Summary
פרוטוקול תרבות leptomeninges explant מהמוח שלאחר מוות האנושי הוא דרך חזקה ופשוט טכניים לגזור פיברובלסטים קרום מוח חיובי פיברונקטין בתוך 6-8 שבועות cryopreserve כ 20-30 מיליון תאים.
Abstract
למרות התקדמות גדולה נעשתה באפיון הקליני של מחלת פרקינסון, מספר מחקרים מדווחים כי האבחנה של מחלת פרקינסון לא אשרה פתולוגית של עד 25% של מאובחנים קליני מחלת פרקינסון. לכן, רקמה שנאספו חולים שאובחנו קלינית עם מחלת פרקינסון אידיופטית יכול יש שיעור גבוה של אבחנה מוטעית; ומכאן במבחנה מרקמות כגון ללמוד מחלת פרקינסון כמודל פרה-קליני יכול להיות עקר.
על ידי איסוף leptomeninges אדם לאחר המוות עם אבחנת נוירו אשרה של מחלת פרקינסון מתאפיין אובדן תא nigrostriatal תכלילים חלבון תאי בשם גופיפי לוי, אחד יכול להיות בטוח כי פרקינסון קליני שנצפה אינו נגרם על ידי אחר תהליך מחלה (למשל גידול, טרשת עורקת).
presen פרוטוקול זהts לנתיחה והכנת leptomeninges אדם לאחר מות גזירה של תרבות פיברובלסטים קרום מוח. הליך זה הוא איתן ויש לה שיעור הצלחה גבוה. האתגר של התרבות הוא סטריליות כמו רכש המוח הוא בדרך כלל לא להתבצע בתנאים סטריליים. לכן, חשוב להשלים את תרבות התקשורת עם קוקטייל של פניצילין, סטרפטומיצין, ו amphotericin B.
על הגזרה של פיברובלסטים קרום מוח ממקרי נתיחה-אשר עם מחלת הפרקינסון מספקת את הבסיס לפיתוח מודלים במבחנה של מחלת פרקינסון. פיברובלסטים קרום המוח להופיע 3-9 ימים לאחר הכנת המדגם כ 20-30 מיליון תאים ניתן cryopreserved ב 6-8 שבועות. תרבות פיברובלסטים קרום המוח היא הומוגנית והתאים להביע פיברונקטין, סמן נפוץ לזהות קרומי המוח.
Introduction
קרום המוח מורכב משלוש ממברנות כי להגן על המוח: דורת מאטר, מאטר נואיד והפיאה. לאחרונה, הוא הוכר כי קרומי המוח גם לשחק תפקיד חשוב הומאוסטזיס התפתחות המוח והמוח 1. קרום המוח נגזר mesenchymal ותאי הנגזרות רכס עצביים ומעניין, הוכיח כי ובתאים המתגוררים קרום מוח יכול להצמיח נוירונים במבחנה ואחרי השתלת in vivo 2, 3, 4. תרבויות קרום המוח כבר גם השתמשו בהצלחה כמו שכבות מזינות, כפי שהוא בעלי פעילות התרמת תאים שמקורם סטרומה לבידול של תאי גזע עובריים לתוך נוירונים דופאמינרגיים 5. יתר על כן, יש leptomeninges פוטנציאל להבדיל ישירות לתוך הנוירונים, האסטרוציטים, ו oligodendrocytes בתנאים איסכמי 6.
עבור פרוטוקול זה, דגימות קרום מוח שלאחר מות אדם נאספות מאטר נואיד ופיאה, שנקראות באופן leptomeninges, ו נרכשות במסגרת תרומת מוח אנושית למטרות מחקר. Dissection של המוח מתבצע תוך 24 שעות של מוות המדגם leptomeninges מושם בתקשורת צמיחה הקרה לעיבוד נוסף בתוך 6-8 השעות הבאות כפי שמודגם כאן בפרוטוקול זה.
פרוטוקול זה מתאר את לנתיחה והכנה דגימות קרום מוח האנושי לפיתוח תרבית תאי leptomeninges העיקרי חולה. הרקמה היא חתכה לתוך 25-30 חתיכות של כ 3 מ"מ x 3 ריבועים מ"מ. שלוש יצירות ממוקמות בכל 6-גם ג'לטין מצופה היטב והחזיקה עם coverslips זכוכית עגול. דיסקציה הקרום המוח לוקח בערך 25-35 דקות. האתגר העיקרי עם תרבות זו הוא עקרות כמו רכש המוח, תחבורה לנתיחה לא מבוצעות בדרך כלל בתנאים סטריליים. Therefore, חשוב להשלים את תרבות התקשורת עם קוקטייל של פניצילין, סטרפטומיצין, ו- B amphotericin ולהשתמש מנות רבות גם בנפרד חתיכות רקמת תרבות.
תולדה של פיברובלסטים קרום המוח מתרחשת בדרך כלל בתוך השבוע הראשון. מדיה מוחלפת מדי יומית שלוש עד תאים ומחוברות התאים passaged enzymatically. הפיברובלסטים קרום המוח הם cryopreserved ב 1 מיליון תאים לכל מ"ל / בקבוקון בתקשורת cryopreservation. עם פרוטוקול זה, 20-30 מיליון פיברובלסטים קרום המוח ניתן לגזור 6-8 שבועות עבור cryopreservation. יישומי Downstream של פיברובלסטים קרום המוח אלה תרבויות עיקריות למחקר מחלה, והבחנה עצבית ישירה או גזירה של תאי גזע מושרים מן leptomeninges להבנה של מנגנוני מחלה ו לפיתוח תרופות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הרשמת תרומת המוח כוללת תיעוד על ידי הנרשם על כוון לתרום. ההרשאה הנתיחה לאחזור רקמות מסופק על ידי קרובי משפחה כפי שמתיר החוק. מחקרים באמצעות דגימות נתיחה שנאספו נבדקים על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי (IRB) על מנת להבטיח עמידת טלטלות דין והחשבון Act ביטוח בריאות תקנות (HIPAA).
הערה: דגימות Leptomeninges נאספות על ידי המבתר או נוירופתולוג המוח במהלך דיסקציה מוח מאוחסנות 50 צינורות חרוטי מיליליטר המכילים תקשורת צמיחת 25-30 מיליליטר קרום מוח. המדגם מאוחסן 4 ° C עד הכנת המדגם. העיבוד צריך להתבצע בהקדם האפשרי כמו את הכדאיות של תאים פוחת עם פוסט מורטם זמן.
1. קמה לפני תחילת Leptomeninges Dissection
הערה: שלבים 1.1 - 1.3 הם להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
- כן תקשורת צמיחה קרום מוח על ידי שילוב 375 מיליליטר של מדיה הנשר השונה של Dulbecco, 100 מיליליטר של סרום שור עובר, 5 מיליליטר 10 מ"מ חומצות אמינו לא חיוניים, 5 מיליליטר 200 מ"מ L- alanyl-L- גלוטמין, 5 מיליליטר 100 פירובט נתרן מ"מ, 5 מ"ל 10,000 U / mL פניצילין / סטרפטומיצין ו -5 מ"ל 250 מיקרוגרם / מ"ל Amphotericin B ב 500 מ"ל יחידת הסינון. סנן ומערבבים. השתמש בחומרי הדפסה של עד ארבעה שבועות.
- מניח את כל החומרים בקבינט הבטיחות הביולוגי לפני התחילה לנתיחה: מנות 4x פטרי, 2x 6 צלחות היטב, 2x אזמלים, 15-20 מעוקר תלוש לכסות 15 מ"מ, חיץ מלוח פוספט (PBS), טפטפות סרולוגיות, aspirating טפטפות.
- הוסף 1 מ"ל של תמיסת הג'לטין סטרילי-autoclaved 0.1% היטב בכל צלחת 6 באר. הגדר את הצלחת בצד במשך 30-60 דקות. כן צלחות 2x 6 באר.
2. הכנת מדגם Leptomeninges
הערה: שלבים 2.1 - 2.3 הם להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
- להוסיף כ 10 מ"ל של PBSצלחת תרבות 10 ס"מ רקמה סטרילית ומניחים המדגם קרומי המוח בצלחת. בעזרת מלקחיים, לשטוף leptomeninges בעדינות עם PBS להסיר דם.
- מעבירים את קרומי המוח לתוך צלחת תרבות חדשה של 10 ס"מ רקמה המכילה 10 מ"ל של PBS טרי ולהמשיך כביסה. חזור על הצורך להסיר דם רב ככל האפשר.
- השימוש בשתי אזמלים, לחתוך leptomeninges רקמה לתוך חתיכה גדולה כ 6 ס"מ X 6 ס"מ.
- מקום המכסה על צלחת תרבות והעברת מיקרוסקופ לנתח במנדף זרימה למינרית אופקי.
3. Dissection של רקמות Leptomeninges
הערה: שלבי 3.1 - 3.3 הן להתבצע בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית אופקי באמצעות מיקרוסקופ לנתח.
- סור כלי דם מאזור על פיסת leptomeninges (שלב 2.3) מספיק גדולה כדי ליצור לפחות חתיכות 20-25 3 מ"מ x 3 מ"מ. החזק את leptomeninges במקום עם אזמל אחד ועם אחרים, להשתמש מו גירוד עדין ורדודtion להפריד את הכלי.
- חותכים ריבועים קטנים של רקמות מאזור מוכן. חותך בתהליך הדרגתי על ידי ביצוע חתיכות גדולות הראשון ולאחר מכן לחתוך אותם לחלקים קטנים יותר.
- השתמש באזמל אחד להחזיק את הרקמה במקום אזמל אחר לחתוך את הרקמה עם תנועת נדנדה. בשל העקביות של רקמות, קשה להחליק את אזמלים אחד נגד השני. זה יהיה רק לקרוע את הרקמה בנפרד תוצאת קצוות משוננים.
- להמשיך ולהוריד את הגזירים לשניים עד ישנם כ חתיכות 20-25 3 מ"מ x 3 מ"מ.
העברה 4. גזור קרום המוח חתיכות לצלחות תרבות רקמות
הערה: שלב 4 הוא להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
- ג'לטין לשאוב מהצלחת 6-היטב (משלב 1.3). הוסף 1 מיליליטר של תקשורת צמיחה קרום מוח היטב כל אחד. בעזרת מלקחיים סטריליות, למקם 3-4 חתיכות ביופסיה לבאר כל אחד.
5. מיקום של תלושים לכסות על Meninges Pieces
הערה: שלבי 5.1 - 5.2 הן להתבצע בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית אופקי באמצעות מיקרוסקופ לנתח.
- מכסים את חתיכות עם 1-2 coverslips עגול 15 מ"מ סטרילית לכל טוב.
- מהדק היטב עם מלקחיים כדי להבטיח את החתיכות נוגעות בתחתית הצלחת. זה מאפשר התקשרות של פיסות רקמה לתחתית הבאר.
- מניחים את צלחת 6-היטב לתוך 37 ° C חממה, 5% CO 2.
6. תחזוקת תרבית תאים
הערה: שלבים 6.1 - 6.3 הם להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית. טפל תרבות מנות בזהירות coverslips לא צריכה לזוז והוציאי את החתיכות קרום המוח.
- אחרי 2 ימים בתרבות, להוסיף 1 מיליליטר נוסף של תקשורת צמיחה קרום מוח הטריה היטב כל אחד.
- ביום 7, בזהירות לשאוב התקשורת ולהוסיף 2 מיליליטר של תקשורת הטריה היטב כל אחד.
- אחרי יום 9, להמשיך לשנות תקשורת צמיחה בכללפני כמה ימים עד התרבות הופכים ומחוברים.
7. Passaging
הערה: כל הצעדים הם להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית. לאחר פיברובלסטים קרום המוח הגרו אל מחוץ פיסות רקמת קרום המוח ולהתחיל לגדול לכיוון הקצוות של כלי התרבות, להרחיב פיברובלסטים קרום מוח לתוך צלחת תרבות גדולה.
- לפני שמתחילים את passaging, מעיל צלחת תרבות עם ג'לטין 1% למשך 15-30 דקות.
- לשאוב התקשורת מצלחת 6-היטב ולשטוף תאים עם 2 מ"ל PBS.
- הוסף 1 מ"ל של טריפסין / EDTA זה היטב לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות. אין צורך להסיר את מכסה מחליק או רקמת קרום המוח בשלב זה.
- כאשר תאים מעוגלים ולהתחיל לנתק, להוסיף 2 מ"ל של התקשורת והתרבות.
- תאי פיפטה מעלה ומטה כדי לשבש את כל הגושים לחלוטין ולהעביר את פתרון התא כדי בצלחת תרבות גדולה.
- השתמש יחס של 1: 3 ל -1: 4 לשלב תאים משלוש מנות 6-היטבכדי בצלחת תרבות T75 אחד.
- לאחר התאים הפיברובלסטים קרום המוח הם ומחוברות צלוחיות תרבות T75, trypsinize את התאים, cryopreserve בתקשורת cryopreservation ב 1x10 6 תאים / מ"ל לכל בקבוקון. בקבוק תרבות T75 אחת עם פיברובלסטים קרום המוח ומחוברות מכיל כ 5-7 מיליון תאים.
.8 אפיון של פיברובלסטים קרום המוח על ידי Immunostaining
הערה: לפני שמתחילים את ההליך, להכין 4% פתרון paraformaldehyde, 5% נורמלי עז בסרום PBS (חסימת חיץ), 0.3% Triton X-100 ב PBS (חיץ permeabilization), יסודי ותיכון פתרונות נוגדנים, ו 1 מיקרוגרם / מ"ל של Hoechst 33,342 מדולל PBS מ 10 מ"ג / מ"ל המניות.
- זרע 15,000 ל -30,000 פיברובלסטים קרום המוח ב שקופיות קאמריות 8-היטב מצופים 0.1% ג'לטין.
- לאחר 24 שעות שבהן תאים מחוברים, לתקן תאים 100 paraformaldehyde μL 4% לכל טוב במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את בארות 3 פעמים עם 1X PBS.
- Permeabilize את התאים עם 150 μL של 0.3% Triton X-100 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את בארות 3 פעמים עם 1X PBS.
- הוספת 200 μL פתרון חסימה (PBS + 5% נסיוב עז נורמלי) עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר.
- לשאוב את הפתרון החוסם, ולהוסיף 150 μL של נוגדנים ראשוניים רצויים מדוללים חסימת פתרון. עבור מכתים כפול, להכין דילולים עובדים של נוגדנים עיקריים צינורות צנטריפוגה נפרדים על קרח כדלקמן:
- כן 1: 300 דילול של פיברונקטין נגד + 1: 200 דילול של אנטי-nestin בחסימת פתרון. כן 1: 250 דילול של אנטי-SERPINH1 + 1: 1,000 דילול של אנטי-Tuj1 בחסימת פתרון. כן 1: 250 דילול-SERPINH1 נגד + 1: 100 דילול של Sox2 אנטי בחסימת פתרון
- דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- שטפו את בארות 3 פעמים עם 1X PBS.
- כן 1 עובד: דילול 400 של fluorescently שכותרתו נוגדנים משני עזים נגד ארנב (ירוק; Ex / Em 2 2 590/617 ננומטר) בתמיסת חסימה ולהוסיף 100 μL היטב כל אחד. דגירה של 1 ש ', בחושך, בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף בארות פעם עם 1x PBS.
- הוספת 100 μL של 1 מיקרוגרם / מ"ל Hoechst 33342 (כחול; Ex / Em 2 358/461 ננומטר) פתרון לכל היטב דגירה בחושך במשך 3 דקות. לשטוף בארות 3 פעמים עם 1X PBS, עוזב בכביסת 1x PBS הסופית באר, ולכסות את השקופית עם רדיד אלומיניום.
- לנתח התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאשר פרוטוקול עיבוד leptomeninges הצליח, תולדה של פיברובלסטים קרום המוח היא ראשונה שנצפתה שלושה תשעה ימים אחרי הניתוח, אם כי זה יכול להיות תלוי באורך של מרווח שלאחר מוות של המוח. איור 1 מדגים תרבויות פיברובלסטים קרום המוח של ארבעה תורמים שונים. איור 1 א מציג פיסת leptomeninges שנערך על ידי תלוש כיסוי זכוכית (קו אלכסוני כהה) ו תולדה פיברובלסטים סביב ארבעה ימים רקמות לאחר עיבוד מתורם 88 בן עם 10 שעות 20 דקות מרווח שלאחר המוות. 1B איור מראה תולדה פיברובלסטים דלילה שבעה ימים שלאחר עיבוד מתורם 70 בן 11 h 45 דק 'מרווח שלאחר המוות. תרשים 1C מציגה תולדה פיברובלסטים 13 ימים לאחר דיסקציה מתורם 88 בן 24 שעות מרווח שלאחר המוות. 1D איור מראה תרבות ומחוברות כי היה passaged לתוך Vess T75ניתן cryopreserved אל ותאי בשלב זה.
פיברובלסטים קרום המוח הם דו קוטבית או רב-קוטבי ויש לי מוארכים או צורות חריגות (איור 2). הם מאופיינים על ידי ביטוי של SERPINH פיברונקטין סמן פיברובלסטים גליקופרוטאין אשר מותאמת אל reticulum endoplasmic (איורים 2A-2C). פיברובלסטים קרום המוח אינם-reactive חיסונית כדי Sry גורם שעתוק (סקס קביעת Y אזור) -Box 2 (Sox2) אשר מהווה סמן עבור תאי גזע שלא עברו התמיינות (איור 2 א). עם זאת, תת-קבוצה של פיברובלסטים leptomeningeal היא חיובית עבור nestin נימה סוג VI ביניים, סמן תא גזע עצביים (איור 2 ב), נוירון ספציפי בכיתה III בטא טובולין (Tuj1) (איור 2 ג).
איור 1.דוגמאות של תולדה של פיברובלסטים קרום המוח מארבעה תורמים שונים. א) פיסת רקמת Leptomeninges מוחזקת באמצעות תלוש כיסוי זכוכית (קו אלכסוני כהה) ו תולדה פיברובלסטים סביב הרקמה נצפה ארבעה ימים לאחר עיבוד מתורם 88 בן עם 10 שעות 20 דקות מרווח שלאחר מוות. B) פיברובלסטים דליל תולדה שבעה ימים שלאחר עיבוד מתורם 70 בן 11 h 45 דק 'פוסט מורטם מרווח. C) תולדה פיברובלסטים meningeal 13 ימים לאחר דיסקציה מתורם 88 בן 24 מרווח שעות שלאחר המוות. ד) תרבות פיברובלסטים קרום המוח ומחוברות passaged לתוך כלי T75. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. Immunost aining עבור קרומי מוח, תא גזע, תאי גזע עצביים, וסמני נוירון. א) מכתים Immunofluorescence עבור פיברובלסטים סמנים SERPINH1 (ירוק) גזע Sox2 סמן תא (אדום). SERPINH1 התבטאה בכל גרעיני התאים נספרו. Sox2 סמן תא גזע לא זוהה בתרבות leptomeninges אלה. B) מכתים Immunofluorescence עבור פיברונקטין סמן ספציפי קרומי המוח (ירוק) בתאי גזע עצביים סמן Nestin (אדום). 52.1% של גרעיני תאים נספרים נמצאו חיוביות היא Nestin ו פיברונקטין. C) מכתים Immunofluorescence עבור SERPINH1 (ירוק) ו Tuj1 סמן העצבי (אדום). 6.9% של גרעינים נספרים נמצאו חיוביות SERPINH1 ו Tuj1. נתוני ספירת תאים נקבעו על ידי שימוש באפשרות בחירה מרובה מונה Cell הידנית על ImageJ. תמונות צבעוניות יחידות הוערכו על ידי ספירת מספר התאים חיובי DAPI בהשוואה למספר תאים חיוביים עבור כל סמן באחוזים.כחוש וגבוה "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| יְוֹם | תוצאות צפויות | |||||
| 3-9 | תולדה של פיברובלסטים קרום המוח הראשונים. | |||||
| 7-18 | פיברובלסטים קרום המוח להתרחב, התרבות הופכת צפופה. שינוי מדיה של 2 מ"ל בכל יום אחר. | |||||
| 18-25 | 6-גם צלחת הופכת ומחוברת, פעם פיברובלסטים קרום מוח הם ומחוברים לשלב שלוש בארות לתוך בקבוק תרבות T75 (מעבר ל 1: 3 ל -1: 4). | |||||
| 26-45 | תוצאות בקבוק תרבות T75 ומחוברות אחת 5-7 מיליון תאים. Cryopreserve פיברובלסטים קרום המוח ב 1 מיליון תאים / בקבוקון. | |||||
Table 1: ציר זמן של תולדה הסלולר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר פרוטוקול פשוט חזק כדי להפיק תרבות פיברובלסטים קרום מוח מן leptomeninges שלאחר המוות האנושי שנאסף יחד עם תרומת מוח. יש מעט מאוד תיאורים של פרוטוקולים לגזור בתרביות תאים מן החומר האנושי לאחר המוות. שני מחקרים לתאר תרבויות עור נגזרת פיברובלסטים 7, 8, 9, מחקר אחד מתאר דגימות הדורות 10, ועוד מתאר שאינו cryopreserved דגימות הדורות קפוא 11.
אנחנו מכינים שתי צלחות 6-היטב עם 2-3 חתיכות רקמה (כ -3 מ"מ x 3 מ"מ) בכל טוב על מנת להבטיח תוצאה והרחבת מספיק לפני cryopreservation. זה קריטי, כי את החלקים קרומי המוח מחוברים המנה תרבות ידי עדינה לחיצה תלוש כיסוי זכוכית סטרילית על פיסות הרקמה כדי להחזיק אותם במקום. ללא coverslip, קרומי המוח חתיכות לא יהיהt לצרף התחתונה של מנת התרבות. תולדה מוצלחת הוא ציין רק כאשר פיסות הרקמה נמצאות בקשר ישיר עם החלק התחתון הפלסטיק. אם חתיכות הרקמה לצוף בתקשורת התרבות, לא תולדת תא מהרקמה הוא ציין. זה צריך להתבצע עם כ -500 μL של צמיחת תקשורת כדי לא לייבש את הדגימות ואז להוסיף עד 1 מיליליטר של תקשורת צמיחה לכלי השיט. אין זה הכרחי כדי להמשיך להשתמש סיליקון להחזיק את התלושים לכסות במקום.
אם הן חתיכות קטנות מ -3 מ"מ x 3 מ"מ, תולדה היא איטית יותר, ובמקרים מסוימים אף תרבויות ומחוברות ניתן להקים. זה קריטי לא לגדל את התאים מדי דליל ואנו ממליצים ביחס פיצול של 1: 3 ל -1: 4. בארות קטנות פרט לאפשר אפשרות של זיהום ניהול טוב יותר. וולס יכול להיות מוזן בנפרד ויש לשנותם טפטפות בין הבארות.
יש לנו נגזרת בהצלחה פיברובלסטים קרום המוח מ -9 דגימות לאחר המוות עם פוstmortem המרווח בין 10-24 שעות. התורמים היו בין 70 ל 88 שנים של גיל ויש משכי מחלת פרקינסון בין 8-31 שנים. אנו מבחינים כי רקמות עם מרווח יותר פוסט-מורטם להימשך זמן רב יותר לפני התאים הראשונים לצמוח מתוך (עד 9 ימים). בדגימות עם מרווח שלאחר המוות קצר, אנו רואים תולדה בהקדם 3 ימים לאחר ההכנה. אנחנו לא שמתם לב הבדל בצמיחה על בסיס גיל של התורם, אבל היו לנו רק תורמים> 70 שנים.
המשמעות של השיטה היא הגזירה של תרבית תאים ראשונית למחלה ניוונית של מערכת העצבים ספורדי כמו מחלת פרקינסון, אשר יכול כעת יתברר רק לאחר 12 הנתיחה, 13, 14 מכיוון שאין מלא בהגדרת מאפיינים קליניים, שיטות הדמיה או סמנים ביולוגיים שיכולים לספק אבחנה ברורה במהלך החיים 15. יש לנו בעבר deveפתח את צעדיו פרוטוקול הגזירה של פיברובלסטים ביופסיות עור בעיקר עבור מקרים מאושרים גנטי של מחלת פרקינסון 16 אשר אפשרו לנו ליצור תאי גזע מושרים וללמוד מנגנוני מחלה 17, 18, אבל הפרוטוקול החדש יהיה מכריע כדי להשוות שינויי נוירו ישירות עם הממצאים במבחנה למחלת פרקינסון ספורדי. למיטב ידיעתנו, זהו הפרוטוקול הראשון הנובעים פיברובלסטים קרום המוח מן leptomeninges האדם הפוסט-מורטם.
תרבויות פיברובלסטים קרום מוח יכולות לשמש ללימוד מנגנונים מולקולריים ישירות הנוגעות מחלה או פציעה או כמקור לתכנות מחדש גרעיני לתאי גזע מושרים או המרה ישירה לתוך תרבויות עצביות כמו במודלים פרה מתקדמים לטיפול במחלת הפרקינסון ספורדי או הפרעות ניווניות אחרות 19. אלה huמודלים חולים הנגזרות אדם מספקים את הבסיס ולהאיץ התקדמות ברפואה אישית ומבריא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Petri dishes | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc 6-well plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| 15-mm cover slips | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Scalpels, sterile blade, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Curved precision tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Gelatin | Sigma | G1890-100G | |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning 500 mL filter unit | Fisher Scientific | 430770 | Combine media components and filter. |
| Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Media | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Fisher Scientific | SH30910.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin Staining | |||
| 8 well chamber slides | Fisher Scientific | 1256518 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 100% Glycerol | BioRad | 9455 | |
| 100% normal goat serum | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anti-Fibronectin antibody [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 dilution in blocking solution |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 dilution in blocking solution |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 dilution in blocking solution |
| Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 dilution in blocking solution |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1:1,000 dilution in blocking solution |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit | Thermo Fisher | A11029 | 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 stain | Thermo Fisher | H3570 | dilute to a final concentration of 1.0 μg/mL; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm) |
| Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well. | |||
References
- Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. Meninges: from protective membrane to stem cell niche. Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).
- Bifari, F., et al. Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).
- Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Front Cell Neurosci. 9, 383 (2015).
- Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. Neural stem cell niches in health and diseases. Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).
- Hayashi, H., et al. Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells. Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).
- Nakagomi, T., et al. Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain. Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).
- Hjelm, B. E., et al. Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells. Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).
- Hjelm, B. E., et al. In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue. Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).
- Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease--methodological investigations. J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).
- Bliss, L. A., et al. Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures. PLoS One. 7 (9), e45282 (2012).
- Sproul, A. A., et al. Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater. Acta Neuropathol Commun. 2, 4 (2014).
- Adler, C. H., et al. Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study. Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson's disease: a clinico-pathological study of 100 cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).
- Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson's disease. Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).
- Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders. Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).
- Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. J Vis Exp. (77), e3779 (2013).
- Byers, B., et al. SNCA triplication Parkinson's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress. PLoS One. 6 (11), e26159 (2011).
- Sanders, L. H., et al. LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson's disease patients: reversal by gene correction. Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).
- Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson's disease. Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).
