MicroRNA-basierten Regulation der Picornavirus Tropism

Summary

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

Abstract

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3′ non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

Introduction

Die Entwicklung einer breit anwendbaren, einfache und effektive Methode, um einen Vektor mit eingeschränkten Tropismus Engineering bietet eine große Chance, um die Sicherheit, biologische Verständnis und therapeutischen Nutzen von Viren zu verbessern. Mehrere Mechanismen existieren viralen Tropismus einschließlich transductional, transkriptionale und translationale Gestützte Techniken zielen. Jedoch sind diese Verfahren nicht allgemein anwendbar auf alle Vektorsysteme, können defekte Signalwege in Zielzellen erfordern oder Insertion von großen codierenden Sequenzen in das Virusgenom erfordern. Zusätzlich können diese Verfahren in der Dämpfung des Virus führen, erheblich ihre therapeutische Aktivität zu behindern und einen Einblick in das unmodifizierte System zu begrenzen.

MicroRNAs sind kleine (22-25 Nukleotide), nicht-kodierenden RNAs, die Gen-Silencing in eukaryotischen Zellen vermitteln. MicroRNAs Funktion durch komplementäre Zielsequenzen Bindung (Response-Elemente) in Boten-RNAs (mRNA) resulti ng in Transkript Destabilisierung, Abbau oder translationale Repression. MicroRNAs normalerweise Response – Elemente mit partieller Komplementarität binden und kleine Veränderungen in der Genexpression ^{1, 2, 3, 4, 5} ergeben. Weitere signifikante Veränderungen in der Genexpression kann durch Erhöhen ⁶ Komplementarität des Antwortelements erreicht werden. Tausende von reifen microRNAs wurden in einer Vielzahl von Arten und viele weisen differentielle Expressionsmuster in einer Vielzahl von Zell- und Gewebetypen ^{7, 8, 9} identifiziert. Diese MikroRNA Signaturen können durch Einbeziehen perfekt komplementären Response – Elemente in das virale Genom ¹⁰ zur zellspezifischen Restriktions Virusamplifikation ausgenutzt werden ,= "Xref"> ^{11, 12, 13.} Das übergeordnete Ziel dieser microRNA-Targeting-Technik ist es, die Tropismus eines Vektorgenoms ohne zusätzliche Dämpfung zu steuern.

Die Nützlichkeit dieses Verfahrens für die virale Tropismus regulierende wurde ursprünglich in lentiviralen Vektoren gezeigt Transgen – Expression in spezifischen Geweben ^{14, 15, 16} zu beschränken. Diese Technik hat in der Folge zu einer Vielzahl von replizierende und nicht-replizierende virale Vektoren für eine verbesserte Gentherapie als auch angewendet worden , wie die Sicherheitsprofile vieler onkolytischen Viren zu verbessern , indem eine unerwünschte Toxizitäten in normalen Geweben eliminiert ^{10, 11, 12, 13, 17} . Es ist auch sicher und e zu erzeugen, verwendet worden, umffective lebendes abgeschwächtes Impfstoffe sowie Virus und Impfstoffherstellung zu verbessern , Prozesse ^{18, 19, 20, 21.} MicroRNA-Targeting eines Vektors kann für die Dämpfung in geimpften Hosts oder gezielt Systeme ermöglichen, während Wildtyp-Wachstumsraten in den Erzeugersystemen aufrechterhalten wird. MicroRNA-Targeting kann auch durch die Beschränkung Übertragung in einer Spezies (zB Menschen) , um die biologische Sicherheit von Viren zu Forschungszwecken zu verbessern verwendet werden , während ²² Übertragung in anderen Hosts zu halten. MicroRNA-Targeting Schließlich kann für viralen Lebensanalysen von Zyklen in-Tiefe ermöglichen und spezifische Rollen von Zelltypen in der Pathogenese und Immunität durch das virale Wachstum Aussortieren ^{23, 24, 25, 26.}

Diese Technik bietet ein alternative Verfahren Targeting, die leicht umgesetzt und gilt für alle Virus-Systemen. Darüber hinaus macht die ständig wachsende Sammlung von reifen microRNAs mit differentiellen Expressionsmuster in bestimmten Zelltypen diese Technik vielseitig einsetzbar. MicroRNA-basierten Targeting hat sich für eine Vielzahl von Virus-Systemen ohne Kompromisse bei der Systemfunktion wirksam erwiesen. Die wichtigsten Einschränkungen dieser Technik gehören Versuch und Irrtum-Optimierung, das Potenzial für Mutationen und mögliche Nebeneffekte auf endogenen Transkripte. Allerdings können diese Einschränkungen im Allgemeinen mit optimiertem und rational-Response-Element Design überwunden werden. Positive Sense-RNA-Viren sind in der Regel besonders als Reaktion auf microRNA-Targeting zu sein aufgrund der positiven Sense-Orientierung ihres Genoms und die Verfügbarkeit der Transkripte auf die microRNA Maschinen während des vollständig zytoplasmatischen Replikationszyklus. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung eines microRNA-bezogene picornavirus und die Experimental Methoden , um die Effizienz und Spezifität , dass Targeting in vitro zu überprüfen.

Protocol

1. Klonierung MikroRNA Reaktions Elements in das virale Genom Design – microRNA – Response – Element – Einsätze. Identifizieren Sie die gewünschte microRNA und seine entsprechende Zielsequenz. Mehrere Datenbanken sind mit reifen microRNA-Sequenzen zur Verfügung. Empfohlen: http://www.mirbase.org/ 9, 27, 28, <su…

Representative Results

Tabelle 1 zeigt Ergebnisse typisch für einen Titrationsassay für eine Picornavirus und beschreibt , wie die 50% Gewebekultur infektiöse Dosis zu berechnen. Eine schematische Darstellung des Gesamtkonzepts von microRNA-basierten Regulation der viralen in diesem Manuskript beschrieben Tropismus ist in Abbildung 1 die Orientierung der microRNA auf Response – Element während der intrazellulären Wechselwirkungen, die richtige Gestaltung von Response – El…

Discussion

Das Design, die Zusammensetzung und die Lokalisierung der microRNA-Response-Elemente innerhalb des viralen Genoms wird diktieren, Wirksamkeit und Spezifität Targeting. Die Optimierung dieser wird Versuch und Irrtum erforderlich. Jedoch rationales Design basierend auf RNA Strukturanalyse und frühere Studien der viralen Replikation und mikroRNA Signaturen hilft bei der Durchführung dieser Technik mit minimalem Optimierungs ^{10, 11, <…}

Materials

RE encoding Oligonucleotides	IDT	PAGE-Purified Ultramer	Sequence Designed by Investigator
Oligonucleotides encoding unique restriction site	IDT	25nM	Sequence Designed by Investigator
Expand High Fidelity PCR Kit	Sigma Aldrich	11732641001	Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
T4 DNA Ligase System	NEB	M0202S
MEGAscript Kit	ThermoFisher Scientific	AM1333
MEGAclear Kit	ThermoFisher Scientific	AM1908
0.5 M EDTA	ThermoFisher Scientific	AM9260G	RNase-free
5 M NH4 Acetate	ThermoFisher Scientific	N/A	Comes in MEGAclear Kit
Ethanol	ThermoFisher Scientific	BP2818100
Nuclease-free Water	Fisher Scientific	AM9938
TransIT-2020 Transfection Reagent	Mirus	MIR 5404
TransIT-mRNA Transfection Reagent	Mirus	MIR 2225
0.2 μm syringe filter	Millipore	SLGP033RS
2mL Screw-Cap Tubes	Sarstedt	72.694.005
Cell Scrapers	Fisher Scientific	08-100-241
MicroRNA Mimics	Dharmacon	Varied
MTT Cell Proliferation Assay	ATCC	30-1010K
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	ThermoFisher Scientific	18265017
pBlueScript II Vectors	Agilent Technologies	Variable (e.g. 212205)	There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.