Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.
A oócitos de Xenopus como um sistema de expressão heteróloga de proteínas, foi primeiramente descrito por Gurdon et ai. 1 e tem sido amplamente utilizadas desde a sua descoberta (Referências: 2 – 3, e suas referências). Uma característica que faz com que o oócito atraente para expressão do canal estrangeira é o pobre abundância de canais de iões endógenos 4. Este sistema de expressão tem se mostrado útil para a caracterização de muitas proteínas, entre eles, canais iónicos dependentes de ligandos.
A expressão de receptores de GABAA em oócitos de Xenopus e sua caracterização funcional é aqui descrita, incluindo o isolamento de oócitos, micro-injecções com ARNc, a remoção das camadas de células foliculares, e alterações solução rápida em experiências electrofisiológicas. Os procedimentos foram otimizados neste laboratório 5,6 e desviar os utilizados rotineiramente 7-9. Tradicionalmente, os oócitos são desnudados preparadocom um tratamento prolongado colagenase de lóbulos de ovário à TA, e estes são desnudados oócitos microinjectados com ARNm. Usando os métodos optimizados, proteínas de membrana diferentes foram expressos e estudada com este sistema, tais como os receptores recombinantes GABA A, os canais de cloreto 10-12 recombinantes humanos de tripanosomas, 13 canais de potássio 14, e um transportador 15 de mio-inositol, 16.
Os métodos descritos aqui podem ser aplicados para a expressão de qualquer proteína de escolha em oócitos de Xenopus, e a mudança rápida solução pode ser utilizada para estudar outros canais iónicos dependentes de ligandos.
Oócitos de Xenopus são amplamente utilizados como um sistema de expressão (Referências: 2 – 3, e suas referências). Eles são capazes de montar correctamente e incorporar proteínas de múltiplas subunidades funcionalmente activos nas suas membranas plasmáticas. Usando este sistema, é possível investigar funcionalmente proteínas da membrana por si só ou em combinação com outras proteínas, a fim de estudar as propriedades de mutantes, ou proteínas quiméricas concatenados, e para pesquisar potenciais drogas.
Vantagens da utilização de oócitos em relação a outros sistemas de expressão heterólogos incluem o manuseamento simples das células gigantes, a elevada proporção de células que expressam a informação genética estrangeira, o controlo simples do ambiente do oócito por meio de perfusão de banho, e o controlo do potencial de membrana .
O inconveniente deste sistema de expressão é a variação sazonal observado em muitos laboratórios 17-20. A razão para esta variaçãoestá longe de ser clara. Além disso, a qualidade dos oócitos é frequentemente observado de variar fortemente. Os métodos tradicionais 7-9 incluíram o isolamento de lóbulos de ovário, a exposição dos lóbulos de ovário de colagenase para algumas horas, a selecção de oócitos desnudados, e a microinjecção de oócitos. Aqui, uma série de procedimentos alternativos, rápidos são informou que nos permitiram trabalhar com este sistema de expressão por mais de 30 anos sem variação sazonal e pouca variação na qualidade do oócito.
Os métodos melhorados e modificados descritos aqui para o isolamento de oócitos, microinjecção com ARNc, e a remoção de camadas de células foliculares podem ser utilizados para a expressão de qualquer proteína de escolha no oócito de Xenopus. O método muito simples para modificações solução rápida do meio em volta do oócito pode ser aplicada ao estudo de qualquer receptor ionotrópico e dos transportadores.
Os métodos descritos neste artigo desviar os utilizados tradicionalmente 7-9. É padrão para expor os lóbulos do ovário para uma 1 a 2 h colagenase tratamento 8; isolar intactas, oócitos desnudados; e injectar-los com mRNA usando dispositivos de injecção comerciais. Este procedimento clássico tem os seguintes inconvenientes: 1) Os oócitos são susceptíveis de ser danificadas pela longa exposição a altas concentrações de colagenase. 2) Os oócitos desnudados instáveis deve ser a…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).
NaCl | Sigma | 71380 | |
KCl | Sigma | P-9541 | |
NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
CaCl2 | Sigma | 223560 | |
Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/ml and 100 μg streptomycin/ml |
Platinum wire loop | home-made | ||
Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μl, Type 701N |
Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
Nylon net, gauge 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
EGTA | Sigma | E3389 | |
Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD X 0.58 ID X 100 Length mm (for microinjection) |
Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD X 0.69 ID X 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |