Den leptomeninges Explantation kultur protokoll från Human obduktion hjärnan är en tekniskt robust och enkelt sätt att härleda fibronektin-positiva meningeal fibroblaster inom 6-8 veckor och cryopreserve 20-30 miljoner celler.
Även om stora framsteg har gjorts i den kliniska karakterisering av Parkinsons sjukdom, flera studier rapporterar att diagnosen av Parkinsons sjukdom inte är patologiskt bekräftad hos upp till 25% av kliniskt diagnostiserade Parkinsons sjukdom. Därför vävnad uppsamlas från kliniskt diagnostiserade patienter med idiopatisk Parkinsons sjukdom kan ha en hög frekvens av fel diagnos; därmed in vitro-studier från sådana vävnader för att studera Parkinsons sjukdom som en preklinisk modell kan bli meningslös.
Genom att samla obduktion mänskliga leptomeninges med en bekräftad neuropatologisk diagnos av Parkinsons sjukdom och kännetecknas av nigrostriatala cellförlust och intracellulära proteininneslutningar kallade Lewy bodies, kan man vara säker på att kliniskt observerade parkinsonism inte orsakas av en annan bakomliggande sjukdomsprocessen (t.ex. tumör, arterioskleros).
Detta protokoll prets dissekering och beredning av postmortem humana leptomeninges för härledning av en meningeal fibroblast kultur. Detta förfarande är robust och har en stor framgång. Utmaningen av kulturen är sterilitet som hjärnan upphandling i allmänhet inte utförs under sterila förhållanden. Därför är det viktigt att komplettera odlingsmediet med en cocktail av penicillin, streptomycin och amfotericin B.
Härledning av meningeal fibroblaster från obduktion bekräftade fall med Parkinsons sjukdom utgör grunden för in vitro-modellering av Parkinsons sjukdom. Meningeal fibroblaster visas 3-9 dygn efter provprepareringen och ca 20-30 miljoner celler kan kryokonserveras i 6-8 veckor. Meningeal fibroblast kulturen är homogen och cellerna uttrycker fibronektin, en vanligen använd markör för att identifiera hjärnhinnorna.
Mening består av tre membran som skyddar hjärnan: dura mater, spindelvävshinnan och pia mater. På senare tid har det varit känt att hjärnhinnorna spelar också en viktig roll i hjärnans utveckling och hjärn homeostas en. Meninges är härledda från mesenkymal och neurallist-härledda celler, och intressant nog, har det visat sig att progenitorceller som bor i hjärnhinnorna kan ge upphov till neuroner in vitro och efter transplantation in vivo 2, 3, 4. Meninges kulturer har också med framgång använts som matarskikt, eftersom de besitter stromal derived inducerande aktivitet för differentiering av embryonala stamceller i dopaminerga neuroner 5. Dessutom leptomeninges har potential att direkt differentiera till neuroner, astrocyter och oligodendrocyter i ischemiska tillstånd 6.
För detta protokoll är Human obduktion meningprover från spindelvävshinnan och pia mater, kollektivt kallas leptomeninges, och upphandlas som en del av en mänsklig hjärna donation för forskningsändamål. Dissekering av hjärnan utförs inom 24 timmar från döden och leptomeninges provet placeras i kallt odlingsmedier för vidare bearbetning inom de närmaste 6-8 h som visas här i detta protokoll.
Detta protokoll beskriver dissekering och beredning av humana mening prover för utveckling av patientens primär leptomeninges cellodling. Vävnaden skärs i 25-30 bitar av ungefär 3 mm x 3 mm rutor. Tre stycken är placerade i varje sex brunnar gelatin-belagda brunnen och hålls nere med runda glas täck. Hjärnhinnorna dissektion tar ca 25-35 min. Den största utmaningen med denna kultur är sterilitet som hjärnan upphandling, transport, och dissektion i allmänhet inte utförs under sterila förhållanden. Thärför, är det viktigt att komplettera odlingsmediet med en cocktail av penicillin, streptomycin och amfotericin B och använda multi-brunnar för att separat kultur vävnadsbitar.
Utväxt av meningeal fibroblaster sker vanligtvis inom den första veckan. Media byts var två till tre dagar tills cellerna är konfluenta och cellerna enzymatiskt passe. Meningeal fibroblaster är frysförvarade på 1 miljon celler per ml / flaska i frysförvaring medier. Med detta protokoll, kan 20-30 miljoner meningeala fibroblaster härledas i 6-8 veckor för frysförvaring. Nedströms tillämpningar av dessa meningeal fibroblaster är primära kulturer för sjukdom forskning, direkt neuronal differentiering eller härledning av inducerade pluripotenta stamceller från leptomeninges för att förstå sjukdomsmekanismer och för läkemedelsutveckling.
Detta protokoll beskriver en enkel och robust protokoll för att härleda en meningeal fibroblast kultur från Human obduktion leptomeninges samlats i samband med en hjärna donation. Det finns mycket få beskrivningar av protokoll för att härleda cellkulturer från obduktions humant material. Två studier beskriver hud härrörande fibroblastkulturer 7, 8, 9, beskriver en studie dura prov 10, och en a…
The authors have nothing to disclose.
Development of this protocol was funded by private donations directed to the Parkinson’s Institute Brain Donation Program.
Corning Petri dishes | Fisher Scientific | 351029 | |
Nunc 6-well plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
15-mm cover slips | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
Scalpels, sterile blade, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
Curved precision tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
Serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 22-230490 | |
Gelatin | Sigma | G1890-100G | |
Phosphate Buffer Solution | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
Corning 500 mL filter unit | Fisher Scientific | 430770 | Combine media components and filter. |
Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Growth Media | |||
Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
Hyclone FBS | Fisher Scientific | SH30910.03 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fibronectin Staining | |||
8 well chamber slides | Fisher Scientific | 1256518 | |
20% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
100% Glycerol | BioRad | 9455 | |
100% normal goat serum | Fisher Scientific | 101098-382 | |
Anti-Fibronectin antibody [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 dilution in blocking solution |
Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 dilution in blocking solution |
Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 dilution in blocking solution |
Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 dilution in blocking solution |
Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1:1000 dilution in blocking solution |
Alexa Fluor 488 anti-rabbit | Thermo Fisher | A11029 | 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) |
Alexa Fluor 555 anti-mouse | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) |
Hoechst 33342 stain | Thermo Fisher | H3570 | dilute to a final concentration of 1.0 μg/ml; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm) |
Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well. |