Abstract
Эффективность антибактериальных кандидатов лечения должно быть продемонстрировано на животных моделях инфекции в качестве составной части процесса открытия и разработки, предпочтительно в моделях, которые имитируют намеченную клинических показаний. Способ индукции устойчивых инфекций легких у иммунокомпетентных крыс и мышей описано , что позволяет для оценки лечения в модели серьезной пневмонии , вызванной S. Пневмококк, H.influenzae , , P.aeruginosa , К. А. Пневмококк или baumannii. Животных анестезировали, и на основе агара прививочный материал проникает глубоко в легкие через трахею нехирургических интубации. Полученная инфекция соответствует, воспроизводимым и стабильным в течение по крайней мере 48 часов и до 96 часов для большинства изолятов. Исследования с использованием антибактериальных на рынке продемонстрировали хорошую корреляцию между эффективностью в естественных условиях и в пробирке восприимчивости, а также соответствие между фармакокинетических / фармакодинамических целей определяетсяв этой модели и клинически принятых целей наблюдалось. Несмотря на то, есть первоначальные инвестиции времени при изучении техники, она может быть выполнена быстро и эффективно, как только знание достигается. Преимущества модели включают в себя устранение нейтропенической требования, повышенную надежность и воспроизводимость, способность к обучению более патогены и изолятов, улучшенную гибкость при проектировании исследования и создания сложных инфекции в иммунокомпетентных хозяина.
Introduction
Оценка эффективности потенциальных кандидатов наркотиков в животных моделях инфекции является одним из важнейших компонентов процесса обнаружения наркотиков антибактериальной. Эффективность in vivo исследования дают важные данные для принятия решений по размаху усилий обнаружения, от выяснении отношений структура-активность (SAR) и оптимизации свинца химической серии через определяющего фармакокинетический-фармакодинамических (PK / PD) характеристики соединений и поддерживая подбор дозы для клиническое развитие и одобрение регулирующих органов. Многочисленные модели инфекции для животных описаны в литературе для этих целей. Одним из наиболее распространенных и широко используемых моделей является нейтропенией инфекция бедренная мышь, которая была впервые Eagle 1, 2 и позже расширен Vogelman и Крэйг 3, 4. Эта модель была неоценима для поддержки определения бактериальных восприимчивости контрольных точек и для обеспечения PK / PD цели для руководства человека дозирования. Есть много экзаменПлес , где прогностическая способность этой модели была доказана 4-7. Тем не менее, одним из недостатков модели инфекции бедра является отсутствие прямое отношение к легочных инфекций. Существует в настоящее время больший акцент на соответствие сайта инфекции на животных моделях к месту инфекции в организме человека; и, таким образом, для изучения соединений для лечения воспаления легких, он идеально подходит для использования инфекции модель легких у животных.
Известно несколько способов индукции инфекций легких у лабораторных животных, были описаны и использованы для антибактериальных исследований эффективности в том числе интраназального ингаляции, аспирации через ротоглотки маршрут, аэрозольной и хирургической трахею инокуляции 8. Во многих случаях животные (в частности, мыши), в первую очередь должны визуализироваться с нейтропенией, чтобы достичь надежной легочной инфекции. Несмотря на это сильно ослабленным иммунитетом государства, число бактериальных патогенов и штаммов, которые производят жизнеспособные инфекции у грызуновограниченное. Например, это может быть трудно , чтобы успешно установить гемофильной инфекции или Acinetobacter baumannii пневмонии моделей 9, 10 и даже более вирулентных патогенов, таких как Пневмококк, синегнойной палочки и Klebsiella пневмонии, могут создавать проблемы 11-13.
В 1991 году Смит описал модель легочной инфекции у иммунокомпетентных крыс сосущих , в котором инфекция была установлена прививая бактерии непосредственно в легкие с помощью простого нехирургическим трахею методом 14 интубации. Берри и др. позже модифицировал метод заражения мышей 15. Использование агар на основе посевного материала , эта техника прививка вызывает устойчивые инфекции легких в обоих иммунокомпетентных крыс и мышей с S. Пневмококк, H.influenzae , К. Пневмококк, P.aeruginosa , и А. baumannii. Она поддается широкому спектру изолятов, в том числе различные укрывает сопротивлениеANCE детерминанты и те, которые не производят жизнеспособное инфекции с помощью других инокуляции маршрутов. Она также позволяет эффективность должна определяться в иммунокомпетентных животных, состояние, которое является более актуальной, чем традиционная нейтропенической модели мыши для групп пациентов, которые не сильно ослабленным иммунитетом. Последовательность и надежность этой модели по нескольким патогенам и изолятов делает его хорошо подходит для антибактериальных исследований эффективности.
Protocol
С. pneumonie
Все процедуры в соответствии с протоколами, утвержденными по уходу и использованию животных комитета ГСК Institutional (IACUC) путем, и соответствуют или превосходят стандарты Американской ассоциации по аккредитации лабораторных животных (AAALAC), США Департамент здравоохранения и человека Услуги и все местные и федеральные законы благосостояния животных.
Примечание: Если не указано иное, все процедуры должны выполняться с использованием асептической техники.
1. Культура бактериальных изолятов
- Подготовьте 3 до 6 агаром с S.pneumoniae , H.influenzae , или, в качестве бульона культуры в целом не дает достаточно материала для прививки.
- Удаление замороженного исходной культуры от хранения при -80 ° С, оттаивают полностью, а полоса до 100 мкл на чашку на трипсинизированном соевом агаре с добавлением овечьей кровью (S.pneumoniae , ) или на шоколадный агар (H.influenzae , ) с использованием стандартных микробиологических методов, Инкубируют в течение ночи при температуре 37 ° С с добавлением или без 5% CO 2.
- Приготовьте бульонных культур с К. Пневмококк, P.aeruginosa , или A. baumannii.
- Удаление замороженного исходной культуры от хранения при -80 ° С, оттаивают полностью, и аликвоты по 100 мкл запаса в 50 мл сердечно-мозговой инфузии (BHI) бульоне. Инкубируют в течение ночи при температуре 37 ° С при осторожном встряхивании (приблизительно 120 оборотов в минуту).
- [Необязательно] Если фаза журнала культуры желательно, аликвоту 1 мл из полученной ночной культуры в 50 мл свежего BHI бульона. Выдержите в течение 3 ч при температуре 37 ° С при осторожном встряхивании (приблизительно 120 оборотов в минуту).
2. Подготовить физиологический раствор бактериальная суспензия
- Для всех этапов приготовления суспензии (2,1 до 2,3), используют стерильном физиологическом растворе при температуре от окружающего воздуха и температуре 37 ° С. Урожай в течение ночи рост S.pneumoniae , H.influenzae , или из чашки с агаром путем соскоба колонийс поверхности стерильной петлей. Перенесите собранный материал в 5 мл стерильного физиологического раствора до облачный, непрозрачные суспензию и осторожно вихревое до гомогенного состояния.
- Центрифуга 50 мл К. Пневмококк, П. палочки или A. baumannii окончательный бульонные культуры , предназначенные для прививки (например , на ночь или логарифмической фазы культуры) в течение 5 мин при 4500 х г. Удалить супернатант с пипеткой и выбросьте. Ресуспендируют осадок в по крайней мере, 5 мл стерильного физиологического раствора и осторожно перемешивают, чтобы получить гомогенную суспензию.
- При необходимости разбавления суспензии в дальнейшем с помощью стерильного физиологического раствора , чтобы получить плотность в диапазоне от 8 до 9 Log 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл. Аликвоту для определения КОЕ / мл. Серийно разбавить и пластинчатые аликвоты, как описано в разделах 7.5 и 7.6.
3. Подготовка посевного материала на основе агара
- Подготовьте небольшую бутылку (приблизительно 50 мл) питательный агар Accorдинь с инструкциями изготовителя или расплавить бутылку твердого питательный агар, который ранее был подготовлен и хранится. Дайте ему остыть примерно до 50 ° C.
- Транспортировка жидкого агара и все необходимые инструменты и оборудование для инфекционного процесса в области процедуры, где будут заражены животные. Поддерживать небольшую ванну воды установлена на уровне 42 ° C в этой области.
- Дайте агара до температуры приблизительно 50 ° С, а затем аликвоты 9 мл в стерильную пробирку соответствующего размера, чтобы вписаться в водяную баню. Оставьте эту трубку в водяной бане до тех пор, пока агар уравновешивает до приблизительно 42 ° С. Убедитесь, что вода находится на глубине, которая покроет поверхность агара в своем контейнере, но не трогать крышку или крышку.
- Добавить 1 мл физиологического раствора бактериальной суспензии со стадии 2.3 в пробирку, содержащую 9 мл агара в водяной бане. Закрывают трубку, переверните несколько раз перемешать, и вернуть его в водяной бане.
4.nesthetize, интубации и Инокулируйте Животные
рекомендуется 25 г - специфических патогенов (SPF) иммунокомпетентных мужской Sprague-Dawley крыс весом 100 - 120 г или самцов мышей CD-1 весом 20: Примечание. Обеспечить всех животных с пищей и водой без ограничений и разместить их на социально древесной щепы или других впитывающих постельных принадлежностей со стандартными 12 ч светло-темного цикла.
- Перед проведением каких-либо экспериментов, получить и стерилизовать металлической канюли и полиэтиленовых труб соответствующего размера для данного вида животных. Получают стерильные 1 мл одноразовые шприцы и стерильные одноразовые иглы 25 калибра.
Внимание: Всегда уничтожайте эти шприцы и иглы в контейнер для острых предметов.- Для крыс, приобретение или изготовление металлической канюлей, которая составляет около 12 см в длину, имеет идентификатор 0,9 - 1,0 мм и наружным диаметром 1,0 - 1,2 мм, и согнут приблизительно под углом 45 ° на одном конце. Вырезать 11- до 12-дюймовый длина полиэтиленовых труб с ID 0,4 мм и внешним диаметром 0,8 мм. (Ссылаться на
- Для мышей, купить # 20 кормлении животных пробирку. Удалить мяч из конца трубки, захватив ее с помощью плоскогубцев и резко потянув, а затем аккуратно согнуть конец к приближенному под углом 45 °. Вырезать 11- до 12-дюймовый длина полиэтиленовых труб с ID 0,28 мм и наружным диаметром 0,61 мм. Также приобрести и стерилизовать стекла 100 мкл микро-инъекции шприц и 30 калибра металла микро-инъекции иглу. (Смотрите рисунок 1В) .
- Поместите металлическую канюлю в стеклянной, с завинчивающейся крышкой трубки и автоклав с помощью стандартных методов стерилизации. Замочить и хранить отрезками полиэтиленовых труб в закрытом химическом стакане, содержащий спирт.
- Для крыс, приобретение или изготовление металлической канюлей, которая составляет около 12 см в длину, имеет идентификатор 0,9 - 1,0 мм и наружным диаметром 1,0 - 1,2 мм, и согнут приблизительно под углом 45 ° на одном конце. Вырезать 11- до 12-дюймовый длина полиэтиленовых труб с ID 0,4 мм и внешним диаметром 0,8 мм. (Ссылаться на
- Подготовьте рабочую поверхность и интубации устройство.
- Поместите чистый одноразовый коврик на рабочую поверхность, близкую к водяной бане. Перенести металлическую канюлю, в трубке хранения стекла, на эту поверхность. Снимите колпачок с трубки хранения и сдвиньте "ручку" конец cannuла к открытому концу трубы.
- С помощью стерильного пинцета, удалить одну длину полиэтиленовых труб из стакана и вставить его через внутреннюю часть стерильной металлической канюлей, убедившись, что он свободно перемещается. Установить стерильные одноразовые 25 иглы калибра (для крыс) или стерилизованного 30 калибра металлической иглы из стеклянной микро-шприц для инъекций (для мышей) на свободный конец полиэтиленовой трубы, сдвинув игольные несколько мм в трубку. (Смотрите рисунок 1А для крыс и фигуре 1В для мышей).
- Поместите направляющие метки на обеих металлической канюлей и полиэтиленовые трубки, чтобы указать глубину вставки в животном, следуя процедуре, описанной ниже интубации на одном эвтаназии животных. Откройте грудной полости для наблюдения, а затем поместить металлическую полую иглу правильно и продвижения полиэтиленовой трубки соответственно (как описано в разделе 4.7). Использование несмываемыми, отметьте металлическую канюлю, где он отвечает рот животного и полиэтилена трубы, где она соприкасается с верхней металлической канюлей, чтобы помочь надлежащее размещение в остальных животных.
- В пределах вытяжном шкафу (или с помощью соответствующей системы продувкой), анестезию до 6 животных в то время, в закрытой камере, поставляемой с ≤5% изофлуран в 1,5 л / мин кислорода до тех пор, рвотный рефлекс не тормозится (приблизительно 1 мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед проведением каких - либо экспериментов, установить безопасные дозы и время облучения для изофлуран в конкретных условиях используются (например , размер / тип камеры и размер / вида / штамма животного) для предотвращения случайного летальный воздействия. - Заполните стерильные одноразовые 1 мл шприц (для крыс) стерильным физиологическим раствором, помещая стерильный наконечник в солевом растворе и отходили на поршень. Заполните стерильные стеклянные микроинъекции шприц (для мышей), как описано ниже. Приложить шприц с иглой устанавливают на полиэтиленовые трубки, и смывать весь объем физиологического раствора через трубку, пока syringе опорожняется.
- Для того, чтобы заполнить микро-инъекции шприц (для мышей), полностью удалить металлический поршень и иглу (имеющей на полиэтиленовую трубку) из шприца и установить как в сторону.
- Наполните стерильный одноразовый шприц емкостью 1 мл стерильным физиологическим раствором (как описано выше) и прикрепить стерильные одноразовые 25 иглы калибра. Вставьте иглу в верхней части микро-шприц для инъекций (где металл плунжер будет вставлен), и нажать на поршень шприца одноразового, пока он не заполняет микро-инъекции шприц с физиологическим раствором.
- Выбросите одноразовый шприц и иглу, которые были использованы для заполнения микро-инъекции шприц в контейнер для острых предметов. Повторно прикрепить металлическую микроинъекции иглу (устанавливают на полиэтиленовые трубки) до кончика микроинъекции шприца и повторно вставьте металлический поршень, удручает, пока весь объем физиологического раствора не продувают через шприц и трубку.
- Заполните шприц с посевного материала на основе агара сюдам контейнер в водяной бане, а также флеш - агар через трубопровод только до тех пор , пока трубка грунтуется (например , полностью заполняется агара).
- Для крыс, удалите 25-датчик иглы (устанавливают на полиэтиленовые трубки) из одноразового шприца. Выбросить использованный шприц в контейнер для острых предметов. Заполните новый, стерильные одноразовые шприц емкостью 1 мл с агаровой основе посевного материала из контейнера в водяной бане, помещая стерильный наконечник в инокулята и отходили на поршень. Повторно прикрепить иглу (устанавливают на полиэтиленовые трубки) и флеш-агар через трубку путем нажатия на поршень только до тех пор, пока трубка полностью заполнена агара.
- Для мышей, снимите металлическую микроинъекции иглу (имеющей на полиэтиленовую трубку) и металлический поршень из микро-шприц для инъекций и отложить в сторону. С помощью стерильной одноразовой шприц емкостью 1 мл и стерильные одноразовые 25 иглы калибра, заполнить микроинъекции шприц с агаровой основе посевного материала из контейнера вводяная баня с использованием процедуры заполнения, описанной в разделе 4.4. Повторно прикрепить металлическую микроинъекции иглу (имеющей на полиэтиленовую трубку), вставьте металлический поршень и флеш-агар через трубопровод только до тех пор, пока трубка полностью заполнена агара.
- Удалить одно животное из анестезирующего камеры. Место животное в лежачем положении на одноразовом мата с головы вправо и хвост влево , как показано на фиг.1С.
- Использование интубации устройства (т.е. металлической канюлей , снабженной полиэтиленовой трубкой), интубации животное и вставить канюлю в толстую доли левого легкого (рис 1D).
- Вставьте свободный конец металлической канюли в рот животного. Включите полую иглу так, чтобы свободный конец наклонен вверх и аккуратно продвигать его в трахею, тщательно обходя гортанной структуры с движением небольшим вращательным. Подтверждение вставки в трахею в противоположностьпищевод, осторожно переместив канюлю немного вперед и назад несколько раз , пока пальпации трахеи кольца с левого указательного пальца , как показано на рисунке 1C.
- Когда канюля достигает развилки, где трахея разделяется на левый и правый бронхи, делают небольшое вращательным движением в направлении левой стороны животного, чтобы гарантировать, что канюля вставляется в левый бронх. Авансовые металлическую полую иглу до конца не находится на полпути до трех четвертей вниз левого легкого, с использованием ранее размещенных знак направляющей, чтобы подтвердить, что соответствующая глубина достигнута.
- С помощью металлической канюлей в месте, продвигать полиэтиленовые трубки, несколько мм. Используйте ранее размещенных отметку направляющей на трубопроводе, чтобы обеспечить его продвинулся достаточно далеко только для выхода из конца металлической канюлей и не проколоть легких.
- С обеих канюль в месте, используйте прилагаемый шприц, чтобы привить 100 мкл (для крыс) или 20 мкл (для мышей) агара suspension глубоко в большой доле левого легкого (рис 1D). Вывод несколько мм полиэтиленовой трубки, а затем осторожно удалить неповрежденную устройство интубации. Установите его обратно в трубу хранения стекла, и переместить животное в новую клетку, чтобы восстановиться.
- Продолжить обезболивающее, интубации и модифицирования оставшихся животных.
- Между партиями анестезированных животных, удалить иглу (устанавливают на трубку) из шприца. Для крыс, выбросьте использованный одноразовый шприц в контейнер для острых предметов и заполнить новый, стерильный одноразовый шприц из посевного материала в водяной бане. Для мышей, пополнить же стеклянный микро-инъекции шприц из посевного материала в водяной бане с использованием методики, описанной заливки в разделе 4.4.
- Если агар начинает сгущаться в интубации устройстве, промойте всю оставшуюся агара через трубку. Извлеките иглу из шприца (выход из иглы устанавливают на полиэтиленовую трубку). Выполните процедуры, описанныев разделе 4.4, чтобы смыть теплой, стерильного физиологического раствора через интубации устройство, повторяя по мере необходимости, чтобы полностью очистить любые блокировки. Слейте физиологический раствор из шприца и готовят агар прививочный материал снова, как описано в разделе 4.5.
- Расчета конечного бактериального инокулята на одно животное с использованием КОЕ определяется из соляного суспензии (см раздел 2.3), конечный коэффициент разбавления соляного суспензией в агар (например , в десять раз выше ), а также объем закапывают в животных (например , 100 мкл для крысы или 20 мкл для мышей).
5. Оценка животных для потенциальных MIS-прививкой или других неблагоприятных событий
- Тщательно соблюдайте все животные во время интубации, инстилляцию агар и восстановления от наркоза для оценки потенциального неправильному прививки. Сразу эвтаназии (в соответствии с местными правилами IACUC) любому животному, которое кровоточит, обнаруживает аномальное дыхание (например, затрудненное дыхание или затрудненное дыхание), не двигаетсякак правило, о клетке, или не кажутся яркими глазами и здоровыми после выхода из наркоза.
- Если спонтанная остановка дыхания происходит (как правило, когда прививочный материал не помещается достаточно глубоко и блокирует дыхательные пути), подтверждают смерть путем наблюдения и выполнить дополнительный метод эвтаназии (например, цервикальной дислокации или торакотомии).
- Сведение к минимуму продолжительность времени животных подвергаются изофлуран, в качестве анестезии требуется только в течение нескольких минут, чтобы выполнить процедуру. Если используются инъекционные анестетики, убедитесь, что животные находятся под наблюдением до полного бодрствования. Поместите животных, особенно мышей, в обогреваемой среде для восстановления при использовании инъекционных анестетиков.
- Обратите внимание животных, по крайней мере два раза в день в течение периода исследования для следующих признаков респираторного заболевания: выраженного дыхания, пилоэрекции, снижение активности и снижение температуры тела. Сразу эвтаназии (в соответствии с местными правилами IACUC) любое животное, которое умирающий, experieNCES затрудненное дыхание или респираторный дистресс-синдром, имеет заметно пониженную температуру тела при обращении, не может или не желает двигаться, или не может достичь пищи и воды.
6. Администрирование Обработки
- Подготовка и администрирование тестовых методов лечения в соответствии с запланированным дизайном исследования. Начните введение процедур на 1 или 2 ч после инфицирования (или отложить лечение еще больше, если более высокий базовый уровень бактериальной Бремя желательно). Конкретные детали для подготовки и введения тестируемых лечения не может быть дано как она зависит от цели исследования, а также от свойств каждого отдельного лечения. (На рисунке 3 в качестве примера.)
- Отложите одну группу инфицированных, необработанных животных, чтобы служить в качестве базовых элементов управления. Перечислять бактериальную нагрузку в легких этих животных при лечении время инициируется для других групп, следуя процедурам, описанным в разделе 7.
- Для PK / PD анализ, оценкафармакокинетический профиль проводимого лечения (ов) в крови и / или тканях инфицированных животных. Конкретные процедуры для фармакокинетических исследований выходят за рамки данной статьи.
7. Перечислите жизнеспособные бактерии из Легких
- Эвтаназии одной группой необработанных животных, в то время начала лечения для других групп объектов (базовый уровень) и всех остальных животных в конце периода исследования (как правило, 24, 48 или 96 ч после заражения) путем воздействия на органы дыхания постепенно растущих уровней углерода диоксид внутри закрытой камеры или альтернативного способа в соответствии с рекомендациями местных руководящих принципов IACUC. Проверьте смерть путем наблюдения, а также выполнять дополнительный метод эвтаназии (например, цервикальной дислокации или торакотомии).
- Поместите животных в лежачем положении на чистую располагаемого мата, и тщательно смочить шерсть на груди с алкоголем.
- Использование стерильных ножниц, вырезать через кожу, лежащий в основе мышечного слоя и грудная клетка, параллельно грудине, чтобы открыть грудной полости. Аккуратно возьмитесь легкие с стерильным пинцетом и потяните, чтобы удалить, используя ножницы, чтобы отделить их от трахеи, при необходимости. Поместите легкие на стерильную марлю, чтобы поглотить избыток крови. Если сердце также была удалена, рассекают его подальше и выбросить.
- Сделать небольшие надрезы в легких с стерильными ножницами, чтобы показать внутренние секции и использовать стерильного пинцета поместить легкие (плюс любые куски, которые были неосторожно отхватил) в нижней части лаборатории блендера мешок. Кратко катиться толстый круглый предмет (например, ручкой или маркером) по внешней стороне сумки, чтобы помять ткань. Пипетка 1 мл стерильного физиологического раствора в мешок, поместите мешок в лаборатории блендере, и запустить лабораторный блендер на высокой скорости в течение 2 мин.
- Передача гомогенизируют образцы из смешанных мешков в пробирки или пластины с помощью пипетки. Развести гомогената в десять раз по aliquotting 1-часть гомогената в 9-ти частей физиологического раствора (например, 100 мкл гомогената в 900 мкл Салинд). Разведите полученной суспензии в десять раз снова аналогичным образом. Продолжайте разбавлением каждую новую полученную суспензию другим десятикратного фактора, пока по крайней мере, 6 серийных разведений были получены из оригинального гомогената.
- Пипетка тройные аликвоты по 20 мкл каждого из всех разведений на чашки с агаром Триптиказно сои с добавлением овечьей крови (S.pneumoniae , К. пневмонии, синегнойной или A. baumannii) или на шоколадный агар пластин (H. гриппа). Инкубируют в течение ночи при температуре 37 ° С с добавлением или без СО 2. (См фиг.1Е для примера результирующей пластины.)
- Подсчитывают колонии в каждой из трех повторах в первом выбранном разведении , который содержит "счетный" число (т.е. не слишком много колоний в разумных пределах в счет). Вычислить среднее значение трех повторах. Определение КОЕ в легких путем умножения среднего значения на 50 (на счет для металлизации 20 мкл общего 1 млгомогенат) и факторинг в конечном коэффициент разбавления от первоначального гомогената, при которой подсчитывались колонии.
Representative Results
Требуются инструменты, ориентация животного, и глубина интубации показаны на рисунке 1. Также показан репрезентативный пример колоний, выросших на агаровой пластине после последовательного разведения и трех экземплярах обшивки образца гомогената легких. Увеличение бактериальной нагрузки нескольких log 10 КОЕ выше базовой линии управления , как правило , наблюдается в зараженных легких для большинства бактериальных изолятов, даже при 96 ч после инфицирования, и вариабельность между животными является низким (Рисунок 2). Для некоторых H.influenzae , , может быть немного роста; Тем не менее, инфекция не следует начинать с себя рассасываются в течение периода времени 48 или 96 ч (Фигура 2В). Эта модель легочная инфекция может быть использована в процессе оптимизации свинца химической серии для поддержки SAR, как показано на рисунке 3 для типичных соединений двух различных серий 16, 17. Она обеспечивает последовательное, воспроизводимые меткорыто для оценки PK / PD в иммунокомпетентных животных и использовали для определения , что зоны свободной наркотиков под кривой концентрация время над минимальной подавляющей концентрации (fAUC / MIC) коррелируют с эффективностью нового полипептида deformylase (PDF) ингибитор против S. Пневмококк и H. гриппа (рисунок 4). Кроме того, fAUC / MIC цели для стазу и 1-log 10 КОЕ сокращение от базовой линии управления были определены по 11 S. Пневмококк и 5 изолятов H. гриппа (таблица 1) 18. Сцепление этой инфекции модель с системой доставки лекарственного средства для воссоздания фармакокинетические профили человека у крыс создает мощный инструмент для оценки режимов дозирования человека до клинических исследований. Примером этого приводится в таблице 2, что свидетельствует о том , что препарат с длительным высвобождением амоксициллина-клавуланата был более эффективным , чем существующие режимы дозы для организмов с ElevaTed MIC значения 19.
Рисунок 1: Нехирургическое Интратрахеального интубации. Инструменты показаны для интубирование крысы (А) и мыши (B). После того, как под наркозом, животное должно располагаться , как показано на С, с головы вправо и хвост влево , если физическое лицо , выполняющий технику правша. Поместите левый указательный палец мягко на горло, чтобы помочь пропальпируйте кольца трахеи для подтверждения правильного размещения канюли. Посевной материал должен быть помещен глубоко в левом легком, как показано на вентральной легкого крысы (D). Колонии , растущие на агар после серийного разведения и листовую обшивку образца должно выглядеть подобно тому, как показано в Е. Рисунок 1D, Copyright © Gill Smith [лабораторных животных, том 25 (1991), Г. Смит,простой нехирургическим методом внутрибронхиального закапывания для создания респираторных инфекций у крыс, стр 46 - 49] 14. Печатается с разрешения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Характерные примеры роста бактерий в легких зараженных животных. Среднее значение ± стандартное отклонение КОЕ данных от N = 5 животных / группа показана для различных изолятов S. Пневмококк (А), H.influenzae , (B), синегнойной (C), К. пневмонии (D) и А. baumannii (Е). Первая полоса каждой пары (светло-серый) является базовым bacteриал нагрузка на 1 или 2 ч после инфицирования, в то время как второй столбик является контроль роста с истекшим исследования на 48 ч после инфицирования (темно-серый) или 96 ч после заражения (черный). не применялись методы цензурирования данных; Таким образом, эти результаты включают в себя данные из всех 5 животных в каждой группе. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Оценка эффективности различных химических рядов во время Lead оптимизации. Модели легочной инфекции с использованием описанных методов были использованы для изучения взаимосвязи структура-активность в рамках программы абактериальный типа IIA топоизомеразы. Перспективными соединения 7 и 1 оценивали против хинолоновый-восприимчивыми (А) 16 или хинолоновый устойчивостью(Б) 17 изолятов S.pneumoniae , соответственно. Каждый символ представляет КОЕ определяется из легких одной крысы с линий, представляющих собой группу среднее значение и стандартное отклонение. Нижний предел количественного определения (LLQ) составлял 1,7 log 10 КОЕ / легкие. Соединения, взвешивали (56 или 112 мг чистого свободного исходной молекулы), растворенного в 9 мл стерильной воды, разбавляют 3 мл в 3 мл воды (1: 1) и вводили перорально через зонд 1 мл / 125 г крыс дважды в день ( 6 - 7 ч друг от друга) в течение 2-х дней, начиная с 1 ч после инфицирования. Необработанный контроль (NTC) отбирали через 1 ч после инфицирования для базового уровня или вводили физиологический раствор и образцы в конце исследования (48 ч) для управления роста. Рисунок 3A перепечатана из биоорганических & Medicinal Chemistry Letters, том 21, TJ Miles и др, романный циклогексил-амидов в качестве сильных антибактериальных таргетингом бактериального типа IIA топоизомеразы, Страницы 7483 - 7488., Авторские права (2011) 16, с разрешения Elsevier.Рисунок 3B перепечатана из биоорганических & Medicinal Chemistry Letters, том 26, TJ Miles и др, романный трицикликов (например GSK945237) в качестве сильных ингибиторов бактериального типа IIA топоизомеразами, Страницы 2464 -. 2469, Все права защищены (2016 г.) 17, с разрешения Elsevier. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: PK / PD Характеристика романа PDF Ингибитор. Модели Emax были созданы с использованием дозы в диапазоне Данные об эффективности в иммунокомпетентных мышах , зараженных в легких с изолятов S. Пневмококк (А) или H.influenzae , (B) , чтобы определить , PK / PD мишени для нового ингибитора 18 PDF. кругипредставляют собой среднее значение бактериальной нагрузки от 4-5 мышей / группе, обработанной различными дозами соединения. Анализы проводились соотносить эффективность с свободной наркотиков 24 ч AUC (открытые кружки) или AUC / MIC (закрашенные кружки). Печатается с разрешения, Copyright © Американское общество по микробиологии [антимикробным агентам и химиотерапии, объем 60, 2016, стр 180 - 189] 18. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| стаз | 1-log 10 снижение | ||||||
| Организм | микрофон (мкг / мл) | R 2 для линия фит (%) | fAUC | fAUC / MIC | fAUC | fAUC / MIC | Макс убийство (log 10 снижение) |
| S.pneumoniae , | |||||||
| 10127 | 0,25 | 99.9 | 2,0 | 8.1 | 3.6 | 14.4 | 2.8 |
| 1316009S | 0,25 | 96,1 | 6.5 | 26,0 | 15.1 | 60,3 | 1.8 |
| ATCC10813 | 0,5 | 100 | 8.4 | 16,9 | 22,2 | 44,5 | 1.2 |
| 1307007S | 1 95,8 | 16.1 | 16.1 | 20,1 | 20,1 | 2.7 | |
| ATCC6303 | 1 | 99,8 | 19,8 | 19,8 | 24,8 | 24,8 | 2.8 |
| 1629 | 2 | 100 | 15.8 | 7.9 | 21,2 | 10.6 | 2.4 |
| 298443 | 2 | 99.9 | 26.5 | 13.2 | 31,0 | 15,5 | 2.3 |
| 336808 | 2 | 86 | 8.2 | 4.2 | 19,0 | 9.5 | 2.6 |
| 338860 | 2 | 99,5 | 2.9 | 1.5 | 6.7 | 3.4 | 2.8 |
| & #160; 340449 | 2 | 94,6 | 8.0 | 4.0 | 14,9 | 7.4 | 2.1 |
| L11259 | 2 | 100 | 7.1 | 3.5 | 9.0 | 4.5 | 2,0 |
| Среднее ± SD | Н.А. | Не Доступно | 11,0 ± 7,5 | 11,0 ± 7,9 | 17,0 ± 8,2 | 19.5 ± 17.8 | 2,3 ± 0,5 |
| медиана | Не Доступно | Не Доступно | 8.2 | 8.1 | 19,0 | 14.4 | 2.4 |
| H. гриппа | |||||||
| 1998-100-126H | 1 | 99,7 | 7.3 | 7.3 | 13.4 | 13.4 | 2.9 |
| 503-008H | 1 | 99,8 | 7.1 | 7.1 | 13.9 | 13.9 | 2.7 |
| 08003H | 2 | 99.9 | 14,5 | 7.2 | 16.7 | 8.3 | 2.7 |
| H128 | 2 | 96,6 | 15,3 | 7.6 | 26,0 | 13,0 | 2.7 |
| 19001H | 4 | 91,9 | 14.8 | 3.7 | 37,3 | 9.3 | 3.0 |
| Среднее ± SD | Не Доступно | Не Доступно | 11,8 ± 4,2 | 6,6 ± 1,6 | 21,5 ± 10,2 | 11,6 ± 2,6 | 2,8 ± 0,1 |
| медиана | Не Доступно | Не Доступно | 14,5 | 7.2 | 16.7 | 13,0 | 2.7 |
| П НП, не применяется. | |||||||
Таблица 1: PK / PD Задания для романа PDF Ингибитор против S. Пневмококк и H.influenzae , изолятов. ППК Free наркотиков и ППК / MIC цели для стазу и 1-log 10 КОЕ сокращение от базовой линии были определены для 11 S. Пневмококк и 5 H. гриппа у иммунокомпетентных мышей , инфицированных в легких и обработанных соединением 18. ДАТА был использован при выборе человека дозы для клинического развития. Эта таблица была адаптирована и перепечатано с разрешения, Copyright © Американское общество по микробиологии [антимикробным агентам и химиотерапии, объем 60, 2016, стр 180 - 189] 18.
| Группа лечении, | Среднее log 10 (S.pneumoniae , КОЕ / легких) B ± SD для деформации (AMX / CA MIC): | |||||||
| 05010S (2 мкг / мл) | 16001S с (4 мкг / мл) | 16001S (4 мкг / мл) | 30005S (4 мкг / мл) | 20009S (4 мкг / мл) | 05003S (8 мкг / мл) | 404053 (8 мкг / мл) | 47003S (8 мкг / мл) | |
| контроль | 7,3 ± 0,4 | 7,0 ± 0,8 | 5,7 ± 1,2 | 7,1 ± 0,7 | 7,1 ± 0,4 | 6,4 ± 0,6 | 6,8 ± 0,4 | 6,0 ± 0,3 |
| AMX / CA | ||||||||
| 2000/125 мг ставка (соотношение 16: 1) | ≤ 1,7 ** | 2,8 ± 1,2 ** | 2,2 ± 0,8 ** | 2,3 ± 0,9 ** | 2,5 ± 0,9 ** | 2,0 ± 0,9 ** | 3,8 ± 1,4 ** | 1,8 ± 0,2 ** |
| 1000/125 мг три раза в сутки (соотношение 8: 1) | Новый Завет | Новый Завет | 2,8 ± 0,5 ** | 2,7 ± 1,3 ** | 3,3 ± 0,9 ** | 4,9 ± 0,5 ** | 6,6 ± 1,3 | 4,7 ± 0,7 ** |
| Новый Завет | Новый Завет | 3,0 ± 1,3 * | 2,1 ± 0,7 ** | 3,2 ± 0,4 ** | 5,2 ± 0,9 * | 6,4 ± 0,6 | 4,9 ± 0,4 ** | |
| 875/125 мг ставка (соотношение 7: 1) | Новый Завет | Новый Завет | 4,5 ± 1,2 * | 5,6 ± 1,3 * | 5,2 ± 0,7 ** | 6,3 ± 0,7 | 6,4 ± 0,7 | 5,5 ± 0,4 |
| 500/125 мг три раза в день (соотношение 4: 1) | 3,1 ± 1,3 ** | 4,5 ± 0,9 ** | Новый Завет | Новый Завет | Новый Завет | Новый Завет | Новый Завет | Новый Завет |
| Азитромицин, 1000/500 мг О.Д. | Новый Завет | Новый Завет | Новый Завет | 5,8 ± 2,0 | 7,1 ± 0,9 | 3,1 ± 1,0 ** | 6,6 ± 0,4 | 6.07; 0,6 |
| Левофлоксацин, 500 мг О.Д. | Новый Завет | Новый Завет | 4,2 ± 0,8 * | 5,7 ± 0,8 * | 4,9 ± 0,8 ** | 3,0 ± 1,3 ** | 3,5 ± 0,2 ** | 3,9 ± 0,8 ** |
| Группа Лечение d | Среднее значение log 10 H. гриппа (КОЕ / легких) ± стандартное отклонение для напряжения: | |||||||
| H128 (β-лактамазы положительный) | длинный мягкий диван (β-лактамазы отрицательным, устойчивых к ампициллину) | |||||||
| контроль | 6,4 ± 0,6 | 6,7 ± 0,6 | ||||||
| AMX / CA | ||||||||
| 2000/125 мг ставка (соотношение 16: 1) | 2,0 ± 0,7 ** | 3,1 ± 0,9 ** | ||||||
| 1000/125 мг три раза в сутки (соотношение 8: 1) | 2,1 ± 1,0 ** | 3,6 ± 1,1 ** | ||||||
| 875/125 мг три раза в сутки (соотношение 7: 1) | 2,8 ± 1,3 ** | 3,8 ± 1,3 ** | ||||||
| 875/125 мг ставка (соотношение 7: 1) | 2,0 ± 0,8 ** | 5,1 ± 1,1 ** | ||||||
| Азитромицин, 1000/500 мг О.Д. | 3,2 ± 1,7 * | 5,8 ± 1,1 | ||||||
| Левофлоксацин, 500 мг О.Д. | ≤ 1,7 ** | ≤ 1,7 ** | ||||||
| AMX / CA, амоксициллин-клавуланат; ставка, два раза в день; TID., три раза в день; О.Д., один раз в день. | ||||||||
| б Предел обнаружения был <1,7; *, Значительно отличается от контроля (Р ≤ 0,05); **, Значительно отличается от контроля (Р ≤ 0,01); NT, не проверял. | ||||||||
| С штамм 16001S тестировали в двух отдельных экспериментах. | ||||||||
| г амоксициллин-клавуланат 500/125 мг (4: 1) три раза в день , не было испытано против штаммов H. гриппа. | ||||||||
Таблица 2: Эффективность воссозданы человеческой плазмы экспозиционные профили для различных амоксициллин / клавуланат режимы дозирования. Данные , полученные в иммунокомпетентных крыс , зараженных в легких с изолятов S. Пневмококк или H.influenzae , используя эту модель показали , что расширенная формулировка амоксициллин-клавуланат (2, 000/125 мг два раза в день) был более эффективен , чем стандартные режимы дозирования против изолятов с повышенной в пробирке восприимчивости 19. Эта таблица была адаптирована и перепечатано с разрешения, Copyright © Американское общество по микробиологии [антимикробным агентам и химиотерапии, объем 49, 2005, стр 908 - 915] 19.
Discussion
Для оптимального успеха в воспроизведении этой модели инфекции, следующие дополнительные предложения должны быть рассмотрены. Вирулентность новых изолятов может быть повышена за счет пересева 2 - 3 раза в естественных условиях перед использованием в исследовании. Замороженные бактериальные запасы всегда должны быть получены из первичного в естественных условиях -derived источник с наименьшим количеством проходов как можно дальше от оригинала, а также замораживание или повторное использование талой запаса не рекомендуется. Использование последних клинических изолятов оправился от больных с воспалением легких, и / или подготовки культур в фазе роста журнал может также помочь улучшить создание инфекции. Пятикратное разведение в агар (например , 2 мл физиологического раствора суспензию добавляют к 8 мл охлажденного агара) , может быть использован вместо десяти раз , чтобы увеличить бактериального инокулята, а объем посевного материала можно регулировать в зависимости от размера животного (например , 200 мкл / животное обычно засевают в 250 крыс г). Перед добавлением соляной бактериальной суспензии вагар (т.е. на шаге 2.3), бактериальная плотность может быть предсказано или оцениваться путем визуального осмотра, стандартов MacFarland или измерений оптической плотности. Полезно ознакомиться с ин витро характеристиками роста для каждого изолята до проведения экспериментов в естественных условиях. Последовательность в росте и обработке позволяет наиболее точную оценку бактериальной плотности для любого данного изолята. Стандартные микробиологические методы, которые отличаются от тех, которые описаны, например, в качестве альтернативы средства массовой информации и гомогенизаторы тканей, могут быть использованы в случае необходимости для приготовления инокулята и перечислении бактерий из инфицированных тканей.
Настоятельно рекомендуется подготовить или расплавить агар день до начала эксперимента и хранить его в течение ночи в отдельной ванне воды устанавливается на 50 ° C. Это позволит упростить процесс и помочь защититься от агара слишком горячим во время инфекции. Температура 41 - 42 ° С достигает хорошего баланса между maintaiнин агар в жидком состоянии, не будучи слишком горячей для кратковременной выживаемости бактерий. В качестве возможной альтернативы питательный агар, благородный агар успешно применяется в ряде экспериментов. Одна трубка из агаровой посевного материала , обычно достаточно в течение всего эксперимента (и рекомендуется), но несколько трубок могут быть подготовлены к заражению большого количества животных (например , более 60) , или когда процесс заражать занимает больше времени , чем 30 - 45 мин Если множественные инокулята трубки необходимы, добавить солевой бактериальной суспензии в каждую пробирку агара, как это необходимо. Это снижает риск того, что выживаемость бактерий и / или пригодности будет зависеть от длительного воздействия повышенной температуры перед посевом. Следует отметить, что использование нескольких трубок инокулята также может потребовать дополнительных процедур для животных рандомизации. Всякий раз, когда это возможно, заражает всех животных из того же препарата прививочный материал. Рекомендуется адаптировать размер экспериментов к текущему уровню мастерства с тэchnique.
Опытный ученый может интубации и прививать животное менее чем за 30 секунд и прививают до 5 - 6 животных в каждой партии (т.е. с одного шприца полный агар инокулята). Для тех, кто изучает технику, скорость важна, как агар начнет затвердевать; Тем не менее, точное размещение посевного материала является более важным. Начинают с 1 или 2-х животных в каждой партии, а также увеличить как техника становится более знакомым. Животных продолжают дышать во время интубации; Таким образом, временной интервал для прививки зависит от того, как быстро животное восстанавливается из изофлуран, которая должна быть примерно на 2 - 3 мин. Животные, которые пробуждают в ходе процесса может быть повторно анестезировали и попытался второй раз, но это не рекомендуется делать это повторно. Успешная прививка с первой попытки, как ожидается, почти 100% животных, как только знание достигается. Обратите внимание, что легче изучать технику с использованием крыс в первую очередь; Мыши более чувствительны и меньше тожеLs более склонны к закупорке с затвердевшего агара, если не манипулировать быстро. Предварительного нагрева, шприцы, шланги, трубки и солевые, а также держать устройство интубации на теплой (не горячей) поверхности, например, грелку на низкой установке, может помочь предотвратить затвердевание агара. При изучении техники, это также полезно практиковать правильное размещение посевного материала с использованием темного цвета красителя (например, сосредоточенной метиленовым синим) вместо бактериальной суспензии в агар. Выполните процедуру, как описано, но эвтаназии животных сразу же после инокуляции красителя (не позволяя животным восстанавливаться между анестезией и эвтаназии). Проанализируйте, чтобы определить, где краситель был помещен, и корректировать технику соответственно.
Первичной конечной точкой в этой модели КОЕ из зараженных легких. Выживание не является хорошим показателем бактериальной нагрузки и не является рекомендуемой конечной точки. Для исследования эффективности, предложенный N 5 - 6 животных в каждой группе, как это predicted для обнаружения ≥1 log 10 КОЕ различий между группами по крайней мере , на 90% мощности. Животные могут быть заражены в таких группах, что клетка товарищей остаются вместе, или истинный процесс рандомизации может следовать. Обратите внимание, что если группы назначаются клетки, группы должны быть заражены в случайной последовательности с контролем роста отслуживших исследования инфицированных в прошлом (чтобы подтвердить, что выживаемость бактерий / фитнес не зависела от продолжительности времени подвергается воздействию повышенной температуры в водяной бане). Нет методы цензурирования данных не должно быть необходимым, и ни один не рекомендуется за исключением немедленного удаления любого животного, которое было явно неправильно засеянные в начале исследования (до начала каких-либо процедур). Животные , которые умерщвляют до окончания исследования должны быть отобраны и результаты включены в набор данных , если действительная причина для исключения не было выявлено перспективно (то есть событие , не связанного с инфекцией или лечения). унос лекарственный препарат может АРРЭСТ некоторые образцы и является важным фактором для всех моделей в естественных условиях инфекции. Если соединение дается часто, близко к тому времени , эвтаназии или имеет длительный период полураспада, он может присутствовать в гомогенате ткани при достаточно высокой концентрации , чтобы продолжать убивать бактерии исключая виво в процессе бактериального счетном (разведение и металлизация образцы или на агара во время инкубации в течение ночи). Чтобы предотвратить это, активированный уголь и / или добавку, ухудшающее активной молекулы без повреждения клетки бактерий могут быть добавлены к пробе перед гомогенизацией. Другие методы включают центрифугирование пробы, чтобы удалить большую часть активного соединения (которое должно оставаться в надосадочной жидкости) и использованием различных разведении и металлизации схем достаточно разбавлен, активное соединение с неэволю- ингибирующей концентрации.
Как видно из примеров , показанных на рисунке 2, эта модель успешно яnduces инфекций легких у грызунов с широким спектром микроорганизмов , включая те , которые не растут в других моделях (например , H.influenzae , ). Эти инфекции являются последовательными и воспроизводимым, уменьшая вероятность того, что эксперименты нужно будет повторяться из-за сбоя модели и / или плохой работы с данной изолята. Хотя животные иммунокомпетентными, они не в состоянии быстро решить инфекцию, если вообще. Это позволяет увеличить гибкость в длине исследуемой, так как многие изоляты поддерживать жизнеспособный инфекцию через, по меньшей мере, 96 часов, без необходимости повторные инъекции, чтобы поддерживать нейтропении. Потенциальные преимущества изучения антибактериальную эффективность в иммунокомпетентных животных было отмечено выше 20, 21, и есть доказательства того, что для некоторых соединений (например , Оксазолидиноны), данные из не-нейтропенией грызунов могут более точно прогнозировать цели воздействия на человека по сравнению с теми , оказываемых нейтропенией 5. Многоцелевой полезность тон модель демонстрируется на рисунках 3 и 4 и таблицах 1 и 2. Эти исследования являются частью большой коллекции опубликованных и неопубликованных данных , которые были сгенерированы с этой моделью для поддержки усилий по оптимизации свинца 16, 17, 22-24, для сравнения и подтверждение предлагаемого человека дозировки препаратов 19, 25-29 и для ПК / PD характеристики 18, 30-32 .WHILE эта модель изначально более сложным провести по сравнению с методом интраназальной ингаляции, существует множество преимуществ , как описано выше. С практикой и повседневного использования, методы должны стать простым для выполнения.
Можно отметить, в некоторых исследованиях, что бактериальная нагрузка исходно была ниже, чем обычно ориентированы на других моделях легочной инфекции. Это связано в значительной степени необходимого разведения в агаре и небольшого объема проблемой, особенно у мышей. Тем не менее, следует также отметить,что бактериальный рост наблюдался во всех случаях, даже если первоначальная нагрузка была относительно низкой. Целевой базовой линии бактериальной нагрузки составляет от 6 до 6,5 log 10 КОЕ / легкие ( от 6,8 до 7,3 log 10 КОЕ / г ткани у мышей на основе среднего веса легких) , что соответствует плотности оценочном у больных людей с тяжелой формой пневмонии 33. Более высокая базовая линия нагрузка может быть достигнута путем дальнейшего концентрирования бактериального инокулята или путем задержки начала введения соединения, чтобы обеспечить дополнительный рост бактерий; Тем не менее, увеличение нагрузки вызов слишком много может привести к аномально тяжелой и острой болезни (т.е. смерть менее чем за 24 ч) , что огнеупорный ко всем антибактериальным лечения независимо от восприимчивости. Несмотря на то, прививочный материал вначале помещают преимущественно в левое легкое животного, инфекция, как правило распространяется по всему обоих легких. Прогрессирование заболевания легких, распространение бактерий к другим органам, и в конечном итоге заболеваемость часто Observред с С. К. Пневмококк Пневмококк и P.aeruginosa , . Интересно, что инфекции с H. гриппа и А. baumannii, как правило , более редко и содержали привести к смерти в предписанное бактериального инокулята.
Результаты оценки эффективности , полученные из этой модели хорошо коррелируют с профилями в пробирке восприимчивости, а также определенных целей / PD PK. Снижение бактериальной нагрузки обычно наблюдается изолятов считаются восприимчивыми к агенту тестируется, в то время как те , которые считаются резистентной экспоната без изменений или бактериального роста выше базовой линии 16, 17, 19, 24-29. Исследования на крысах , оценивающих два хинолоны и макролиды с использованием этой модели 32, показали , что целевой PK / PD требуется для 1-log 10 снижение S.pneumoniae , по сравнению с исходным уровнем коррелировало с мишенью , определенной в нейтропенией мышей и, что более важно, с клинические цели для бактериальной пневм внебольничнойOnia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, новый механизм антибиотик был испытан против множественной S.pneumoniae , и требует аналогичной цели PK / PD для 1-log 10 снижения этой инфекции легких модели 31 , как это требуется для 1-log 10 снижения в модели нейтропенической бедренной 36 , когда проникновение легких было принято во внимание (данные в файле). Аналогичным образом , PK / PD мишени тестировано на мышах для GSK2251052 против P.aeruginosa , были последовательными для стаза, 1- и 2-log 10 уменьшение КОЕ между этой моделью 30 легких и нейтропенией модели инфекции бедренной , когда проникновение легких рассматривалось 37, 38 , Корреляция с нейтропенией модели инфекции легких с использованием интраназальной инокуляции бедных; Однако GSK2251052 не производят больше , чем статический ответ в этом исследовании 38. Это может быть связано с более высокой бактериальной посевного материала , который был 8 log 10 КОЕ / мышь по сравнению с 6 журнала
Есть несколько ограничений этой модели иммунокомпетентных пневмонии. Во-первых, он не очень хорошо подходит для оценки возникновения спонтанной резистентности, так как высокая бактериального инокулята как правило, требуется для таких исследований приводит к слишком тяжелой инфекции. После попытки достичь бактериальных бремени 7 или 8 log 10 КОЕ на исходном уровне, наблюдается быстрое заболеваемость (т.е. животных становятся умирающий менее чем за 24 часа) , несмотря на тщательной промывки посевного материала для удаления ранее существовавших токсинов (данные на файле). Этоможет быть возможным, чтобы преодолеть эту проблему с помощью более крупных грызунов. Крысы, особенно тяжелые крыс (> 250 г), по всей видимости, лучше переносить более высокие инокулята, по сравнению с мышами, и могут быть пригодны для этих типов исследований. Второе ограничение состоит в том, что использование агар в качестве инфекционно-энхансер может предотвратить с помощью модели оценки определенного хоста: патоген взаимодействий. Полагают, что агар обеспечивает защищенный координационный центр, пока инфекция не будет полностью установлена в легких. Можно поставить прививочный материал в физиологическом растворе, а не агар, чтобы помочь преодолеть эту проблему; Тем не менее, следует отметить, что это будет производить только инфекцию с некоторыми изолятов. В-третьих, есть крутой кривой обучения требуется, чтобы стать специалистами в технике. Эта процедура может быть деликатным, особенно у мышей. Легко ошибочно поместить металлическую канюлю в пищевод, а чрезмерное усилие может привести к проколу либо пищевода или трахеи. Тщательное размещение посевного материала такжетребуется или животные могут либо не восстанавливать или не может быть адекватно заражен. Тем не менее, с терпением и упорством, можно стать очень опытными и выполнять технику быстро, плавно и точно.
Удаляя требования к нейтропения, повышение надежности и воспроизводимости, что позволяет исследователям изучить больше патогенных микроорганизмов и изоляты, улучшая гибкость экспериментального проектирования и обеспечивая сложные инфекции характеризовать фармакодинамику пневмонии, эта иммунокомпетентных модель инфекции легких добавляет существенную ценность к открытию антибиотика сообщества. Более широкое использование этой модели дополнительных исследователей поможет обеспечить необходимый сравнительный анализ для того, чтобы получить более широкое признание и продолжать оказывать вспомогательную информацию для соответствующей интерпретации.
Disclosures
Авторы все оплачено сотрудники GlaxoSmithKline Pharmaceuticals и собственных акций в пределах компании.
Acknowledgments
JH хотел бы выразить признательность и поблагодарить наставника, друга и бывший менеджер Валери Берри для первого учит нас эту модель; и Гари Woodnutt, который научил нас основам и вдохновлял нашу приверженность области антибактериальной PK / PD. Все авторы хотели бы поблагодарить Дэвида Пэйна за его поддержку и признательность за нашу науку. Мы хотели бы отметить наш бывший в естественных условиях коллегами микробиологических , которые внесли вклад в тело данных , полученных с помощью этих методов, особенно Пит Демарш, Роб STRAUB, Рони страницу и Nerissa Саймон. И, наконец, мы благодарим наших коллег микробиологических в пробирке за их помощь, особенно для обеспечения всех МИК мы спрашиваем (Линн McCloskey, Джош Уэст и Шарон мин); и для нашей команды клинической микробиологии, который предоставляет экспертные консультации и поддержку (Линда Миллер, Николь Scangarella-Оман и Дебора Батлер).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
| Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
| BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
| BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
| Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
| 0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
| Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
| 30 mL free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100 mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
| Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
| 90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
| 1 mL TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| Animal feeding needle - straight 20 x 3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
| Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand - Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
| 75 TN 5.0 µL syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
| Pyrex tube, culture 25x150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
| 70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
| Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
| Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
| Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
| Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |
References
- Eagle, H., Fleischman, R., Levy, M. Continuous' vs. 'discontinuous' therapy with penicillin: the effect of the interval between injections on therapeutic efficacy. N Engl J Med. 248 (12), 481-488 (1953).
- Eagle, H., Fleischman, R., Musselman, A. D. The bactericidal action of penicillin in vivo: the participation of the host, and the slow recovery of the surviving organisms. Ann Intern Med. 33 (3), 544-571 (1950).
- Vogelman, B., et al. Correlation of antimicrobial pharmacokinetic parameters with therapeutic efficacy in an animal model. J Infect Dis. 158 (4), 831-847 (1988).
- Craig, W. A. Pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters: rationale for antibacterial dosing of mice and men. Clin Infect Dis. 26 (1), 1-12 (1998).
- Ambrose, P. G., et al. Pharmacokinetics-pharmacodynamics of antimicrobial therapy: it's not just for mice anymore. Clin Infect Dis. 44 (1), 79-86 (2007).
- Ambrose, P. G., Bhavnani, S. M., Owens, R. C. Clinical pharmacodynamics of quinolones. Infect Dis Clin North Am. 17 (3), 529-543 (2003).
- Andes, D. Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of antimicrobials in the therapy of respiratory tract infections. Curr Opin Inf Dis. 14 (2), 165-172 (2001).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (3), L387-L398 (2008).
- Antibiotics in laboratory medicine, 5th edition. Chapter 15: Evaluation of antimicrobials in experimental animal infections. Lorian, V. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. (2005).
- McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiol Rev. 37 (2), 130-155 (2013).
- Nuermberger, E. Murine models of pneumococcal pneumonia and their applicability to the study of tissue-directed antimicrobials. Pharmacotherapy. 25 (12 Pt 2), 134S-139S (2005).
- Mehrad, B., Standiford, T. J. Use of animal models in the study of inflammatory mediators of pneumonia. ILAR J. 40 (4), 167-174 (1999).
- De Simone, M., et al. Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Smith, G. A simple non-surgical method of intrabronchial instillation for the establishment of respiratory infections in the rat. Lab Anim. 25 (1), 46-49 (1991).
- Berry, V., Ferreira-Cornwell, M. C., Singley, C., Woodnutt, G. Development of experimental murine infections caused by H. influenzae and H. parainfluenzae. Clin Microbiol Infect. 7 (S1), 322 (2001).
- Miles, T. J., et al. Novel cyclohexyl-amides as potent antibacterials targeting bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 21 (24), 7483-7488 (2011).
- Miles, T. J., et al. Novel tricyclics (e.g. GSK945237) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 26 (10), 2464-2469 (2016).
- Hoover, J., et al. Pharmacokinetics/pharmacodynamics of peptide deformylase inhibitor GSK1322322 against Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Staphylococcus aureus in rodent models of infection. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), 180-189 (2016).
- Berry, V., Hoover, J., Singley, C., Woodnutt, G. Comparative bacteriological efficacy of pharmacokinetically enhanced amoxicillin-clavulanate against Streptococcus pneumoniae with elevated amoxicillin MICs and Haemophilus influenzae. Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 908-915 (2005).
- Czock, D., Markert, C., Hartman, B., Keller, F. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of antimicrobial drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5 (5), 475-487 (2009).
- Drusano, G. L., Fregeau, C., Liu, W., Brown, D. L., Louie, A. Impact of burden on granulocyte clearance of bacteria in a mouse thigh infection model. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4368-4372 (2010).
- Miles, T. J., et al. Novel hydroxyl tricyclics (e.g. GSK966587) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 23 (19), 5437-5441 (2013).
- Hunt, E. Pleuromutilin antibiotics. Drugs Future. 25 (11), 1163-1168 (2000).
- Jin, Q., et al. Novel LpxC inhibitors with broad-spectrum gram-negative activity. Proceedings of the 44th National Organic Chemistry Symposium.. College Park, MD, , Abstract T-31 (2015).
- Singley, C., Page, R., Hoover, J., Elefante, P., DeMarsh, P. Efficacy of a LRS inhibitor GSK2251052 against Enterobacteriaceae isolates using a computer-controlled infusion system to recreate human PK profiles in rats. Clin Microbiol Infect. 17 (S4), S429-S430 (2011).
- Berry, V., et al. Comparative in vivo activity of gemifloxacin in a rat model of respiratory tract infection. J Antimicrob Chemother. 45 (S1), 79-85 (2000).
- Tsuji, M., et al. S-649266, a Novel Siderophore Cephalosporin: Efficacy against Klebsiella pneumoniae producing NDM-1 or KPC in rat lung infection model with recreated humanized exposure profile of 2 gram dose with 1 hour and 3 hours infusion. Open Forum Infect Dis. 1 (S1), S106-S107 (2014).
- Tsuji, M., et al. Use of Iron Depleted Mueller Hinton Broth (IDMHB) for microdilution testing of S-649266, a novel siderophore cephalosporin. 26th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Amsterdam, Netherlands, , Abstract P0808 (2016).
- Singley, C., Hoover, J., DeMarsh, P. J., Elefante, P., Zalacain, M. Efficacy of PDF Inhibitor GSK1322322 Against Abscess Infections Caused by MRSA Using a Computer-Controlled Infusion System to Recreate Human PK Profiles in Rats. Proceedings of the 60th Annual Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Boston, MA, , Abstract F1-2114 (2010).
- Hoover, J., Mininger, C., Rittenhouse, S. GSK2251052, a novel LeuRS inhibitor, is effective against multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa in a mouse pneumonia model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract B-1308 (2012).
- Hoover, J., Mininger, C., Novick, S., Rittenhouse, S. Efficacy of GSK2140944 against Streptococcus pneumoniae in a non-neutropenic mouse lung infection model. Proceedings of the 53rd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Denver, CO, , Abstract A-014 (2013).
- Hoover, J. L., et al. Selection of a lung infection model to predict efficacy in community-acquired pneumonia (CAP) caused by S. pneumoniae (SP). Proceedings of the 47th Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Chicago, Illinois, , Abstract A-17 (2007).
- Drusano, G. L., et al. Saturability of granulocyte kill of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of pneumonia. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2693-2695 (2011).
- Peric, M., Browne, F. A., Jacobs, M. R., Applebaum, P. C. Activity of nine oral agents against gram-positive and gram-negative bacteria encountered in community-acquired infections: use of pharmacokinetic/pharmacodynamic breakpoints in the comparative assessment of beta-lactam and macrolide antimicrobial agents. Clin Ther. 25 (1), 169-177 (2003).
- Calbo, E., Garau, J. Application of pharmacokinetics and pharmacodynamics to antimicrobial therapy of community-acquired respiratory tract infections. Respiration. 72 (6), 561-571 (2005).
- Bulik, C. C., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2140944 against Staphylococcus aureus and Streptococcus pneumoniae in a murine-thigh infection model. Proceedings of the 54th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Washington, DC, , Abstract A-680 (2014).
- Bulik, C. C., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli in a murine-thigh infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract A-1270 (2012).
- Andes, D. R., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli using data from a neutropenic murine-pneumonia infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract A-1271 (2012).
