תקנה מבוססת MicroRNA של Picornavirus כמיהות

Summary

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

Abstract

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3′ non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

Introduction

פיתוח שיטה ישימה, קלה ויעילה רחבים עבור הנדסת וקטור עם כמיהות מוגבלות מספק הזדמנות גדולה כדי לשפר את הבטיחות, הבנה ביולוגית תועלת טיפולית של וירוסים. מספר מנגנונים קיימים למקד כמיהות ויראלי כולל transductional, תעתיק, וטכניקות מבוססות translational. עם זאת, שיטות אלו אינן ישימות כלל לכל מערכות הווקטור, עשוי לדרוש מסלולי איתות פגומים בתאים ממוקדים או לדרוש החדרת רצפי קידוד גדולים לתוך הגנום הויראלי. בנוסף, שיטות אלה עלולות לגרום הנחתה של הנגיף, ולעכב הפעילות הטיפולית שלהם באופן משמעותי והגבלת תובנה על המערכת ללא שינוי.

מיקרו RNA קטנים (22-25 נוקלאוטידים), ללא קידוד RNAs אשר מתווכים להשתקת גנים בתאים איקריוטיים. מיקרו RNA פונקציה באמצעות קשירה רצפי היעד משלימים (אלמנטים בתגובה) ב RNAs שליח (mRNA) resulti ng ב יציבות תמליל, השפלה או דיכוי translational. מיקרו RNA בדרך כלל לאגד אלמנטים בתגובה עם השלמה חלקית להניב שינויים קטנים ביטוי גנים ^{1, 2, 3, 4, 5.} עוד שינויים משמעותיים ביטוי גנים יכולים להיות מושגת על ידי הגדלת מידת ההשלמה של אלמנט התגובה ^6. אלף מייקרו-רנ"א בוגרת זוהו במגוון מיני דפוסי ביטוי הפרש תערוכה רב במגוון של סוגי תאים ורקמות ^{7, 8, 9.} חתימות microRNA אלה ניתן לנצל עבור הגבלת תא ספציפי של הגברת וירוס על ידי שילוב אלמנטים בתגובה משלימים באופן מושלם לתוך הגנום הויראלי ^10,= "Xref"> ^{11, 12, 13.} המטרה הכללית של טכניקת מיקוד-microRNA זה היא לשלוט הכמיהות של הגנום וקטור ללא הנחתה נוספת.

השירות של שיטה זו להסדרת כמיהות ויראלי הודגם במקור וקטורים lentiviral להגביל ביטוי transgene ברקמות ספציפיות ^{14, 15, 16.} טכניקה זו לאחר מכן יושמה למגוון רחב של משכפלים ולא משכפל וקטורים ויראליים עבור ריפוי גנטי משופר כמו גם לשפר את פרופיל הבטיחות של וירוסי oncolytic רבים על ידי ביטול רעיל רצוי ברקמות נורמליות ^{10, 11, 12, 13, 17} . זה גם נוצל כדי ליצור בטוח ודוארחיסונים חיים-מוחלש ffective וכן לשפר וירוס וייצור חיסון מעבד ^{18, 19, 20, 21.} MicroRNA-מיקוד של וקטור יכול לאפשר הנחתה ב מארחים מחוסנים או מערכות ממוקדות תוך שמירה על רמות צמיחת wild-type במערכות יצרן. MicroRNA מיקוד יכול לשמש גם כדי לשפר את הבטיחות הביולוגית של וירוסים למטרות מחקר על ידי הגבלת הילוכים במינים אחד (אדם למשל) תוך שמירה על שידור צבאות אחרים ^22. לבסוף, microRNA-מיקוד יכול לאפשר ניתוחים מעמיקים של מחזורי חיים של נגיף ותפקידים ספציפיים של סוגי תאים בפתוגנזה וחסינות ידי הפרדת צמיחת ויראלי ^{23, 24, 25, 26.}

טכניקה זו מציעה alternative שיטת מיקוד מיושמת בקלות ישימה עבור כל מערכות הווירוס. בנוסף, האוסף המתרחבת של מיקרו-רנ"א בוגרת עם דפוסי ביטוי ההפרש בסוגי תאים ספציפיים עושה טכניקה זו תכליתי מאוד. MicroRNA מבוסס מיקוד הוכיח יעיל עבור מגוון רחב של מערכות וירוס מבלי להתפשר תפקוד מערכת. המגבלות העיקריות של גישה זו כוללות בדיקה ואופטימיזציה שגיאה, פוטנציאל מוטציות בריחה, ואת הפוטנציאל מחוץ יעד תופעות על תמלילי אנדוגני. עם זאת, מגבלות אלה ניתן להתגבר באופן כללי עם עיצוב אלמנט בתגובה אופטימלי רציונלים. וירוסי RNA חיובי תחושה נוטים להיות קשוב במיוחד כדי microRNA-מיקוד בשל האורינטציה החיובית תחושת הגנום שלהם ואת הזמינות של התמלילים אל מכונה microRNA במהלך מחזור השכפול ציטופלסמית לחלוטין. כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת picornavirus במיקוד microRNA ואת experimשיטות ental כדי לאמת את יעילות וספציפיות של שמיקוד במבחנה.

Protocol

1. שיבוט microRNA תגובה אלמנטים לתוך הגנום הויראלי מוסיף אלמנט בתגובה microRNA עיצוב. זהה את microRNA הרצוי רצף היעד המתאים. מאגרי מידע קיימים מספר עם רצפי מיקרו-רנ"א בוג…

Representative Results

טבלת 1 מייצגת תוצאות אופייניות של assay טיטרציה עבור picornavirus ומתארת כיצד לחשב את המינון זיהומיות תרבות 50% רקמות. ייצוג סכמטי של הרעיון הכללי של רגולציה המבוססת על microRNA של כמיהות ויראלי המתואר בכתב היד הזה מוצג באיור 1. האוריינטציה של mic…

Discussion

העיצוב, הרכב והלוקליזציה של האלמנטים בתגובת microRNA בתוך הגנום הויראלי יכתיבו מיקוד יעיל וספציפי. אופטימיזציה אלה ידרוש ניסוי וטעייה. עם זאת, תכנון רציונלי מבוסס על ניתוח RNA מבני מחקרים קודמים של שכפול נגיפי איידס חתימות microRNA ביישום הטכניקה הזו עם אופטימיזציה מינימאלי …

Materials

RE encoding Oligonucleotides	IDT	PAGE-Purified Ultramer	Sequence Designed by Investigator
Oligonucleotides encoding unique restriction site	IDT	25nM	Sequence Designed by Investigator
Expand High Fidelity PCR Kit	Sigma Aldrich	11732641001	Many other High Fidelity Polymerase PCR kits available
T4 DNA Ligase System	NEB	M0202S
MEGAscript Kit	ThermoFisher Scientific	AM1333
MEGAclear Kit	ThermoFisher Scientific	AM1908
0.5 M EDTA	ThermoFisher Scientific	AM9260G	RNase-free
5 M NH4 Acetate	ThermoFisher Scientific	N/A	Comes in MEGAclear Kit
Ethanol	ThermoFisher Scientific	BP2818100
Nuclease-free Water	Fisher Scientific	AM9938
TransIT-2020 Transfection Reagent	Mirus	MIR 5404
TransIT-mRNA Transfection Reagent	Mirus	MIR 2225
0.2 μm syringe filter	Millipore	SLGP033RS
2mL Screw-Cap Tubes	Sarstedt	72.694.005
Cell Scrapers	Fisher Scientific	08-100-241
MicroRNA Mimics	Dharmacon	Varied
MTT Cell Proliferation Assay	ATCC	30-1010K
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	ThermoFisher Scientific	18265017
pBlueScript II Vectors	Agilent Technologies	Variable (e.g. 212205)	There are different plasmids with T7 or T3 promoters and variable cloning sites to enable cloning and RNA transcription.