Règlement de Picornavirus Tropisme base microARN-

Summary

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

Abstract

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3′ non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

Introduction

Le développement d'une méthode largement applicable, facile et efficace pour l'ingénierie d'un vecteur à tropisme restreint offre une opportunité majeure pour améliorer la sécurité, la compréhension biologique et une utilité thérapeutique des virus. Il existe plusieurs mécanismes pour cibler tropisme viral comprenant traductionnelle, la transcription, et des techniques à base de traduction. Cependant, ces procédés ne sont généralement pas applicables à tous les systèmes de vecteurs, peut nécessiter des voies de signalisation défectueux dans des cellules ciblées ou nécessitent l'insertion de grandes séquences codantes dans le génome viral. En outre, ces procédés peuvent conduire à une atténuation du virus, ce qui entrave considérablement leur activité thérapeutique et limitant un aperçu du système non modifié.

Les microARN sont de petits (22-25 nucléotides), ARNs non codants qui interviennent dans le silençage génique dans des cellules eucaryotes. fonction microARN par des séquences cibles complémentaires (éléments de réponse) en ARN messagers de liaison (ARNm) resulti ng dans la transcription déstabilisation, la dégradation ou la répression traductionnelle. Les microARN se lient normalement des éléments de réponse avec une complémentarité partielle et donnent de petites modifications dans l' expression des gènes ^{1, 2, 3, 4, 5.} Plus de modifications significatives dans l' expression génique peut être obtenue en augmentant la complémentarité de l'élément de réponse ^6. Des milliers de micro – ARN matures ont été identifiés dans une variété d'espèces et de nombreux motifs d'expression différentiels d'exposition dans une variété de types cellulaires et tissulaires ^{7, 8, 9.} Ces signatures de microARN peuvent être exploitées pour la restriction spécifique à la cellule d'amplification du virus en y incorporant des éléments de réponse parfaitement complémentaires dans le génome viral ^10,= "xref"> ^{11, 12, 13.} L'objectif global de cette technique de microRNA-ciblage est de contrôler le tropisme d'un génome de vecteur sans atténuation supplémentaire.

L'utilité de cette méthode de régulation tropisme viral a été démontrée dans des vecteurs lentiviraux pour limiter l' expression du transgène dans des tissus spécifiques ^{14, 15, 16.} Cette technique a ensuite été appliquée à un large éventail de se répliquer et ne se répliquant pas des vecteurs viraux pour la thérapie génique accrue, ainsi que pour améliorer les profils de nombreux virus oncolytiques de sécurité en éliminant les effets toxiques indésirables dans les tissus normaux ^{10, 11, 12, 13, 17} . Il a également été utilisée pour générer sûre et eles vaccins vivants atténués EFFICACE ainsi que pour améliorer le virus et la fabrication de vaccins traite ^{18, 19, 20, 21.} MicroARN-ciblage d'un vecteur peut permettre à l'atténuation dans des hôtes vaccinés ou systèmes ciblés, tout en maintenant les niveaux de croissance de type sauvage dans les systèmes de production. MicroARN-ciblage peut également être utilisé pour améliorer la biosécurité des virus à des fins de recherche en limitant la transmission dans une espèce (par exemple les humains) , tout en maintenant la transmission dans d' autres hôtes ^22. Enfin, microRNA-ciblage peut permettre des analyses en profondeur des cycles de vie viraux et des rôles spécifiques de types de cellules dans la pathogénie et l' immunité en séparant la croissance virale ^{23, 24, 25, 26.}

Cette technique offre une alternative méthode qui est facilement mis en oeuvre et applicables à tous les systèmes de ciblage de virus. En outre, la collection sans cesse croissante de microARN matures avec des profils d'expression différentielle dans des types cellulaires spécifiques rend cette technique très polyvalent. le ciblage basé sur microARN se sont révélées efficaces pour une variété de systèmes de virus sans compromettre le fonctionnement du système. Les principales limites de cette technique comprennent essai et l'optimisation d'erreur, le potentiel de mutations d'échappement, et potentiels hors-cible des effets sur les transcriptions endogènes. Toutefois, ces limitations peuvent généralement être surmontés avec la conception des éléments de réponse optimisée et rationnelle. Les virus à ARN de sens positif ont tendance à être particulièrement sensible aux micro-ARN-cible due à l'orientation de sens positif de leur génome et de la disponibilité des transcriptions à la machine de microARN au cours du cycle de réplication complètement cytoplasmique. Nous décrivons ici un protocole pour générer un picornavirus microRNA-ciblée et l'expérimméthodes entales pour vérifier l'efficacité et la spécificité de ce ciblage in vitro.

Protocol

1. Clonage Éléments de réponse microARN dans le génome viral Inserts d'éléments de réponse Conception de microARN. Identifier les micro-ARN souhaité et sa séquence cible correspondante. Plusieurs bases de données sont disponibles avec des séquences de microARN matures. Recommandé: http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, 29, <sup class=…

Representative Results

Le tableau 1 représente les résultats typiques d'une analyse de titrage pour un picornavirus et décrit comment calculer la dose infectieuse de culture tissulaire à 50%. Une représentation schématique du concept global de la réglementation sur la base microRNA-du tropisme viral décrit dans ce manuscrit est illustré à la figure 1. L'orientation de microARN à l' élément de réponse au cours des interactions intracellulaires, une bon…

Discussion

La conception, la composition et la localisation des éléments de réponse microARN dans le génome viral dicteront ciblant l'efficacité et la spécificité. Optimisation de ceux-ci, il faudra essais et erreurs. Cependant, la conception rationnelle basée sur l' analyse structurelle de l' ARN et des études antérieures de la réplication virale et microARN signatures aides à la mise en œuvre de cette technique avec l' optimisation minimale ^{10, <su…}

Materials

RE encoding Oligonucleotides	IDT	PAGE-Purified Ultramer	Sequence Designed by Investigator
Oligonucleotides encoding unique restriction site	IDT	25nM	Sequence Designed by Investigator
Expand High Fidelity PCR Kit	Sigma Aldrich	11732641001	Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
T4 DNA Ligase System	NEB	M0202S
MEGAscript Kit	ThermoFisher Scientific	AM1333
MEGAclear Kit	ThermoFisher Scientific	AM1908
0.5 M EDTA	ThermoFisher Scientific	AM9260G	RNase-free
5 M NH4 Acetate	ThermoFisher Scientific	N/A	Comes in MEGAclear Kit
Ethanol	ThermoFisher Scientific	BP2818100
Nuclease-free Water	Fisher Scientific	AM9938
TransIT-2020 Transfection Reagent	Mirus	MIR 5404
TransIT-mRNA Transfection Reagent	Mirus	MIR 2225
0.2 μm syringe filter	Millipore	SLGP033RS
2mL Screw-Cap Tubes	Sarstedt	72.694.005
Cell Scrapers	Fisher Scientific	08-100-241
MicroRNA Mimics	Dharmacon	Varied
MTT Cell Proliferation Assay	ATCC	30-1010K
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	ThermoFisher Scientific	18265017
pBlueScript II Vectors	Agilent Technologies	Variable (e.g. 212205)	There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.