Summary

תורם גזירת תרבויות Leptomeninges explant מן לאחר מות המוח האנושי

Published: January 21, 2017
doi:

Summary

פרוטוקול תרבות leptomeninges explant מהמוח שלאחר מוות האנושי הוא דרך חזקה ופשוט טכניים לגזור פיברובלסטים קרום מוח חיובי פיברונקטין בתוך 6-8 שבועות cryopreserve כ 20-30 מיליון תאים.

Abstract

למרות התקדמות גדולה נעשתה באפיון הקליני של מחלת פרקינסון, מספר מחקרים מדווחים כי האבחנה של מחלת פרקינסון לא אשרה פתולוגית של עד 25% של מאובחנים קליני מחלת פרקינסון. לכן, רקמה שנאספו חולים שאובחנו קלינית עם מחלת פרקינסון אידיופטית יכול יש שיעור גבוה של אבחנה מוטעית; ומכאן במבחנה מרקמות כגון ללמוד מחלת פרקינסון כמודל פרה-קליני יכול להיות עקר.

על ידי איסוף leptomeninges אדם לאחר המוות עם אבחנת נוירו אשרה של מחלת פרקינסון מתאפיין אובדן תא nigrostriatal תכלילים חלבון תאי בשם גופיפי לוי, אחד יכול להיות בטוח כי פרקינסון קליני שנצפה אינו נגרם על ידי אחר תהליך מחלה (למשל גידול, טרשת עורקת).

presen פרוטוקול זהts לנתיחה והכנת leptomeninges אדם לאחר מות גזירה של תרבות פיברובלסטים קרום מוח. הליך זה הוא איתן ויש לה שיעור הצלחה גבוה. האתגר של התרבות הוא סטריליות כמו רכש המוח הוא בדרך כלל לא להתבצע בתנאים סטריליים. לכן, חשוב להשלים את תרבות התקשורת עם קוקטייל של פניצילין, סטרפטומיצין, ו amphotericin B.

על הגזרה של פיברובלסטים קרום מוח ממקרי נתיחה-אשר עם מחלת הפרקינסון מספקת את הבסיס לפיתוח מודלים במבחנה של מחלת פרקינסון. פיברובלסטים קרום המוח להופיע 3-9 ימים לאחר הכנת המדגם כ 20-30 מיליון תאים ניתן cryopreserved ב 6-8 שבועות. תרבות פיברובלסטים קרום המוח היא הומוגנית והתאים להביע פיברונקטין, סמן נפוץ לזהות קרומי המוח.

Introduction

קרום המוח מורכב משלוש ממברנות כי להגן על המוח: דורת מאטר, מאטר נואיד והפיאה. לאחרונה, הוא הוכר כי קרומי המוח גם לשחק תפקיד חשוב הומאוסטזיס התפתחות המוח והמוח 1. קרום המוח נגזר mesenchymal ותאי הנגזרות רכס עצביים ומעניין, הוכיח כי ובתאים המתגוררים קרום מוח יכול להצמיח נוירונים במבחנה ואחרי השתלת in vivo 2, 3, 4. תרבויות קרום המוח כבר גם השתמשו בהצלחה כמו שכבות מזינות, כפי שהוא בעלי פעילות התרמת תאים שמקורם סטרומה לבידול של תאי גזע עובריים לתוך נוירונים דופאמינרגיים 5. יתר על כן, יש leptomeninges פוטנציאל להבדיל ישירות לתוך הנוירונים, האסטרוציטים, ו oligodendrocytes בתנאים איסכמי 6.

עבור פרוטוקול זה, דגימות קרום מוח שלאחר מות אדם נאספות מאטר נואיד ופיאה, שנקראות באופן leptomeninges, ו נרכשות במסגרת תרומת מוח אנושית למטרות מחקר. Dissection של המוח מתבצע תוך 24 שעות של מוות המדגם leptomeninges מושם בתקשורת צמיחה הקרה לעיבוד נוסף בתוך 6-8 השעות הבאות כפי שמודגם כאן בפרוטוקול זה.

פרוטוקול זה מתאר את לנתיחה והכנה דגימות קרום מוח האנושי לפיתוח תרבית תאי leptomeninges העיקרי חולה. הרקמה היא חתכה לתוך 25-30 חתיכות של כ 3 מ"מ x 3 ריבועים מ"מ. שלוש יצירות ממוקמות בכל 6-גם ג'לטין מצופה היטב והחזיקה עם coverslips זכוכית עגול. דיסקציה הקרום המוח לוקח בערך 25-35 דקות. האתגר העיקרי עם תרבות זו הוא עקרות כמו רכש המוח, תחבורה לנתיחה לא מבוצעות בדרך כלל בתנאים סטריליים. Therefore, חשוב להשלים את תרבות התקשורת עם קוקטייל של פניצילין, סטרפטומיצין, ו- B amphotericin ולהשתמש מנות רבות גם בנפרד חתיכות רקמת תרבות.

תולדה של פיברובלסטים קרום המוח מתרחשת בדרך כלל בתוך השבוע הראשון. מדיה מוחלפת מדי יומית שלוש עד תאים ומחוברות התאים passaged enzymatically. הפיברובלסטים קרום המוח הם cryopreserved ב 1 מיליון תאים לכל מ"ל / בקבוקון בתקשורת cryopreservation. עם פרוטוקול זה, 20-30 מיליון פיברובלסטים קרום המוח ניתן לגזור 6-8 שבועות עבור cryopreservation. יישומי Downstream של פיברובלסטים קרום המוח אלה תרבויות עיקריות למחקר מחלה, והבחנה עצבית ישירה או גזירה של תאי גזע מושרים מן leptomeninges להבנה של מנגנוני מחלה ו לפיתוח תרופות.

Protocol

הרשמת תרומת המוח כוללת תיעוד על ידי הנרשם על כוון לתרום. ההרשאה הנתיחה לאחזור רקמות מסופק על ידי קרובי משפחה כפי שמתיר החוק. מחקרים באמצעות דגימות נתיחה שנאספו נבדקים על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי (IRB) על מנת להבטיח עמידת טלטלות דין והחשבון Act ביטוח בריאות תקנות (HIPAA)…

Representative Results

כאשר פרוטוקול עיבוד leptomeninges הצליח, תולדה של פיברובלסטים קרום המוח היא ראשונה שנצפתה שלושה תשעה ימים אחרי הניתוח, אם כי זה יכול להיות תלוי באורך של מרווח שלאחר מוות של המוח. איור 1 מדגים תרבויות פיברובלסטים קרום המוח של ארבעה תורמים שונים. <stro…

Discussion

פרוטוקול זה מתאר פרוטוקול פשוט חזק כדי להפיק תרבות פיברובלסטים קרום מוח מן leptomeninges שלאחר המוות האנושי שנאסף יחד עם תרומת מוח. יש מעט מאוד תיאורים של פרוטוקולים לגזור בתרביות תאים מן החומר האנושי לאחר המוות. שני מחקרים לתאר תרבויות עור נגזרת פיברובלסטים 7,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Development of this protocol was funded by private donations directed to the Parkinson’s Institute Brain Donation Program.

Materials

Corning Petri dishes Fisher Scientific 351029
Nunc 6-well plate Fisher Scientific 14-832-11
15-mm cover slips Fisher Scientific 12-545-83 15CIR-1D
Scalpels, sterile blade, No. 15 Miltex 4-415
Curved precision tip forceps Fisher Scientific 16-100-122
Serological pipettes Fisher Scientific 13-678-11E
Pasteur pipettes Fisher Scientific 22-230490
Gelatin Sigma G1890-100G
Phosphate Buffer Solution Fisher Scientific SH30264.02
Corning 500 mL filter unit Fisher Scientific 430770 Combine media components and filter.
Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2  Thermo Scientific 178883
Name Company Catalog Number Comments
Growth Media
Hyclone DMEM Fisher Scientific SH30081.02
Hyclone FBS Fisher Scientific SH30910.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher 11140-050
GlutaMAX Supplement (100x) Thermo Fisher 35050-061
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher 11360-070
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher 15140-122
Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) Fisher Scientific BP264520
Bambanker Freeze 120 mL Fisher Scientific NC9582225
Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Staining
8 well chamber slides  Fisher Scientific 1256518
20% paraformaldehyde  Electron Microscopy Sciences 15713
Triton X-100  Sigma T8787
100% Glycerol  BioRad 9455
100% normal goat serum  Fisher Scientific 101098-382
Anti-Fibronectin antibody [F1] Abcam ab32419 1:300 dilution in blocking solution
Anti-SERPINH1 Sigma S5950-200ul 1:250 dilution in blocking solution
Anti-SOX2 Millipore MAB4343 1:100 dilution in blocking solution
Anti-Nestin Millipore MAB5326 1:200 dilution in blocking solution
Anti-TUJ1 Covance MMS-435P 1:1000 dilution in blocking solution
Alexa Fluor 488 anti-rabbit Thermo Fisher A11029 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) 
Alexa Fluor 555 anti-mouse Thermo Fisher A21424 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) 
Hoechst 33342 stain Thermo Fisher H3570 dilute to a final concentration of 1.0 μg/ml; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm) 
Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well.

References

  1. Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: from protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
  2. Bifari, F., et al. Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).
  3. Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Front Cell Neurosci. 9, 383 (2015).
  4. Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. Neural stem cell niches in health and diseases. Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).
  5. Hayashi, H., et al. Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells. Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).
  6. Nakagomi, T., et al. Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain. Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).
  7. Hjelm, B. E., et al. Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells. Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).
  8. Hjelm, B. E., et al. In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue. Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).
  9. Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease–methodological investigations. J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).
  10. Bliss, L. A., et al. Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures. PLoS One. 7 (9), e45282 (2012).
  11. Sproul, A. A., et al. Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater. Acta Neuropathol Commun. 2, 4 (2014).
  12. Adler, C. H., et al. Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study. Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).
  13. Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson’s disease: a clinico-pathological study of 100 cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).
  14. Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson’s disease. Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).
  15. Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders. Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).
  16. Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. J Vis Exp. (77), e3779 (2013).
  17. Byers, B., et al. SNCA triplication Parkinson’s patient’s iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress. PLoS One. 6 (11), e26159 (2011).
  18. Sanders, L. H., et al. LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson’s disease patients: reversal by gene correction. Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).
  19. Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson’s disease. Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).

Play Video

Cite This Article
Lee, K., Saetern, O. C., Nguyen, A., Rodriguez, L., Schüle, B. Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors. J. Vis. Exp. (119), e55045, doi:10.3791/55045 (2017).

View Video