Abstract
De Xenopus oöcyt als een heteroloog expressiesysteem voor eiwitten, werd eerst beschreven door Gurdon et al. 1 en is op grote schaal gebruikt sinds zijn ontdekking (referenties 2-3, en referenties daarin). Een kenmerk dat de eicel aantrekkelijk voor buitenlandse kanaal expressie maakt is de slechte overvloed van endogene ionkanalen 4. Het expressiesysteem is nuttig voor het karakteriseren van verschillende proteïnen, waaronder ligand-gated ionkanalen bewezen.
De expressie van GABAA-receptoren in Xenopus oocyten en hun functionele karakterisatie wordt beschreven, inclusief isolatie oöcyten, micro-injecties met cRNA, de verwijdering van folliculaire cellagen en snelle oplossing veranderingen in elektrofysiologische experimenten. De procedures werden geoptimaliseerd in dit laboratorium 5,6 en afwijken van die welke routinematig gebruikt 7-9. Traditioneel worden ontdaan oöcyten bereidmet een verlengde collagenase behandeling van ovarium lobben bij kamertemperatuur en deze blootgelegde oöcyten gemicroinjecteerd met mRNA. Met de geoptimaliseerde methoden hebben verschillende membraaneiwitten tot expressie gebracht en onderzocht met dit systeem, zoals recombinante GABA A-receptoren 10-12, menselijk recombinant chloride kanalen 13, Trypanosoom kaliumkanalen 14 en een myo-inositol transporter 15, 16.
De hier beschreven werkwijzen kunnen worden toegepast voor de expressie van een eiwit van keuze in Xenopus oöcyten, en de snelle verandering oplossing kan worden gebruikt om andere ligand-gated ionkanalen bestuderen.
Introduction
Xenopus oöcyten worden veel gebruikt als een expressiesysteem (referenties 2-3, en referenties daarin). Ze kunnen goed assembleren en op te nemen functioneel actief multisubunit eiwitten in de plasmamembranen. Met dit systeem is het mogelijk om functioneel onderzoek membraaneiwitten alleen of in combinatie met andere proteïnen, teneinde de eigenschappen van gemuteerde chimere of aaneengeschakelde proteïnen, en potentiële geneesmiddelen te screenen.
Voordelen van oöcyten opzichte van andere heterologe expressiesystemen omvatten de eenvoudige bediening van de reuscellen, het hoge aandeel van cellen die vreemde genetische informatie, de eenvoudige besturing van de van eicel middels bad perfusie en de controle van de membraanpotentiaal .
Het nadeel van dit expressiesysteem is de seizoensgebonden variatie waargenomen in veel laboratoria 17-20. De reden voor deze variatieis verre van duidelijk. Bovendien wordt de kwaliteit van de oöcyten waargenomen vaak sterk variëren. Traditionele methoden 7-9 hebben de isolatie van eierstok lobben, de blootstelling van eierstok kwabben om collagenase voor een aantal uur, de selectie van de blootgelegde eicellen en de eicel micro-injectie opgenomen. Hier wordt een aantal alternatieve, snelle procedures gerapporteerd die konden we met dit expressiesysteem meer dan 30 jaar zonder seizoensgebonden variatie en weinig variatie in kwaliteit van de oöcyten.
De gewijzigde en verbeterde werkwijzen beschreven voor het isoleren van oöcyten, micro-injectie met cRNA en verwijdering van folliculaire lagen kunnen worden gebruikt voor de expressie van een eiwit van keuze in het Xenopus oöcyt. De eenvoudige werkwijze voor snelle oplossing verandert van het medium rond de eicel kan worden toegepast op de studie van elke ligand-gated ionkanaal en dragers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierproeven zijn goedgekeurd door de plaatselijke commissie van het kanton Bern Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Bern (BE85 / 15).
1. Bereiding van Xenopus Eicellen
- Handhaven kikkers (Xenopus laevis) op een 12 uur / 12 uur licht / donkercyclus in water die strikt bij 20 ° C wordt gehouden.
- Verwijder de lobben van de eierstokken van vrouwelijke kikkers 9.
Opmerking: Het verwijderen van de lobben is een stimulans voor regeneratie en vaak de kwaliteit van de oöcyten verbetert met chirurgie. De eicel wordt onder een vitelline laag, een laag van follikel cellen en bindweefsel die de bloedvaten 21. Het geheel wordt aangeduid als de "follikel." - Plaats de lobben van de eierstokken die dicht zijn verpakt met de follikels die de oöcyten in steriele Barth's zoutoplossing 7 (MBS) aangevuld met penicilline en streptomycine (88 mM NaCl, 1 mM KCI, 2,4 mMNaHCO3, 0,82 mM MgSO 4, 0,41 mM CaCl2, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 ug / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine).
- Single-out fase V-VI 21 follikels. Houd de eierstok kwab met een tang. Laat de platina lus (figuur 1) via follikels en voorzichtig terugtrekken van de lus om het bindweefsel dat de follikel van eierstokweefsel verstoren.
OPMERKING: Fase V-VI 21 follikels worden gekenmerkt door hun grootte (1,0-1,2 mm diameter) en de goed contrast tussen de donkere gepigmenteerde dier halfrond en de gelige plantaardige halfrond. - Transfer alleen gezond ogende follikels (dwz perfect sferisch en met intacte pigmentatie) een 35 mm petrischaal met behulp van een kunststof pasteurpipet (knip terug naar een openingsdiameter van 1,5 mm).
Opmerking: Het micro- injectie systeem beschreven wordt afgeleid van het door Kressmann en Birnstiel 22 gerapporteerd.
- Bereid cRNA's van de respectievelijke cDNA's coderend voor de subeenheden van de α β 4 2 δ GABAA-receptor in vitro transcriptie, toevoeging van een poly (A +) staart en RNA kwantificering door 23 gelelektroforese.
- Bereid micro-injectie pipetten van borosilicaatglas capillairen (1,0 mm buitendiameter (OD), 0,58 mm binnendiameter (ID), 100 mm lengte) met behulp van een micropipet trekker. Breek de uiteinden van de glazen capillairen onder een microscoop met een micromanipulator en microvezel een tip diameter van 12 creëren - 15 urn met een afgeschuinde punt.
- Backfill de micro-injectie pipetten met paraffine olie met behulp van een 10 ml spuit en vervolgens monteer de micro-injectie pipet op een zelfbouw MICRoinjection inrichting (figuur 2).
Attentie: de zelfbouw olie hydraulische injectie apparaat bestaat uit een grill motor bestuurd door een voetpedaal schakelaar. Een extra schakelaar wijzigt de stand draaien van de motor. Deze motor drijft een micrometer schroef (0,5 mm / turn) die voorschotten of trekt de zuiger van een 10 pi glazen spuit. De injectie met een snelheid van ongeveer 3 rpm en 0,5 beurt overeenkomt met een 50 nL injectie in een follikel. Het uiteinde van de spuit is verbonden met dikwandige polytetrafluorethyleen buis die zich aan de injectienaald verbonden door een kort stuk Tygon-buis. De injectie capillair wordt gehouden door een boorkop, dat wordt gecontroleerd door een micromanipulator. Het gehele systeem is gevuld met paraffineolie. Eventuele luchtbellen moeten worden vermeden, aangezien zij het injectiesysteem zal schaden. De setup is verlicht met een koude lichtbron. Een stereomicroscoop vereist voor optische controle. Follikels worden gevisualiseerd onder koud licht met een stereomicroscope (40x vergroting). Prestaties van de injectie opstelling wordt getest door het injecteren van radioactieve tracer in Xenopus oocyten. Een volume van 45 - 55 nL moet per injectie worden geleverd. - Met behulp van een pipet met steriele plastic tip, test de opstelling door een druppeltje steriel water op de schone binnenkant van een vochtbestendige thermoplast (2 x 2 cm). Dompel de punt van de injectie pipet in dit druppeltje, en zet de motor aan de zuiger (negatieve druk in de injectie pipet) intrekken.
OPMERKING: Water moet de pipet te geven en een zichtbare interface met olie. - Trek de punt van de pipet uit de druppel en positieve druk aan op de binnenzijde van de injectiepipet. Een waterdruppeltje dient de punt van de injectiepipet vormen.
- Voorbereiden op de injectie van de follikels door voering ze met vegetatieve polen naar boven gericht in de tussenruimten van een nylon mesh (G: 0,8 mm) vastgelijmd aan de bodem van een Petri schaal (60 mm) bedekt met MBS.
- Verdeel 2 pl mRNA met een pipet met steriele plastic tip op de schone binnenkant van een thermoplast. Neem het mRNA tot in de injectiepipet door toepassing van negatieve druk op de binnenkant van de injectiepipet.
- Plaats de injectie pipet over een individuele follikel met behulp van de micromanipulator.
- Steek de injectienaald in het midden van de vegetatieve pool en injecteer 50 nL van mRNA met een stroomsnelheid van 0,6 ul / min door het toepassen van positieve druk aan de binnenkant van de pipet. Wacht 5-10 s voor het verwijderen van de injectie pipet tip van de follikel tot mRNA ontsnapping te voorkomen.
Opmerking: Het mRNA worden geïnjecteerd in de vegetatieve (geel) pool injectie in de kern, die is gelegen in het dier halfrond voorkomen. - Breng de geïnjecteerde follikels een nieuwe petrischaal (35 mm) gevuld met 2 ml MBS. Plaats de schotel in een wijnkoeler ingesteld op 18 ° C. Incubeer de geïnjecteerde follikels voor 1 -7 d voor de opname, afhankelijk van de identiteit van de nieuw tot expressie gebrachte eiwit.
3. Strippen van de follikels (figuur 3)
OPMERKING: Zoals hierboven vermeld, de eicel onder een vitelline laag, follikel cellen en bindweefsel, die de bloedvaten 24 bevat, is bekend als een "follikel." Alle lagen behalve de vitelline laag die mechanische stabiliteit verricht zonder beperking van de toegang van oplossingen aan het celoppervlak moet worden verwijderd voordat elektrofysiologische experimenten. De follikel zonder het omringende cellagen eerder werd aangeduid als een "Denuded" eicel 25. Deze stap wordt gewoonlijk uitgevoerd op dezelfde dag als de elektrofysiologische experimenten.
- Transfer tien geïnjecteerd follikels een borosilicaatglas met 0,5 ml MBS, 1 mg / ml collagenase en 0,1 mg / ml trypsineremmer. Dompel de buis in een waterbad gehandhaafd op 36 ° C. Incubeer defollikels gedurende 20 min en schud de buizen af en toe.
- Spoel de follikels door ze over een tweede buis met 1 ml MBS bij kamertemperatuur. Laat ze in de buis gedurende ongeveer 10 s.
- Breng de follikels een derde buis met 0,5 ml dubbel geconcentreerde MBS met 4 mM ethyleenglycol-bis (2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraazijnzuur (EGTA) en incubeer ze gedurende 4 minuten bij RT. Schud de buis af en toe.
OPMERKING: De hypertone oplossing (dubbel geconcentreerde MBS) gebruikt om krimp van de oöcyten in follikel cellagen, waardoor folliculaire cellagen van de eicel los te induceren; EGTA toegevoegd om collagenase te remmen. - Spoel de follikels door ze over een tweede buis met 1 ml MBS bij kamertemperatuur. Laat ze in de buis gedurende ongeveer 10 s.
- Breng de eicellen naar een petrischaal (35 mm diameter) met 2 ml MBS. Onder een stereomicroscoop, scheiden de buitenste enveloppen uit de follikels doorgewoon druk op de naakte eicel weg met behulp van de platina lus.
OPMERKING: De buitenste omhulsels van de oöcyten goed zitten aan de kweekschaal en kunnen gemakkelijk worden gescheiden van de oöcyten. Sommige eicellen spontaan verliezen hun buitenste enveloppen en zullen worden verhaald als blootgelegde eicellen. Deze procedure leidt tot een relatief stabiel preparaat dat de sferische uiterlijk van de oöcyten houdt.
4. Snel Oplossing Verander rond de eicel
- Voer een voltage clamp experiment, zoals beschreven 9,26.
- Verander de oplossing van de zwaartekracht perfusie systeem door de perfusie schakelaars zoals vereist door het experiment.
- Breng de perfusie-oplossing bij 6 ml / min door een glazen capillair met een binnendiameter van 1,35 mm, waarvan de mond wordt geplaatst ongeveer 0,4 mm vanaf het oppervlak van de eicel, om snelle veranderingen in de concentratie agonist rond de eicel mogelijk maken.
LET OP: De snelheid van verandering heeft eerder raming geweestd 70% in minder dan 0,5 s 27.
- Breng de perfusie-oplossing bij 6 ml / min door een glazen capillair met een binnendiameter van 1,35 mm, waarvan de mond wordt geplaatst ongeveer 0,4 mm vanaf het oppervlak van de eicel, om snelle veranderingen in de concentratie agonist rond de eicel mogelijk maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Xenopus oocyten werden mechanisch aangeduid met een platina lus (figuur 1). De eicellen werden gemicroinjecteerd met mRNA coderend voor de GABAA-receptor subunits a4, p 2, δ, 0,5: 0,5: 2,5 fmol / eicel (figuur 2). Na 4 d, werden folliculaire cel lagen verwijderd (figuur 3). Oöcyten spanning geklemd bij -80 mV en blootgesteld aan toenemende concentraties van γ-aminoboterzuur (GABA) in aanwezigheid van 1 uM 3α, 21-dihydroxy-5α-pregnan-20-on (THDOC), een krachtige positieve allosterische modulator van de GABAA-receptor. Figuur 4A toont originele actuele sporen die in een dergelijk experiment. Figuur 4B toont uitgelokte actuele amplitude afhankelijk van de GABA concentraties. Dit maakt bepaling van de gevoeligheid van deze subeenheid combinatie richting GABA. De afzonderlijke curvenaangebracht en gestandaardiseerd op Imax en vervolgens gemiddeld. De gebruikte vergelijking was I (c) = I max / (1+ (EC50 / c) n), waarin c de concentratie van GABA, EC50 de concentratie van GABA (in aanwezigheid van 1 uM THDOC) opwekken van een half -maximal amplitude, Imax is de maximale amplitude, I de stroom amplitude en n is de Hill coëfficiënt. De EC 50 van de α β 4 2 δ GABAA-receptor bedroeg 0,41 ± 0,12 uM en n was 0,76 ± 0,04.
Figuur 1: Platinum Loop. De platina draad lus genoemd in protocol stap 1.4. Platinum is een metaal dat zonder dat splinters kan worden gebogen, en het niet vasthoudenbiologisch materiaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Homebuilt Microinjection Apparatus. De apparatuur wordt beschreven in protocol stap 2. a, grill motor; b, micrometer schroef; c, de lente tussen de spuit en de zuiger; d, 10 pi glazen spuit; e, dikwandige buizen polytetrafluorethyleen; f, hand boorkop; g, injectie pipet; h, stereomicroscoop; en ik, motorische controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Schema Toont de Defolliculation van een Eicel. Oöcyten worden eerst geïncubeerd in een collagenase oplossing in een waterbad bij 36 ° C gedurende 20 min. Eicellen worden vervolgens in een gemodificeerde Barth medium gewassen. De laatste incubatiestap zit in een hypertone EGTA oplossing bij kamertemperatuur 4 min. Dientengevolge, het bindweefsel en de follikel cellen worden verwijderd om de blootgelegde eicel geven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Huidige Sporen uit een twee-elektrode Voltage Clamp Experiment. EEN, Huidige sporen van een GABA concentratie response curve in de presheid van 1 pM THDOC verkregen uit een Xenopus oöcyt expressie de α β 4 2 δ GABAA-receptor. De balken geven de periode van GABA / 1 uM THDOC perfusie. Toenemende concentraties van GABA werden toegepast op de oöcyten en de bijbehorende stroom amplitudes bepaald. GABA concentraties boven de balken aangegeven. B, Gemiddelde concentratieresponskrommen van de α β 4 2 δ GABAA-receptor. Individuele curves werden voor het eerst genormaliseerd op het gemonteerde maximale huidige amplitude en werden vervolgens gemiddeld. De gegevens worden getoond als gemiddelde ± SD, n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De in dit artikel beschreven methoden afwijken van die van oudsher 7-9 gebruikt. Standaard worden de lobben van de eierstok blootstellen aan een 1-2 uur collagenase behandeling 8; isoleren onbeschadigd, ontdaan eicellen; en injecteren mRNA met gebruik van commerciële injecteerinrichtingen. Deze klassieke werkwijze heeft de volgende nadelen: 1) Eicellen waarschijnlijk beschadigd door langdurige blootstelling aan hoge concentraties collagenase. 2) De onstabiele blootgelegde oöcyten worden opgeslagen totdat het experiment. 3) Beroofd oöcyten hebben meer kans om te lijden tijdens de micro-injectie dan follikels. Commercieel injectie apparaten grote diameter (ongeveer 20 urn) injectienaalden, waarschijnlijk leidt tot een relatief hoge mate van beschadiging. De voordelen van de verbeterde procedure beschreven zijn: blootstelling aan collagenase is beperkt tot 20 minuten, blootgelegde oöcyten niet te worden opgeslagen, en de kleine tip diameter van de pipetten (ongeveer 12-15 urn) gebruikt microinjectiOp geen voorafgaande "defolliculation" van de follikels van de mRNA injectie nodig. De enkele kritische stap is dat de follikel incubatietemperatuur in collagenaseoplossing zorgvuldig worden ingesteld op 36 ° C en mag niet overtreffen.
Voor oplossing veranderingen in elektrofysiologische experimenten vaak de oplossing in de meetkamer wordt gewijzigd, hetgeen een aanzienlijke hoeveelheid tijd kost, afhankelijk van de grootte van de kamer en de perfusiesnelheid. Met de capillaire perfusie vermeden dit.
Het grote nadeel van de expressie van ionenkanalen in Xenopus oocyten is hun grote omvang. Voltage control sneller dan ongeveer 2 ms is moeilijk en zeer snel (<0,5 s) -oplossing veranderingen vereisen ingewikkelde procedures. Bovendien sterk hydrofobe stoffen kunnen bijna zijn onomkeerbaar gebonden aan de eidooier van de eicel.
De hier geschetste methoden hebben ons toegestaan om te onderzoekenin een tijdbesparende wijze de functionele eigenschappen van recombinante GABA A-receptoren, hun modulatie door synthetische stoffen en plantaardige stoffen, hun subeenheid opstelling en de locatie van het geneesmiddel bindingsplaatsen receptoren van verschillende subunit samenstelling. De hier beschreven werkwijzen zijn geschikt voor de expressie van een eiwit van keuze in het Xenopus oöcyt. De eenvoudige werkwijze voor snelle oplossing verandert van het medium rond de eicel kan worden toegepast op de studie van elke ligand-gated ionkanaal of drager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | 71380 | |
| KCl | Sigma | P-9541 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
| CaCl2 | Sigma | 223560 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/mL and 100 μg streptomycin/mL |
| Platinum wire loop | home-made | ||
| Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μL, Type 701N |
| Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
| Nylon net, G: 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
| Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
| Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
| EGTA | Sigma | E3389 | |
| Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 Length mm (for microinjection) |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD x 0.69 ID x 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
| γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
| 3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
| grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
| micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
| Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |
References
- Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).
- Soreq, H. The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes. CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).
- Sigel, E. Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins. J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).
- Dascal, N. The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels. CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).
- Sigel, E. Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid. J Physiol. 386, 73-90 (1987).
- Sigel, E., Minier, F. The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins. Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).
- Colman, A. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. Transcription and Translation'A Practical Approach. Hames, B. D., Higgins, S. J. , IRL Press. Oxford. 49-69 (1984).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M.
- Smart, T. G., Krishek, B. J. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker,, Wolfgang, W. alz , Humana Press. New Jersey. 259-305 (1995).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital. Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity. Sci Rep. 6, 25943 (2016).
- Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).
- Burgunder, J. M., et al. Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese. Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).
- Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes. FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei. J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth. Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).
- Wu, M., Gerhart, J.
- Gurdon, J. B. American clawed frogs. Methods in developmental biology. Wilt, F. H., Wessels, N. K. , Thomas Y. Crowell Co. New York. 75-84 (1967).
- Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation. Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).
- Green, S. L. Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis). Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).
- Kressmann, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. , Plenum Press. 388-407 (1980).
- Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site. Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).
- Dumont, J. N., Brummett, A. R. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues. J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).
- Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate. J Physiol. 352, 551-574 (1984).
- Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides. Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).
- Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function. Neuron. 5, 703-711 (1990).
