Udledning af leptomeninges eksplantatkulturer fra Postmortem menneskehjerne donorer
Summary
Den leptomeninges eksplantat kultur protokol fra human postmortem hjerne er en teknisk robust og enkel måde at udlede fibronektin-positive meningitis fibroblaster inden for 6-8 uger, og Cryopreservering ca. 20-30 millioner celler.
Abstract
Selv om der er gjort store fremskridt i den kliniske karakterisering af Parkinsons sygdom, rapporterer flere undersøgelser, at diagnosticering af Parkinsons sygdom ikke er patologisk bekræftet hos op til 25% af klinisk diagnosticeret Parkinsons sygdom. Derfor væv opsamlet fra klinisk diagnosticerede patienter med idiopatisk Parkinsons sygdom kan have en høj fejldiagnose; dermed in vitro-undersøgelser fra sådanne væv for at studere Parkinsons sygdom som en præklinisk model kan blive forgæves.
Ved at samle postmortem human leptomeninges med en bekræftet neuropatologisk diagnose af Parkinsons sygdom og karakteriseret ved nigrostriatale celletab og intracellulære protein inklusioner kaldet Lewy-legemer, kan man være sikker på, at klinisk observeret parkinsonisme ikke er forårsaget af en anden underliggende sygdomsproces (f.eks tumor, arteriosklerose).
Denne protokol Presents dissektion og forberedelse af postmortem menneskelige leptomeninges til afledning af en meningeal fibroblast kultur. Denne procedure er robust og har en høj succesrate. Udfordringen af kulturen er sterilitet som hjernen indkøb generelt ikke udføres under sterile forhold. Derfor er det vigtigt at supplere dyrkningsmediet med en cocktail af penicillin, streptomycin og amphotericin B.
Udledningen af meningitis fibroblaster fra autopsi-bekræftede tilfælde med Parkinsons sygdom giver grundlaget for in vitro-modellering af Parkinsons sygdom. Meningeal fibroblaster vises 3-9 dage efter prøveforberedelse og omkring 20-30 millioner celler kan kryopræserveres i 6-8 uger. Den meningeal fibroblast kultur er homogen og cellerne udtrykker fibronectin, et almindeligt anvendt markør til at identificere meninges.
Introduction
Meninges består af tre membraner, der beskytter hjernen: dura mater, arachnoid og pia mater. For nylig er det blevet erkendt, at meninges også spille en vigtig rolle i udviklingen af hjernen og hjerne homeostase 1. Meninges er afledt af mesenchymale og crista neuralis-afledte celler og interessant er det blevet vist, at progenitorceller bopæl i meninges kan give anledning til neuroner in vitro og efter transplantation in vivo 2, 3, 4. Meninges kulturer er også med succes anvendt som fødelag, da de besidder stromal celleafledt inducerende aktivitet for differentiering af embryonale stamceller i dopaminerge neuroner 5. Desuden leptomeninges har potentiale til direkte at differentiere til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter under iskæmiske tilstande 6.
Til denne protokol, er humane postmortem meninges prøver indsamlet fra arachnoid og pia mater, kollektivt kaldet leptomeninges, og er indkøbt som en del af en menneskelig hjerne donation til forskningsformål. Dissektion af hjernen er udført inden for 24 timer fra døden og leptomeninges prøven anbringes i koldt vækstmedier til videre forarbejdning i næste 6-8 timer som illustreret her i denne protokol.
Denne protokol beskriver dissektion og fremstilling af humane meninges prøver til udviklingen af patientens primære leptomeninges cellekultur. Vævet skæres i 25-30 stykker af ca. 3 mm x 3 mm kvadrater. Tre stykker anbringes i hver 6-brønds gelatineovertrukket godt og holdes nede med runde dækglas. Den meninges dissektion tager omkring 25-35 min. Den største udfordring med denne kultur er sterilitet som hjernen udtagning, transport og dissektion generelt ikke udføres under sterile betingelser. Therefore, er det vigtigt at supplere dyrkningsmediet med en cocktail af penicillin, streptomycin og amphotericin B og anvende multi-brønds skåle til hver kultur vævsstykker.
Udvækst af meningeal fibroblaster sker normalt inden for den første uge. Mediet skiftes hver to til tre dage, indtil cellerne er sammenflydende og cellerne enzymatisk passage. De meningeale fibroblaster kryokonserveres ved 1 million celler pr ml / hætteglas i kryopræservering medier. Med denne protokol, kan 20-30 millioner meningeal fibroblaster udledes i 6-8 uger for nedfrysning. Downstream anvendelser af disse meningeal fibroblaster er primære kulturer til sygdom forskning, direkte neuronal differentiering eller afledning af inducerede pluripotente stamceller fra leptomeninges for forståelse af sygdomsmekanismer og for lægemiddeludvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en enkel og robust protokol til at udlede en meningeal fibroblast kultur fra humane postmortem leptomeninges indsamlet i forbindelse med en hjerne donation. Der er meget få beskrivelser af protokoller at udlede cellekulturer fra postmortem humant materiale. To studier beskriver hudafledte fibroblastkulturer 7, 8, 9, en undersøgelse beskriver dura prøver 10, og en anden beskriv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was funded by private donations directed to the Parkinson’s Institute Brain Donation Program.
Materials
| Corning Petri dishes | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc 6-well plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| 15-mm cover slips | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Scalpels, sterile blade, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Curved precision tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Gelatin | Sigma | G1890-100G | |
| Phosphate Buffer Solution | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning 500 mL filter unit | Fisher Scientific | 430770 | Combine media components and filter. |
| Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Media | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Fisher Scientific | SH30910.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin Staining | |||
| 8 well chamber slides | Fisher Scientific | 1256518 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 100% Glycerol | BioRad | 9455 | |
| 100% normal goat serum | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anti-Fibronectin antibody [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 dilution in blocking solution |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 dilution in blocking solution |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 dilution in blocking solution |
| Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 dilution in blocking solution |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1:1000 dilution in blocking solution |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit | Thermo Fisher | A11029 | 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 stain | Thermo Fisher | H3570 | dilute to a final concentration of 1.0 μg/ml; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm) |
| Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well. | |||
References
- Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: from protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
- Bifari, F., et al. Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).
- Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Front Cell Neurosci. 9, 383 (2015).
- Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. Neural stem cell niches in health and diseases. Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).
- Hayashi, H., et al. Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells. Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).
- Nakagomi, T., et al. Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain. Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).
- Hjelm, B. E., et al. Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells. Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).
- Hjelm, B. E., et al. In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue. Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).
- Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease–methodological investigations. J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).
- Bliss, L. A., et al. Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures. PLoS One. 7 (9), e45282 (2012).
- Sproul, A. A., et al. Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater. Acta Neuropathol Commun. 2, 4 (2014).
- Adler, C. H., et al. Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study. Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson’s disease: a clinico-pathological study of 100 cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson’s disease. Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).
- Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders. Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. J Vis Exp. (77), e3779 (2013).
- Byers, B., et al. SNCA triplication Parkinson’s patient’s iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress. PLoS One. 6 (11), e26159 (2011).
- Sanders, L. H., et al. LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson’s disease patients: reversal by gene correction. Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).
- Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson’s disease. Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).
