induksjon. F. RANKL-indusert, ctsk -expressing osteoklaster skjema rundt nevrale buer og Centra, som resulterer i fullstendig resorpsjon av mineralisert matrise av nevrale buer (piler) og i defekter til Centra (pilspisser). G. Tilsetningen av alendronat ikke har noen virkning på dannelsen av ctsk: nlGFP-uttrykk osteoklaster, men det blokkerer benresorpsjon og forlater nevrale buer og den centra intakt. Skala barer i A, B, D, E, G og H: 100 mikrometer. Skala barer i C, F, og jeg: 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
Det er viktig at vilkårene for varmesjokkbehandling er konsistente og stabile når man sammenligner forskjellige prøver. Stabile temperaturforhold garanterer tilsvarende nivåer av RANKL induksjon i transgene larver og følgelig sammenlignbar osteoklastdannelse, noe som kan bekreftes ved å screene for ctsk: nlGFP uttrykk. Til syvende og sist fører dette til en tilsvarende grad av induserte ektopisk benresorpsjon og osteoporose-lignende lesjoner, som validert av ALC farging. En slik eksperimentell design deretter gjør det mulig for bestemmelse og sammenligning av effektene av ulike anti-resorptive legemidler eller det samme stoffet påføres ved forskjellige konsentrasjoner.
Modifikasjoner og feilsøking
Fiskelarver er svært skjøre og må behandles forsiktig når monteringsprosessen for bildebehandling. For optimal levende confocal bildebehandling, larvene er nøye positioned med en plast microloader, i stedet for tang, for å unngå skader (figur 2B). Eggeplomme forlengelse er mindre følsom for berøring stimuli og kan brukes til å orientere larvene med en microloader, for derved å unngå larve bevegelse under montering. Regionen av interesse bør monteres flatt for å sikre at prøven kan være fokusert i en fokusplanet under bildebehandling (Figur 5). Bone celle atferd er svært dynamisk og krever høy tidsmessig og romlig oppløsning under live bildebehandling. Optimalt er time-lapse avbildning av konfokal analyse ønsket å følge osteoblast antiosteoklast interaksjoner i løpet av flere timer i levende larver. Imidlertid krever dette spesielle forhold for å holde larvene i live og i en fast posisjon. For langvarig anestesi, blir en oppløsning av 0,001% Tricaine i fisk medium tilsatt for å dekke den størknede agarose under avbildning. Dette hindrer agarose tørker ut og hindrer plutselige rykninger av larvene i løpet av imaging over flere timer.
Begrensninger av teknikken
Osteoporose er en sykdom som hovedsakelig rammer eldre mennesker. Derfor bør en ideell in vivo modell for osteoporose narkotika screening involvere voksen fisk. Så langt har imidlertid teknikken med levende avbildning som er beskrevet i denne rapport er begrenset til de embryonale og larvestadiet. Foreløpig tilgjengelig confocal bildebehandling ikke tillater levende avbildning av genetisk merkede bein celler i voksen fisk på grunn av begrensninger i inntrengningsdybde. Den siste utviklingen av Lys Sheet Fluorescensmikroskopi (LSFM), som tillater avbildning dypt inn levende vev, sammen med tilgjengeligheten av mindre pigmenterte "se gjennom" Medaka stammer, gjør det tenkes at denne begrensningen vil snart bli overvunnet, og live avbildning av benceller i voksen medaka fisk etter legemiddelscreening vil være mulig.
Betydningen av Technique For eksisterende / Alternative Methods
En unik kombinasjon av levende bildebehandling og avanserte genetiske verktøy har gjort lite beinfisk populært for biomedisinsk forskning - bein forskning spesielt - og som in vivo modeller for narkotika screening. Med mulighet til å analysere celle-celle-interaksjoner innenfor en intakt organisme transgene Medaka linjene er unikt egnet for live avbildning av dynamiske cellulære prosesser i løpet av bein modellering og ombygging. Fordi de deler mange gen-regulatoriske nettverk for å kontrollere bein homeostase med pattedyr, in vivo studier i medaka kan utfylle og med overgå in vitro-studier med pattedyrosteoblast og osteoklastene cellekulturanalyser.
Fremtidige søknader eller Veibeskrivelse Etter å mestre denne teknikken
Annet enn å teste enkeltkomponentene i en transgen bakgrunn, slik det er beskrevet i denne protokollen, fisk har også enkle fremgangsmåter for å undersøke kombinasjoner av various legemidler for mulig synergi eller forstyrrelser av forbindelser. Videre er bruken av en kombinasjon av forskjellige reporter linjer, for eksempel i sammenheng med en spesiell mutant bakgrunn, gir gode muligheter for å studere oppførselen til benceller under forskjellige stadier av ben- degenerasjon og reparasjon, eller i nærvær av et ben -modulating stoffet. Med sine unike egenskaper som utfyller musetest, medaka osteoporose modellen gir en utmerket in vivo tilnærming for å teste og kvantifisere anabole og antiresorptive effekter av nye bein-modulerende forbindelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende eller økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble finansiert med tilskudd fra Singapore Ministry of Education (MOE, stipend nummer 2013-T2-2-126) og National Institute of Health, USA (NIH, gi nummer 1R21AT008452-01A1). TY mottatt utdannet stipend fra NUS Department of Biological Sciences. Vi takker konfokal enhet av NUS Senter for Bioimaging Sciences (CBIS) for deres konstante støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alendronate | Sigma | A4978 | |
| alizarin-3-methyliminodiacetic acid, Alizarin Complexone | Sigma | A3882 | |
| Calcein | Sigma | C0875 | |
| ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| ImageJ (1.4.3.67) | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LSM 510 Meta confocal | Zeiss | ||
| LSM Image Browser (4.2.0.121) | Zeiss | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/lsm-5-series.html | |
| Micro-loader | Eppendorf | 5242956003 | Eppendorf ep T.I.P.S 20 μL |
| NIS-Elements BR 3.0 software | Nikon | ||
| Photoshop CS6 (13.0.0.0) | Adobe | ||
| SMZ1000 stereomicroscope | Nikon |
References
- Ablain, J., Zon, L. I. Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends Cell Biol. 23 (12), 584-586 (2013).
- Ansai, S., Kinoshita, M. Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka. Biol Open. 3 (5), 362-371 (2014).
- Apschner, A., Schulte-Merker, S., Witten, P. E. Not all bones are created equal-using zebrafish and other teleost species in osteogenesis research. Methods Cell Biol. 105, 239-255 (2011).
- Bajoghli, B., Aghaallaei, N., Heimbucher, T., Czerny, T. An artificial promoter construct for heat-inducible misexpression during fish embryogenesis. Dev Biol. 271 (2), 416-430 (2004).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnol J. 1 (6), 651-655 (2006).
- Centanin, L., Ander, J. J., Hoeckendorf, B., Lust, K., Kellner, T., Kraemer, I., Urbany, C., Hasel, E., Harris, W. A., Simons, B. D., et al. Exclusive multipotency and preferential asymmetric divisions in post-embryonic neural stem cells of the fish retina. Development. 141 (18), 3472-3482 (2014).
- Charles, J. F., Aliprantis, A. O.
- DeLaurier, A., Eames, B. F., Blanco-Sanchez, B., Peng, G., He, X., Swartz, M. E., Ullmann, B., Westerfield, M., Kimmel, C. B. Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration. Genesis. 48 (8), 505-511 (2010).
- Du, S. J., Frenkel, V., Kindschi, G., Zohar, Y. Visualizing normal and defective bone development in zebrafish embryos using the fluorescent chromophore calcein. Dev Biol. 238 (2), 239-246 (2001).
- Eriksen, E. F.
- Hockendorf, B., Thumberger, T., Wittbrodt, J. Quantitative analysis of embryogenesis: a perspective for light sheet microscopy. Dev Cell. 23 (6), 1111-1120 (2012).
- Inohaya, K., Takano, Y., Kudo, A. The teleost intervertebral region acts as a growth center of the centrum: in vivo visualization of osteoblasts and their progenitors in transgenic fish. Dev Dyn. 236 (11), 3031-3046 (2007).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech Dev. 121 (7), 605-618 (2004).
- Kirchmaier, S., Hockendorf, B., Moller, E. K., Bornhorst, D., Spitz, F., Wittbrodt, J. Efficient site-specific transgenesis and enhancer activity tests in medaka using PhiC31 integrase. Development. 140 (20), 4287-4295 (2013).
- Kirchmaier, S., Naruse, K., Wittbrodt, J., Loosli, F. The genomic and genetic toolbox of the teleost medaka (Oryzias latipes). Genetics. 199 (4), 905-918 (2015).
- Komori, T.
- Mackay, E. W., Apschner, A., Schulte-Merker, S. A bone to pick with zebrafish. Bonekey Rep. 2, 445 (2013).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
- Mitchell, R. E., Huitema, L. F., Skinner, R. E., Brunt, L. H., Severn, C., Schulte-Merker, S., Hammond, C. L. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Renn, J., Buttner, A., To, T. T., Chan, S. J., Winkler, C. A col10a1:nlGFP transgenic line displays putative osteoblast precursors at the medaka notochordal sheath prior to mineralization. Dev Biol. 381 (1), 134-143 (2013).
- Renn, J., Winkler, C. Osterix-mCherry transgenic medaka for in vivo imaging of bone formation. Dev Dyn. 238 (1), 241-248 (2009).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J., Trowe, T., Kranenbarg, S., Winkler, C., Schulte-Merker, S. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- To, T. T., Witten, P. E., Renn, J., Bhattacharya, D., Huysseune, A., Winkler, C. Rankl-induced osteoclastogenesis leads to loss of mineralization in a medaka osteoporosis model. Development. 139 (1), 141-150 (2012).
- Wakamatsu, Y., Pristyazhnyuk, S., Kinoshita, M., Tanaka, M., Ozato, K. The see-through medaka: a fish model that is transparent throughout life. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (18), 10046-10050 (2001).
- Witten, P. E., Huysseune, A. A comparative view on mechanisms and functions of skeletal remodelling in teleost fish, with special emphasis on osteoclasts and their function. Biol Rev Camb Philos Soc. 84 (2), 315-346 (2009).
- Yu, T., Witten, P. E., Huysseune, A., Buettner, A., To, T. T., Winkler, C. Live imaging of osteoclast inhibition by bisphosphonates in a medaka osteoporosis model. Dis Model Mech. 9 (2), 155-163 (2016).
