Abstract
Effekten af kandidat antibakterielle behandlinger skal påvises i dyremodeller for infektion som en del af forskning og udvikling proces, helst i modeller, som efterligner den påtænkte kliniske indikation. Fremgangsmåde til induktion robuste lungeinfektioner hos immunkompetente rotter og mus er beskrevet som giver mulighed for evalueringen af behandlingerne i en model for alvorlig lungebetændelse forårsaget af S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae eller A. baumannii. Dyr bedøves, og en agar-baseret inokulum er deponeret dybt ned i lungerne via nonsurgical intratracheal intubation. Den resulterende infektion er konsistent, reproducerbar og stabil i mindst 48 timer og op til 96 timer for de fleste isolater. Undersøgelser med markedsførte antibakterielle midler har vist god korrelation mellem in vivo effekt og in vitro følsomhed, og overensstemmelse mellem farmakokinetiske / farmakodynamiske mål bestemmesi denne model og klinisk accepteret mål er blevet observeret. Selv om der er en indledende tid investering, når lære teknikken, kan den udføres hurtigt og effektivt, når færdighed er opnået. Fordele ved modellen omfatter fjernelse af neutropeni krav, øget robusthed og reproducerbarhed, evne til at studere flere patogener og isolerer, forbedret fleksibilitet i studie design og etablering af en udfordrende infektion i en immunokompetente vært.
Introduction
Evaluering af effekten af potentielle lægemiddelkandidater i dyremodeller for infektion er et afgørende element i den antibakterielle lægemiddelforskning processen. In vivo effektstudier giver vigtige data for beslutningstagning i hele spektret af discovery indsats fra belyse struktur-aktivitets-relationer (SAR) og optimering af bly kemisk serie gennem fastlæggelse farmakokinetisk-farmakodynamisk (PK / PD) karakteristika for forbindelser og støtte udvælgelse dosis for klinisk udvikling og myndighedsgodkendelse. Talrige dyr infektionsmodeller er beskrevet i litteraturen til disse formål. En af de mest almindelige og udbredte modeller er den neutropenisk mus låret infektion, som blev udviklet af Eagle 1, 2 og senere udvidet af Vogelman og Craig 3, 4. Denne model har været uvurderlig til understøtning bestemmelse af bakterielle følsomhedsbreakpoints og til tilvejebringelse PK / PD-mål til at guide human dosering. Der er mange eksamenpler hvor prognosemuligheder af denne model er blevet bevist 4-7. Men en af ulemperne ved låret infektion model er den manglende direkte relevans for lungeinfektioner. Der er nu en større vægt på matchende infektionsstedet i dyremodeller til stedet for infektion hos mennesker; og således, at studere forbindelser til behandling af lungebetændelse, er det ideelt at anvende en lungeinfektion model hos dyr.
Flere metoder til at fremkalde lungeinfektioner i forsøgsdyr er blevet beskrevet og anvendt til antibakterielle effekt undersøgelser, herunder intranasal inhalation, aspiration via svælg rute, aerosol eksponering, og kirurgisk intratrakeal podning 8. I mange tilfælde skal dyrene (især mus) først gøres neutropene for at opnå en robust lungeinfektion. På trods af dette svært immunkompromitterede tilstand, antallet af bakterielle patogener og stammer, som producerer levedygtige infektioner hos gnavere erbegrænset. For eksempel kan det være vanskeligt at kunne etablere Haemophilus influenzae eller Acinetobacter baumannii i lungebetændelse modeller 9, 10 og endnu mere virulente patogener, såsom Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa og Klebsiella pneumoniae, kan give udfordringer 11-13.
I 1991 Smith beskrev en lungeinfektion model i immunkompetente fravænnede rotter, hvor infektionen blev fastlagt ved inddrypning bakterier direkte i lungerne via et enkelt kirurgisk intratracheal intubation metode 14. Berry et al. senere ændret metoden til at inficere mus 15. Ved anvendelse af en agar-baseret inokulum, denne podning teknik inducerer robuste lungeinfektioner i både immunokompetente rotter og mus med S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa og A. baumannii. Det er modtagelig for en bred vifte af isolater, herunder dem, der huser forskellige modståance determinanter og dem, der ikke producerer en levedygtig infektion via andre inokulering ruter. Det giver også effekt, der skal fastlægges i immunkompetente dyr, en tilstand, som er mere relevant end den traditionelle neutropenisk musemodel for patientpopulationer, der ikke er svært immunkompromitterede. Konsistensen og pålideligheden af denne model på tværs af flere patogener og isolater gør det velegnet til antibakterielle undersøgelser af effekten.
Protocol
S. pneumonie
Alle procedurer er i overensstemmelse med protokoller godkendt af GSK Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC), og opfylder eller overgår de standarder af American Association for akkreditering af Laboratory Animal Care (AAALAC), USA Department of Health and Human Service og alle lokale og føderale dyrevelfærd love.
BEMÆRK: Medmindre andet er angivet, bør udføres alle procedurer ved hjælp af aseptisk teknik.
1. Kultur bakterieisolater
- Forbered 3 til 6 agarplader med S. pneumoniae eller H. influenzae, som bouillon kultur generelt ikke giver tilstrækkeligt materiale til podning.
- Fjern en frossen stamkultur fra opbevaring ved -80 ° C, optøs fuldstændigt, og uden striber op til 100 pi per plade på tryptisk soja-agar suppleret med fåreblod (S. pneumoniae) eller på chokoladeagar (H. influenzae) ved anvendelse af standard mikrobiologiske teknikker. Inkuber natten over ved 37 ° C med eller uden 5% CO2.
- Forbered bouillon kulturer med K. pneumoniae, P. aeruginosa eller A. baumannii.
- Fjern en frossen bestand kultur fra opbevaring ved -80 ° C, optøs fuldstændigt, og portion 100 pi af bestanden i 50 ml hjerne-hjerte-infusion (BHI) bouillon. Inkuber natten over ved 37 ° C med forsigtig rystning (ca. 120 rpm).
- [Valgfrit] Hvis der ønskes en log-fase kultur, aliquot 1 mL af resultanten overnatskultur i 50 ml frisk BHI-bouillon. Inkuber i 3 timer ved 37 ° C med forsigtig rystning (ca. 120 rpm).
2. Forbered Saline bakteriesuspensioner
- For alle suspensionspræparat trin (2,1 til 2,3), udnytte sterilt saltvand ved en temperatur mellem omgivende luft og 37 ° C. Harvest vækst natten over S. pneumoniae eller H. influenzae fra agarpladerne ved at skrabe kolonierfra overfladen med en steril løkke. Overfør det høstede materiale i 5 ml sterilt saltvand, indtil en uklar, er uigennemsigtig suspension opnås og forsigtigt vortex indtil homogenitet.
- Centrifuge 50 ml af K. pneumoniae, P. aeruginosa eller A. baumannii endelige suppekulturer bestemt til podning (f.eks natten over eller log kulturer fase) i 5 minutter ved 4.500 x g. Fjern supernatanten med en pipette og udsmid. Pellet resuspenderes i mindst 5 ml sterilt saltvand og forsigtigt vortex for at opnå en homogen suspension.
- Om nødvendigt fortyndes suspensionen yderligere anvendelse af sterilt saltvand til opnåelse af en densitet i området fra 8 til 9 log10 kolonidannende enheder (CFU) / ml. Fjern en portion til bestemmelse af CFU / ml. Serielt fortynde og plade portionen, som beskrevet i afsnit 7.5 og 7.6.
3. Forbered Agar-baserede Inoculum
- Forbered en lille flaske (ca. 50 ml) af næringsstoffer agar according til producentens anvisninger eller smelte en flaske solid agar næringsstof, som tidligere blev fremstillet og opbevaret. Lad det køle til ca. 50 ° C.
- Transportere flydende agar og alle nødvendige redskaber og udstyr til infektionsprocessen proceduren område, hvor dyrene vil blive inficeret. Oprethold en lille vandbad indstillet på 42 ° C i området.
- Tillad agaren til at nå en temperatur på ca. 50 ° C, og derefter alikvot 9 ml i et sterilt rør af passende størrelse til at passe ind i vandbad. Efterlad dette rør i vandbad, indtil agaren ligevægt til ca. 42 ° C. Sørg vandet er i en dybde, der vil dække overfladen af agar i dets beholder, men ikke røre hætten eller låget.
- Der tilsættes 1 ml af den saltopløsning bakteriesuspension fra trin 2.3 i røret indeholdende 9 ml agar i vandbadet. Cap røret, vend flere gange for at blande, og returnere det til vandbad.
4. Anesthetize, intubere og Inokulér Dyr
BEMÆRK: SPF (SPF) immunkompetente Sprague-Dawley hanrotter, der vejede 100-120 g eller mandlige CD-1 mus vejer 20-25 g anbefales. Give alle dyrene foder og vand ad libitum og huse dem socialt på træflis eller andet absorberende strøelse med standard 12 timers lys-mørke cyklus.
- Forud for gennemførelsen eventuelle eksperimenter, opnå og sterilisere en metal kanyle og polyethylen slange i den rigtige størrelse for de dyrearter. Opnå sterile 1 ml engangssprøjter og sterile engangssprøjter 25-gauge nåle.
Forsigtig: Bortskaf altid af disse sprøjter og kanyler i en kanyleboks.- For rotter, køb eller fremstille en metal kanyle, der er cirka 12 cm i længden, har et ID på 0,9 - 1,0 mm og OD på 1,0 - 1,2 mm, og er bøjet til en omtrentlig 45 ° vinkel i den ene ende. Skær en 11- til 12-tommer længde af polyethylen slange med et ID på 0,4 mm og OD 0,8 mm. (Henvise til
- For mus, købe en # 20 dyrefoder rør. Tag bolden fra enden af røret ved at tage fat med en tang og trække kraftigt, og derefter forsigtigt bøje enden til en omtrentlig 45 ° vinkel. Skær en 11- til 12-tommer længde af polyethylen slange med et ID på 0,28 mm og OD 0.61 mm. Også købe og sterilisere et glas 100 pi mikro-injektionssprøjte og en 30-gauge metal mikro-injektionskanyle. (Se Figur 1B.)
- Placer metalkanyle i et glas, med skruelåg rør og autoklaven ved standardmetoder for at sterilisere. Soak og opbevare skære længder af polyethylenrør i en overdækket bægerglas indeholdende alkohol.
- For rotter, køb eller fremstille en metal kanyle, der er cirka 12 cm i længden, har et ID på 0,9 - 1,0 mm og OD på 1,0 - 1,2 mm, og er bøjet til en omtrentlig 45 ° vinkel i den ene ende. Skær en 11- til 12-tommer længde af polyethylen slange med et ID på 0,4 mm og OD 0,8 mm. (Henvise til
- Forbered arbejde overflade og intubation enhed.
- Placer en ren engangs mat på arbejdsfladen, tæt på vandbad. Overfør metalkanyle i sit glas opbevaringsrøret, til denne flade. Fjern hætten fra opbevaringsrøret og skub "håndtag" ende af cannula til den åbne ende af røret.
- Under anvendelse af sterile pincetter, en længde polyethylenrør fjerne fra bægeret og indsætte den gennem indersiden af den sterile metalkanyle, sikre, at den bevæger sig frit. Monter en steril engangs 25-gauge kanyle (for rotter) eller den steriliserede 30-gauge metal kanyle af et glas mikro-injektionssprøjte (for mus) på den frie ende af polyethylenrør ved at skubbe nålen adskillige mm i rørledningen. (Se figur 1A for rotte og figur 1B for mus).
- Sted guide mærker på både metalkanyle og polyethylenrør for at angive dybden af indføring i dyret ved at følge intubation nedenfor beskrevne procedure på en enkelt aflivet dyr. Åbn brysthulen til observation, og derefter placere metal kanyle ordentligt og fremme polyethylen slange passende (som beskrevet i afsnit 4.7). Brug af et uudsletteligt pen, markere metalkanyle hvor den møder mundingen af dyret og polyethylen slange, hvor den møder toppen af metal kanyle til støtte korrekt placering i øvrige dyr.
- Inden et stinkskab (eller anvendelse af en passende udsugningssystem), bedøver op til 6 dyr ad gangen i et lukket kammer forsynet med ≤5% isofluran i 1,5 l / min oxygen indtil gag reflex inhiberes (ca. 1 min).
BEMÆRK: Før udførelse af nogen eksperimenter, etablere den sikre dosis og eksponeringstid for isofluran under de særlige betingelser, der anvendes (f.eks størrelse / type kammer og størrelse / art / stamme af dyr) for at forhindre utilsigtet dødelig eksponering. - Fyld en steril engangs 1 ml sprøjte (for rotter) med sterilt saltvand ved at placere den sterile spids ind i saltvand og trække tilbage i stemplet. Fyld den sterile glas mikro-injektionssprøjte (for mus) som beskrevet nedenfor. Sæt sprøjten til kanylen monteres på polyethylenrør, og skylle hele volumen saltvand gennem slangen indtil Syringe tømmes.
- For at fylde mikroinjektion sprøjte (for mus), helt fjerne metal stemplet og nålen (monteret på polyethylenrør) fra sprøjten og indstille både til side.
- Fyld en steril engangs 1 ml sprøjte med sterilt saltvand (som beskrevet ovenfor) og vedlægge en steril engangs 25-gauge nål. Stik nålen ind i toppen af mikro-injektionssprøjte (hvor metallet stemplet vil blive indsat), og trykkes stemplet af engangssprøjte indtil det fylder mikroinjektion sprøjte med saltvand.
- Kassér engangssprøjte og nål, blev brugt til at fylde mikroinjektion sprøjten i en affaldsbeholder. Re-vedhæfte metal mikro-kanyle (monteres på polyethylen slange) til spidsen af mikro-injektionssprøjten og sæt metal stemplet, deprimerende, indtil hele mængden af saltvand er skyllet gennem sprøjten og slangen.
- Fyld sprøjten med agar-baserede inokulum from beholderen i vandbadet, og flugter agar gennem røret lige indtil slangen er primet (fx fuldstændigt fyldt med agaren).
- For rotter, fjern 25-gauge kanyle (monteret på polyethylenrør) fra engangssprøjte. Bortskaf den brugte sprøjte i en kanyleboks. Fyld en ny, steril engangs 1 ml sprøjte med agarbaseret inokulum fra beholderen i vandbadet ved at placere den sterile spids ind i inokulum og trække tilbage i stemplet. Re-vedhæfte nål (monteres på polyethylenrør) og flugter agar gennem røret ved at trykke stemplet lige indtil slangen er helt fyldt med agar.
- For mus, fjerne metal mikro-kanyle (monteres på polyethylen slanger) og metal stempel fra mikro-injektionssprøjte og der er afsat. Anvendelse af en steril engangs 1 ml sprøjte og sterilt engangs 25-gauge kanyle, fylde mikroinjektion sprøjte med agarbaseret inokulum fra beholderen ivandbad ved hjælp fyldet beskrevet i afsnit 4.4. Re-vedhæfte metal mikro-kanyle (monteres på polyethylen slange), indsætte metal stemplet, og skyl agar gennem slangen lige indtil slangen er helt fyldt med agar.
- Tag et dyr fra bedøvelsen kammer. Sende dyret i rygleje på engangsemballagen måtten med hovedet til højre og hale til venstre som vist i figur 1C.
- Brug af intubation indretningen (dvs. metalkanyle monteret med polyethylenrør), intubere dyret og indsætte kanylen ind i den store lap af venstre lunge (se figur 1D).
- Sæt den frie ende af metal kanyle ind i dyrets mund. Drej kanylen, således at den frie ende er vinklet opad og forsigtigt rykke det i luftrøret, omhyggeligt uden om larynx strukturer med en let drejende bevægelse. Bekræft indsættelse i luftrøret i modsætning til denesophagus ved forsigtigt at skubbe kanylen lidt frem og tilbage flere gange, mens palpating de trachealringe med venstre pegefinger som vist i figur 1C.
- Når kanylen når bifurkationen hvor luftrøret deler sig i venstre og højre bronkier, gøre en let drejende bevægelse mod dyrets venstre side for at sikre, at kanylen er indsat i venstre bronchus. Advance metal kanyle indtil udgangen er halvvejs til tre fjerdedele ned venstre lunge, ved hjælp af den tidligere placeret guide mærke at bekræfte, at passende dybde er nået.
- Med metallet kanylen på plads, fremføre polyethylenrør flere mm. Bruge den tidligere placeret guide mærke på slangen for at sikre det fremføres kun langt nok til at afslutte enden af metalkanyle og ikke punktere lungen.
- Med både kanyler på plads, skal du bruge sprøjten til at indgyde 100 uL (for rotter) eller 20 uL (for mus) af agar suspension dybt ind i den store lap af venstre lunge (se figur 1D). Træk flere mm af polyethylen rør, og derefter forsigtigt fjerne den intakte intubation enhed. Sæt den tilbage i glasset opbevaring rør, og flyt dyret ind i en frisk bur at komme sig.
- Fortsæt bedøve, intuberende og pode de resterende dyr.
- Mellem partier af bedøvede dyr, fjernes kanylen (monteret på slangen) fra sprøjten. For rotter, kassere den brugte engangssprøjte i en kanyleboks og udfylde en ny, steril engangssprøjte fra inokulum i vandbad. For mus, påfylde det samme glas mikro-injektionssprøjte fra inokulum i vandbadet ved hjælp af fyld teknikken beskrevet i afsnit 4.4.
- Hvis agar begynder at blive tykkere i intubation enhed, skylle alle resterende agar gennem slangen. Fjern nålen fra sprøjten (forlader kanylen monteres på polyethylen slange). Følg procedurerne beskreveti afsnit 4.4 at skylle varm, sterilt saltvand gennem intubation enhed, gentaget så nødvendigt helt klart nogen blokering. Tøm alle saltvand fra sprøjten og forberede agar inokulum igen som beskrevet i afsnit 4.5.
- Beregn den endelige bakterielle inokulum per dyr efter CFU bestemt ud fra saltvand suspension (se afsnit 2.3), den endelige fortyndingsfaktor af saltvandssuspension i agar (f.eks ti gange), og volumenet indpodet i dyrene (fx 100 pi for rotter eller 20 pi for mus).
5. Vurdere Dyr for Potentielle Mis-podning eller andre bivirkninger
- observere omhyggeligt alle dyr under intubation, instillation af agar og genrejsning efter anæstesi for at vurdere for potentielle mis-podning. Umiddelbart aflive (i henhold til lokale IACUC retningslinjer) ethvert dyr, der bløder, udviser unormal vejrtrækning (såsom anstrengt vejrtrækning eller gisper), bevæger sig ikkenormalt omkring buret, eller ikke synes lyse-eyed og sunde ved genvinding fra anæstesi.
- Hvis spontan ophør af åndedræt forekommer (normalt når podestoffet ikke er placeret dybt nok og blokerer luftvejene), bekræft død ved observation og udfører en sekundær fremgangsmåde til eutanasi (såsom cervikal dislokation eller torakotomi).
- Minimer hvor længe dyrene udsættes for isofluran, som anæstesi kun kræves i flere minutter for at udføre proceduren. Hvis der anvendes injicerbare anæstetika, sikre dyrene er under observation, indtil helt vågen. Placer dyr, især mus, i en warmed miljø til nyttiggørelse, når du bruger injicerbare anæstetika.
- Overhold dyr mindst to gange dagligt i løbet af undersøgelsen, i de følgende tegn på respiratorisk sygdom: udtalt vejrtrækning, hårrejsning, nedsat aktivitet og reduceret kropstemperatur. Umiddelbart aflive (i henhold til lokale IACUC retningslinjer) ethvert dyr, der er døende, erfaringer omNCES besværet vejrtrækning eller åndenød, har en mærkbart reduceret kropstemperatur ved håndtering, er ude af stand til eller uvillige til at flytte, eller ikke kan nå mad og vand.
6. Administrer Test Behandlinger
- Forberede og administrere test behandlinger i henhold til planlagt undersøgelse design. Begynd administration af behandlinger på 1 eller 2 timer efter infektion (eller forsinke behandlingen yderligere hvis der ønskes en højere baseline bakteriebyrden). kan ikke gives specifikke oplysninger om forberedelse og administration af test behandlinger, da det afhænger af formålet med undersøgelsen samt egenskaberne for hver individuel behandling. (Se figur 3 som et eksempel.)
- Braklægning en gruppe af inficerede, ubehandlede dyr for at tjene som baseline kontroller. Opregne de bakterielle belastning i lungerne af disse dyr på det tidspunkt behandlingen påbegyndes for de andre grupper, efter procedurerne i afsnit 7.
- For PK / PD-analyser, vurdereden farmakokinetiske profil af den indgivne behandling (er) i blodet og / eller væv af de inficerede dyr. Særlige procedurer for farmakokinetiske undersøgelser er ikke omfattet af denne artikel.
7. Optælle levedygtige bakterier fra lungerne
- Aflive en gruppe af ubehandlede dyr på behandlingen påbegyndes for de øvrige grupper (basislinje) og alle resterende dyr ved afslutningen af undersøgelsesperioden (normalt 24, 48 eller 96 timer efter infektion) ved eksponering inhalation til gradvist stigende niveauer af kulstof dioxid i et lukket kammer eller en alternativ fremgangsmåde som anbefalet af lokale IACUC retningslinjer. Verificere døden ved observation, og udfører en sekundær fremgangsmåde til eutanasi (såsom cervikal dislokation eller torakotomi).
- Placer dyrene i rygleje på en ren engangs mat, og grundigt fugte pelsen over brystet med alkohol.
- Ved hjælp af steril saks, skære gennem huden, underliggende muskel lag og brystkassenparallelt med brystbenet for at åbne brysthulen. Forsigtigt forstå lungerne med steril pincet, og træk, ved hjælp af en saks til at adskille dem fra luftrøret hvis det er nødvendigt. Placer lungerne på steril gaze til at absorbere overskydende blod. Hvis hjertet også er blevet fjernet, dissekere det væk og kassér.
- Lav små klip i lungerne med steril saks at afsløre indre sektioner og bruge steril pincet til at placere lungerne (plus eventuelle stykker, der blev uforvarende klippede off) i bunden af en lab blender pose. Kort fortalt rulle en tyk rund genstand (såsom en pen eller markør) over ydersiden af posen at mash vævet. Pipetter 1 ml sterilt saltvand i posen, anbringe posen i en lab blender, og kør laboratoriehomogenisator ved høj hastighed i 2 min.
- Overfør homogeniseret prøver fra de blandede poser i rør eller plader ved hjælp af en pipette. Fortynd homogenatet ti gange ved aliquotting 1-del homogenatet i 9-dele saltvand (såsom 100 pi homogenat i 900 pi Saline). Fortynd den resulterende suspension ved ti gange igen på en lignende måde. Fortsæt fortynde hver ny resulterende suspension af en anden ti gange faktor indtil mindst 6 serielle fortyndinger er udarbejdet fra den oprindelige homogenat.
- Pipette tredobbelte alikvoter af 20 pi hver fra alle fortyndinger onto trypticase agarplader suppleret med fåreblod (S. pneumoniae, K. pneumoniae, P. aeruginosa eller A. baumannii) eller onto chokolade-agarplader (H. influenzae). Inkuber natten over ved 37 ° C med eller uden CO 2. (Se figur 1E for et eksempel på et resulterende plade.)
- Kolonierne i hver af de tre gentagelser ved første fortynding, der indeholder en "tællelig" nummer (dvs. ikke for mange kolonier med rimelighed tæller). Beregn den gennemsnitlige værdi af de tre gentagelser. Bestem CFU pr lungerne ved at multiplicere den gennemsnitlige værdi med 50 (for at tage udpladning 20 pi af den samlede 1 mlhomogenat) og factoring i den endelige fortynding faktor fra den oprindelige homogenatet, hvor kolonierne blev talt.
Representative Results
Værktøjerne påkrævet, orientering af dyret, og dybden af intubation er vist i figur 1. Der er også vist et repræsentativt eksempel på kolonier vokser på en agarplade efter seriel fortynding og tredobbelt udpladning af en lungehomogenisat prøve. En stigning i bakteriel belastning af flere log10 CFU over udgangsniveauet kontroller er typisk observeres i inficerede lunger for de fleste bakterielle isolater, selv ved 96 timer efter infektion, og variabilitet mellem dyr er lav (figur 2). For nogle H. influenzae, kan der være ringe vækst; imidlertid bør infektionen ikke begynde at selv-ophører inden for 48 eller 96 timer tidsperiode (figur 2B). Denne lungeinfektion model kan anvendes under optimering af bly kemisk serie til støtte SAR, som vist i figur 3 for repræsentative forbindelser ifølge to forskellige serier 16, 17. Det giver en konsekvent, reproducerbar opfyldthod til vurdering PK / PD hos immunkompetente dyr og blev anvendt til at bestemme, at frit lægemiddel arealet under koncentrations-tids-kurven over minimale inhiberende koncentration (fAUC / MIC) korreleret med effekten af et hidtil ukendt polypeptid deformylase (PDF) inhibitor mod S. pneumoniae og H. influenzae (figur 4). Derudover log 1-de fAUC / MIC mål for stasis og 10 reduktion i CFU fra baseline kontroller blev bestemt på tværs 11 S. pneumoniae og 5 H. influenzae isolater (tabel 1) 18. Kobling denne infektion model med et lægemiddeltilførselssystem at genskabe humane farmakokinetiske profiler hos rotter skaber et stærkt værktøj til vurdering af menneskelige dosisregimer før kliniske studier. Et eksempel på dette er opsummeret i tabel 2, der viser, at en udvidet-release-formulering af amoxicillin-clavulanat var mere effektivt end eksisterende dosisregime for organismer med elevaTed MIC værdier 19.
Figur 1: ikke-kirurgiske Intratracheal intubation. Værktøjer er vist for intuberende rotten (A) og mus (B). Når bedøvet, bør dyret placeret som vist i C, med hovedet til højre og hale til venstre, hvis den enkelte udfører teknikken er højrehåndet. Placer venstre pegefinger forsigtigt på halsen for at hjælpe palpere de trachealringe til bekræftelse af korrekt kanyle placering. Inoculum skal placeres dybt ned i venstre lunge, som vist i den ventrale afbildning af en rottelunge (D). Kolonier vokser på agar efter seriel fortynding og plettering af en prøve skal ligne der er vist i E. Figur 1D, Copyright © Gill Smith [forsøgsdyr, bind 25 (1991), G. Smith, Asimpel, ikke-kirurgisk metode til intrabronchial instillation til etablering af luftvejsinfektioner hos rotter, sider 46 - 49] 14. Genoptrykt med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative eksempler på bakteriel vækst i lungerne af inficerede dyr. Middelværdi ± standardafvigelse CFU data fra N = 5 dyr / gruppe er vist for forskellige isolater af S. pneumoniae (A), H. influenzae (B), P. aeruginosa (C), K. pneumoniae (D) og A. baumannii (E). Den første bar af hvert par (lysegrå) er baseline bacterial byrde på 1 eller 2 timer efter infektion, mens den anden stang er vækstkontrol end-of-study ved 48 timer efter infektion (mørkegrå) eller 96 timer efter infektion (sort). blev anvendt Ingen data Censur metoder; Således er disse resultater omfatter data fra alle 5 dyr per gruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: evaluering af effekten af forskellige kemiske Series løbet Lead optimering. Lungeinfektion modeller under anvendelse af de beskrevne teknikker blev anvendt til at undersøge struktur og aktivitet som en del af abakteriel typen IIA topoisomerase program. Lovende forbindelser 7 og 1 blev evalueret mod quinolon-følsomme (A) 16 eller quinolon-resistente(B) 17 isolater af S. pneumoniae, henholdsvis. Hvert symbol repræsenterer CFU bestemt ud fra lungerne af en rotte med linjer, der repræsenterer gruppen gennemsnit og standardafvigelse. Nedre grænse for kvantificering (LLQ) var 1,7 log 10 CFU / lunger. Forbindelser blev vejet (56 eller 112 mg ren fri modermolekylet), opløst i 9 ml sterilt vand, fortyndet 3 ml i 3 ml vand (1: 1) og indgives ved oral gavage på 1 ml / 125 g rotte to gange dagligt ( 6 -) 7 timer fra hinanden i 2 dage, begyndende ved 1 time efter infektion. Ubehandlede kontroller (NTC) blev samplet ved 1 time efter infektion for basal eller behandlet med saltvand og stikprøven ved afslutningen af undersøgelsen (48 h) for kontrol vækst. 3A genoptrykt fra Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, bind 21, TJ Miles et al, Nye cyclohexyl-amider som potente antibakterielle midler rettet mod bakteriel typen IIA topoisomeraser, Pages 7483 -. 7488, Copyright (2011) 16, med tilladelse fra Elsevier.Figur 3B genoptrykt fra Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, bind 26, TJ Miles et al, Nye tricykliske (f.eks GSK945237) som potente inhibitorer af bakteriel typen IIA topoisomeraser, Pages 2464 -. 2469, Copyright (2016) 17, med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: PK / PD Karakterisering af en roman PDF Inhibitor. Emax modeller blev oprettet ved hjælp af dosis spænder effektdata hos immunkompetente mus inficeret i lungen med isolater af S. pneumoniae (A) eller H. influenzae (B) for at afgøre, PK / PD mål for en ny PDF-hæmmer 18. cirklerrepræsenterer middelværdien bakteriel byrde 4-5 mus / gruppe behandlet med varierende doser af forbindelse. Analyser blev udført for at korrelere virkningsfuldhed med frit lægemiddel 24 timer AUC (åbne cirkler) eller AUC / MIC (udfyldte cirkler). Genoptrykt med tilladelse, Copyright © American Society for Microbiology, [Antimicrobial Agents og kemoterapi, volumen 60, 2016, side 180 - 189] 18. Klik her for at se en større version af dette tal.
| stasis | 1-log 10 reduktion | ||||||
| organisme | MIC (ug / ml) | R2 for line fit (%) | fAUC | fAUC / MIC | fAUC | fAUC / MIC | Max drab (log 10 reduktion) |
| S. pneumoniae | |||||||
| 10127 | 0.25 | 99,9 | 2.0 | 8.1 | 3.6 | 14.4 | 2.8 |
| 1316009S | 0.25 | 96.1 | 6.5 | 26,0 | 15.1 | 60.3 | 1.8 |
| ATCC10813 | 0.5 | 100 | 8.4 | 16.9 | 22.2 | 44.5 | 1.2 |
| 1307007S | 1 95,8 | 16.1 | 16.1 | 20.1 | 20.1 | 2.7 | |
| ATCC6303 | 1 | 99,8 | 19.8 | 19.8 | 24.8 | 24.8 | 2.8 |
| 1629 | 2 | 100 | 15.8 | 7.9 | 21.2 | 10.6 | 2.4 |
| 298.443 | 2 | 99,9 | 26.5 | 13.2 | 31,0 | 15.5 | 2.3 |
| 336.808 | 2 | 86 | 8.2 | 4.2 | 19,0 | 9.5 | 2.6 |
| 338.860 | 2 | 99,5 | 2.9 | 1.5 | 6.7 | 3.4 | 2.8 |
| & #160; 340.449 | 2 | 94,6 | 8,0 | 4.0 | 14.9 | 7.4 | 2.1 |
| L11259 | 2 | 100 | 7.1 | 3,5 | 9,0 | 4,5 | 2.0 |
| Middelværdi ± standardafvigelse | NA en | NA | 11,0 ± 7,5 | 11,0 ± 7,9 | 17,0 ± 8,2 | 19,5 ± 17,8 | 2.3 ± 0.5 |
| median | NA | NA | 8.2 | 8.1 | 19,0 | 14.4 | 2.4 |
| H. influenzae | |||||||
| 1998-100-126H | 1 | 99,7 | 7.3 | 7.3 | 13.4 | 13.4 | 2.9 |
| 503-008H | 1 | 99,8 | 7.1 | 7.1 | 13.9 | 13.9 | 2.7 |
| 08003H | 2 | 99,9 | 14.5 | 7.2 | 16,7 | 8.3 | 2.7 |
| H128 | 2 | 96,6 | 15.3 | 7.6 | 26,0 | 13,0 | 2.7 |
| 19001H | 4 | 91,9 | 14.8 | 3.7 | 37.3 | 9.3 | 3.0 |
| Middelværdi ± standardafvigelse | NA | NA | 11,8 ± 4,2 | 6,6 ± 1,6 | 21,5 ± 10,2 | 11,6 ± 2,6 | 2,8 ± 0,1 |
| median | NA | NA | 14.5 | 7.2 | 16,7 | 13,0 | 2.7 |
| en NA, ikke anvendelse. | |||||||
Tabel 1: PK / PD Mål for en Novel PDF-inhibitor mod S. pneumoniae og H. influenzae isolater. AUC Free-drug og AUC / MIC mål for stasis og en 1-log 10 reduktion i CFU fra baseline blev bestemt til 11 S. pneumoniae og 5 H. influenzae i immunkompetente mus inficeret i lungen og behandlet med forbindelse 18. Den daten blev anvendt til at hjælpe med at udvælge humane doser til klinisk udvikling. Denne tabel er blevet tilpasset og genoptrykt med tilladelse, Copyright © American Society for Microbiology, [Antimicrobial Agents og kemoterapi, volumen 60, 2016, side 180 - 189] 18.
| Behandling Group a | Logaritmisk 10 S. pneumoniae (CFU / lunge) b ± SD for stamme (AMX / CA MIC): | |||||||
| 05010S (2 ug / ml) | 16001S c (4 ug / ml) | 16001S (4 ug / ml) | 30005S (4 ug / ml) | 20009S (4 ug / ml) | 05003S (8 ug / ml) | 404.053 (8 ug / ml) | 47003S (8 ug / ml) | |
| Kontrol | 7,3 ± 0,4 | 7,0 ± 0,8 | 5,7 ± 1,2 | 7,1 ± 0,7 | 7,1 ± 0,4 | 6,4 ± 0,6 | 6,8 ± 0,4 | 6,0 ± 0,3 |
| AMX / CA | ||||||||
| 2000/125 mg bud (forholdet 16: 1) | ≤ 1,7 ** | 2.8 ± 1.2 ** | 2.2 ± 0.8 ** | 2.3 ± 0,9 ** | 2,5 ± 0,9 ** | 2,0 ± 0,9 ** | 3.8 ± 1.4 ** | 1.8 ± 0.2 ** |
| 1.000 / 125 mg tid (forhold 8: 1) | NT | NT | 2.8 ± 0.5 ** | 2.7 ± 1.3 ** | 3.3 ± 0.9 ** | 4.9 ± 0.5 ** | 6,6 ± 1,3 | 4,7 ± 0,7 ** |
| NT | NT | 3,0 ± 1,3 * | 2,1 ± 0,7 ** | 3,2 ± 0,4 ** | 5,2 ± 0,9 * | 6,4 ± 0,6 | 4,9 ± 0,4 ** | |
| 875/125 mg bid (forholdet 7: 1) | NT | NT | 4,5 ± 1,2 * | 5.6 ± 1.3 * | 5,2 ± 0,7 ** | 6,3 ± 0,7 | 6,4 ± 0,7 | 5,5 ± 0,4 |
| 500/125 mg tid (forhold 4: 1) | 3,1 ± 1,3 ** | 4,5 ± 0,9 ** | NT | NT | NT | NT | NT | NT |
| Azithromycin, 1000/500 mg od | NT | NT | NT | 5,8 ± 2,0 | 7,1 ± 0,9 | 3,1 ± 1,0 ** | 6,6 ± 0,4 | 6.07; 0,6 |
| Levofloxacin, 500 mg od | NT | NT | 4,2 ± 0,8 * | 5,7 ± 0,8 * | 4.9 ± 0.8 ** | 3,0 ± 1,3 ** | 3,5 ± 0,2 ** | 3.9 ± 0.8 ** |
| Behandling Group d | Mean log 10 H. influenzae (CFU / lunge) ± SD for stamme: | |||||||
| H128 (β-lactamase positiv) | Chesterfield (β-lactamase negative, ampicillinresistente) | |||||||
| Kontrol | 6,4 ± 0,6 | 6,7 ± 0,6 | ||||||
| AMX / CA | ||||||||
| 2000/125 mg bud (forholdet 16: 1) | 2,0 ± 0,7 ** | 3,1 ± 0,9 ** | ||||||
| 1.000 / 125 mg tid (forhold 8: 1) | 2,1 ± 1,0 ** | 3.6 ± 1.1 ** | ||||||
| 875/125 mg tid (forholdet 7: 1) | 2.8 ± 1.3 ** | 3.8 ± 1.3 ** | ||||||
| 875/125 mg bid (forholdet 7: 1) | 2,0 ± 0,8 ** | 5.1 ± 1.1 ** | ||||||
| Azithromycin, 1000/500 mg od | 3,2 ± 1,7 * | 5,8 ± 1,1 | ||||||
| Levofloxacin, 500 mg od | ≤ 1,7 ** | ≤ 1,7 ** | ||||||
| en AMX / CA, amoxicillin-clavulanat; bud, to gange om dagen; tid., tre gange om dagen; od, en gang om dagen. | ||||||||
| b Detektionsgrænsen var <1,7; *, Signifikant forskellig fra kontrol (P ≤ 0,05); **, Signifikant forskellig fra kontrolgruppen (P ≤ 0,01); NT, ikke testet. | ||||||||
| C-stamme 16001S blev testet i to separate forsøg. | ||||||||
| d Amoxicillin-clavulanat 500/125 mg (4: 1) tre gange om dagen blev ikke testet mod H. influenzae-stammer. | ||||||||
Tabel 2: Effekt af genskabt humant plasma eksponering profiler til forskellige Amoxicillin / clavulanat Dosering regimer. Data genereret hos immunkompetente rotter inficeret i lungen med isolater af S. pneumoniae eller H. influenzae ved hjælp af denne model viste, at en forbedret formulering af amoxicillin-clavulanat (2, 000/125 mg to gange dagligt) var mere effektivt end standard doseringsregimer mod isolater med forhøjet in vitro følsomhed 19. Denne tabel er blevet tilpasset og genoptrykt med tilladelse, Copyright © American Society for Microbiology, [Antimicrobial Agents og kemoterapi, volumen 49, 2005, side 908 - 915] 19.
Discussion
For optimal succes i at reproducere denne infektion model, bør overvejes følgende yderligere forslag. Virulens af nye isolater kan forøges ved passage 2 - 3 gange in vivo før anvendelse i et forsøg. Frosne bakterielle lagre bør altid være forberedt fra en primær in vivo-afledt kilde med så få passager som muligt fra originalen, og genfrysning eller genbrug af optøet bestand frarådes. Brug af nylige kliniske isolater udvundet fra patienter med lungebetændelse, og / eller fremstilling af kulturer i den logaritmiske vækstfase kan også bidrage til at forbedre etablering af infektionen. En fem ganges fortynding i agaren (f.eks 2 ml saltvand suspension tilsat til 8 ml agar) kan anvendes i stedet for ti gange for at øge den bakterielle inokulum, og podevolumen kan justeres baseret på størrelsen af dyret (f.eks 200 pi / dyr sædvanligvis podet i 250 g rotter). Før tilsætning af saltvand bakteriesuspension iagar (dvs. i trin 2.3), kan den bakterielle tæthed forudsiges eller estimeres ved visuel inspektion, MacFarland standarder eller målinger af optisk densitet. Det er nyttigt at blive fortrolig med de in vitro-vækst for ethvert isolere før udførelse in vivo forsøg. Sammenhæng i vækst og håndtering muliggør den mest nøjagtige vurdering af den bakterielle tæthed for en given isolat. Standard mikrobiologiske metoder, der adskiller sig fra dem, der er beskrevet, såsom alternative medier og væv homogenisatorer, kan anvendes som passende til at forberede podestoffer og optælle bakterier fra inficerede væv.
Det anbefales stærkt at forberede eller smelte agaren dagen før forsøget og gemme det natten over i en separat vandbad indstillet til 50 ° C. Dette vil forenkle processen og hjælpe vagt over agaren bliver alt for varmt på tidspunktet for infektion. En temperatur på 41-42 ° C opnår en god balance mellem maintaining agar i flydende tilstand uden at være for varmt for kortsigtet bakteriel overlevelse. Som et muligt alternativ til næringsstof agar er ædel agar været anvendt med succes i nogle eksperimenter. Et rør af agar inokulum er normalt tilstrækkeligt for en hel eksperiment (og anbefales), men flere rør kan fremstilles til at inficere et stort antal dyr (fx mere end 60), eller når den inficerende proces tager længere end 30 - 45 min Hvis flere inokulum rør er påkrævet, tilsæt saltvand bakteriesuspension til hvert rør af agar, som det er nødvendigt. Dette reducerer risikoen for, at bakteriel overlevelse og / eller egnethed vil blive påvirket af forlænget udsættelse for en forhøjet temperatur før inokulering. Det skal bemærkes, at ved hjælp af flere inokulum rør også kan kræve yderligere dyr randomisering procedurer. Når det er muligt, inficere alle dyr fra samme inokulum forberedelse. Det anbefales at skræddersy størrelsen af eksperimenter til det nuværende niveau for færdigheder med technique.
En dygtig videnskabsmand kan intubere og pode et dyr på mindre end 30 s og pode op til 5 - 6 dyr pr parti (dvs. med en sprøjte fyldt med agar inokulum). For dem, der lærer teknikken, hastighed er vigtigt, da agaren vil begynde at størkne; imidlertid nøjagtig placering af inokulummet er vigtigere. Begynd med 1 eller 2 dyr pr parti, og øger som teknikken bliver mere fortrolig. Dyrene fortsat trække vejret under intubation; således, tidsvinduet til podning afhænger af, hvor hurtigt dyret kommer sig isofluran, som bør være ca. 2 - 3 i min. Dyr, der vækker under processen kan genbruges bedøvet og forsøgte en anden gang, men det anbefales ikke at gøre det gentagne gange. Vellykket podning i første forsøg forventes i næsten 100% af dyrene, når færdigheder er opnået. Bemærk, at det er lettere at lære teknikken ved anvendelse rotter først; mus er mere sarte og den mindre forls er mere tilbøjelige til blokering med størknet agar hvis ikke manipuleres hurtigt. Pre-opvarmning sprøjter, slanger og saltholdige samt holde intubation enhed på en varm (ikke varmt) overflade, såsom en varmepude på lav indstilling, kan hjælpe med at forhindre størkning af agaren. Når man lærer teknikken, er det også nyttigt at praktisere korrekt placering af inoculum anvendelse af en mørk farvet farvestof (såsom koncentreret methylenblåt) i stedet for den bakterielle suspension i agar. Udføre proceduren som beskrevet, men aflive dyret umiddelbart efter inokulation af farvestoffet (ikke tillader dyret kan komme mellem anæstesi og eutanasi). Dissekere at bestemme, hvor farvestoffet er blevet placeret, og justere teknik i overensstemmelse hermed.
Det primære endepunkt i denne model er CFU fra inficerede lunger. Overlevelse er ikke en god indikator for bakteriel byrde og er ikke en anbefalet endpoint. For undersøgelser af effekten, den foreslåede N er 5 - 6 dyr pr gruppe, da dette er predicted at detektere ≥1 log10 CFU forskelle mellem grupper med mindst 90% kraft. Dyr kan inficeres i grupper, således at bur hjælpere blive sammen, eller en sand randomisering proces kan følges. Bemærk, at hvis grupper er tildelt af buret, bør grupperne være inficeret i en tilfældig rækkefølge med end-of-studie vækst kontroller inficeret sidste (at bekræfte, at bakteriel overlevelse / fitness blev ikke påvirket af den tid udsættes for en forhøjet temperatur i vandbad). Ingen data Censur metoder bør være nødvendig, og ingen anbefales med undtagelse af øjeblikkelig fjernelse af ethvert dyr, der har været åbenbart mis-inokulerede ved begyndelsen af undersøgelsen (før initiering af nogen behandlinger). Dyr, der aflivet inden afslutningen af undersøgelsen bør udtages prøver og resultater indgår i datasættet, medmindre en gyldig grund til udelukkelse blev identificeret prospektivt (dvs. en begivenhed relateret til infektion eller behandling). Drug fremførsel kan affect nogle prøver og er en vigtig overvejelse for alle in vivo infektion modeller. Hvis en forbindelse er givet hyppigt, tæt på tidspunktet for eutanasi eller har en lang halveringstid, kan den være til stede i vævshomogenatet ved en høj nok koncentration til fortsat at dræbe bakterier ex vivo under den bakterielle optælling proces (fortynding og udpladning af de prøver eller på agarpladerne under inkubation natten over). For at forhindre dette, aktivt kul og / eller et additiv, som nedbryder det aktive molekyle uden at skade de bakterielle celler kan sættes til før homogenisering af prøven. Andre metoder omfatter centrifugering af prøverne for at fjerne størstedelen af den aktive forbindelse (som bør forblive i supernatanten) og anvender forskellige fortynding og udpladning ordninger til tilstrækkelig fortynde den aktive forbindelse til en ikke-inhiberende koncentration.
Som det fremgår af de i figur 2 viste eksempler, denne model med succes induces lungeinfektioner hos gnavere med en lang række af organismer, herunder dem, der ikke vokser godt i andre modeller (f.eks H. influenzae). Disse infektioner er konsekvent og reproducerbar, hvilket reducerer sandsynligheden for, at forsøgene skal blive gentaget på grund af model svigt og / eller dårlige resultater med en given isolat. Selvom dyrene er immunokompetente, er de ikke i stand til hurtigt at løse infektion, hvis overhovedet. Dette giver mulighed for øget fleksibilitet i studie længde, så mange isolater opretholde en levedygtig infektion gennem mindst 96 timer uden behov for gentagne injektioner for at opretholde neutropeni. Den potentielle fordel ved at studere antibakteriel effekt i immunkompetente dyr er tidligere blevet bemærket 20, 21, og der er tegn på, at for nogle forbindelser (f.eks oxazolidinoner), kan data fra ikke-neutropene gnavere mere præcist forudsige mål human eksponering sammenlignet med dem, afsmeltet neutropeni fem. Den multi-purpose anvendeligheden af than model er demonstreret i figur 3 og 4 og tabel 1 og 2. Disse undersøgelser er en del af en stor samling af offentliggjorte eller ikke offentliggjorte data, der er genereret med denne model til at støtte bly optimering indsats 16, 17, 22-24, til sammenligning og bekræftelse af foreslåede human doseringsregimer 19, 25-29 og for PK / PD karakterisering 18, 30-32 .Mens denne model er oprindeligt mere kompliceret at udføre i forhold til den intranasale inhalation metode, der er mange fordele som beskrevet ovenfor. Med praksis og rutinemæssig brug, bør de teknikker bliver ligetil at udføre.
Det kan bemærkes i nogle undersøgelser, at den bakterielle belastning ved baseline var lavere end typisk målrettet i andre lungeinfektion modeller. Dette skyldes for en stor del til den ønskede fortynding i agar og det lille udfordring volumen, især i mus. Imidlertid bør det også bemærkes,at bakteriel vækst blev set i alle tilfælde, selv når den oprindelige byrde var forholdsvis lav. Målet baseline bakterielle belastning er på 6 til 6.5 log 10 CFU / lunger (6,8 til 7,3 log 10 CFU / g væv i mus baseret på den gennemsnitlige lungevægte) svarende til densiteter estimeret i humane patienter med svær lungebetændelse 33. En højere baseline byrde kan opnås ved yderligere koncentrering af den bakterielle inokulum eller ved at forsinke starten af forbindelse administration at tillade yderligere bakterievækst; dog øge udfordringen belastning for meget kan føre til unormalt alvorlig og akut sygdom (dvs. død i mindre end 24 timer), som er refraktære over for alle antibakterielle behandlinger uanset modtagelighed. Selvom inoculum i første omgang placeres fortrinsvis i den venstre lunge af dyret, generelt spreder infektionen hele begge lunger. Progressiv lungesygdom, formidling af bakterierne til andre organer, og eventuel sygelighed er ofte observed med S. pneumoniae, K. pneumoniae og P. aeruginosa. Af interesse, infektioner med H. influenzae og A. baumannii er normalt mere indeholdt og sjældent føre til døden på den foreskrevne bakterielle podestoffer.
Effekt resultater fra denne model har korreleret godt med in vitro modtagelighed profiler samt defineret PK / PD-mål. Reduktioner i bakteriebyrden rutinemæssigt observeres for isolater betragtes som modtagelige for midlet, der testes, mens dem, der anses resistente udviser ingen ændring eller bakterievækst over basislinien 16, 17, 19, 24-29. Forsøg med rotter evaluering to quinoloner og et makrolid ved hjælp af denne model 32 har vist, at PK / PD target kræves for en 1-log 10 reduktion i S. pneumoniae sammenlignet med baseline korreleret med målet bestemmes i neutropene mus og, endnu vigtigere, med kliniske mål for erhvervet uden bakteriel PneumOnia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, en ny mekanisme antibiotikum, blev testet mod flere S. pneumoniae og krævede en lignende PK / PD mål for en 1-log 10 reduktion i denne lungeinfektion model 31 som der kræves for en 1-log 10 reduktion i neutropenisk låret model 36 når lunge penetration blev taget hensyn til (data på filen). Tilsvarende PK / PD-mål bestemt i mus for GSK2251052 mod P. aeruginosa var konsistente for stasis, 1- og 2-log 10 reduktioner i CFU mellem dette lunge model 30 og den neutropene låret infektion model, når lunge penetration blev betragtet 37, 38 . Korrelation med en neutropenisk lungeinfektion model ved hjælp af intranasal inokulation var dårlig; dog havde GSK2251052 ikke producere mere end en statisk respons i denne undersøgelse 38. Dette kan skyldes den højere bakterielle inokulum, som var 8 log 10 CFU / mus sammenlignet med 6 log
Der er flere begrænsninger af denne immunkompetente lungebetændelse model. For det første er ikke velegnet til at vurdere udviklingen af spontan modstand, fordi den høje bakteriel inokulum generelt kræves for sådanne undersøgelser resulterer i alt for alvorlig en infektion. Efter forsøg på at opnå bakterielle byrder på 7 eller 8 log 10 CFU ved baseline, er blevet observeret hurtig sygelighed (dvs. dyr bliver døende på mindre end 24 timer) på trods af grundig vask af inocula at fjerne allerede eksisterende toksiner (data på filen). Detkan være muligt at afhjælpe dette problem ved at anvende større gnavere. Rotter, især tungere rotter (> 250 g), synes at bedre tåle højere podestoffer sammenlignet med mus og kan være egnet til disse typer af studier. En anden begrænsning er, at anvendelsen af agar som en infektion-enhancer kan udelukke modellen anvendes til evaluering af visse vært: patogen interaktioner. Det menes, at agaren indeholder en beskyttet brændpunkt indtil infektionen er fuldt etableret i lungen. Det er muligt at levere podestoffet i saltvand i stedet for agar til at overvinde dette problem; imidlertid skal det bemærkes, at dette kun vil producere infektion med nogle isolater. For det tredje, der er en stejl indlæringskurve kræves for at blive dygtige i teknikken. Proceduren kan være sart, især i mus. Det er let at fejlagtigt placere metalkanyle i spiserøret, og overdreven kraft kan føre til punktering af enten esophagus eller trachea. Omhyggelig placering af inoculum er ogsåpåkrævet eller dyr kan enten ikke komme sig eller ikke i tilstrækkelig grad smittet. Men med tålmodighed og udholdenhed, kan man blive meget dygtige og udfører teknikken hurtigt, smidigt og præcist.
Ved at fjerne kravet om neutropeni, øget robusthed og reproducerbarhed, så efterforskerne til at studere flere patogener og isolater, forbedre fleksibiliteten i eksperimentelle design og giver en udfordrende infektion at karakterisere farmakodynamik for lungebetændelse, dette immunkompetente lungeinfektion model tilføjer væsentlig værdi antibiotika opdagelse fællesskab. Øget brug af denne model med yderligere efterforskere vil bidrage til at give den nødvendige benchmarking for at få mere udbredt accept og fortsætte med at yde understøttende oplysninger til passende fortolkning.
Disclosures
Forfatterne er alle betalt medarbejdere i GlaxoSmithKline Pharmaceuticals og egne aktier i bestanden i virksomheden.
Acknowledgments
JH ønsker at anerkende og takke mentor, ven og tidligere manager Valerie Berry for første lærer os denne model; og Gary Woodnutt, der lærte os grundlaget for og inspirerede vores forpligtelse til inden for antibakterielle PK / PD. Alle forfattere vil gerne takke David Payne for hans støtte og påskønnelse for vores videnskab. Vi vil gerne anerkende vores tidligere in vivo mikrobiologi kolleger, der har bidraget til kroppen af data genereret ved hjælp af disse metoder, især Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni Side og Nerissa Simon. Endelig vores tak til vores in vitro mikrobiologi kolleger for deres bistand, især til at give alle de MIC vi anmodning (Lynn McCloskey, Josh West og Sharon Min); og for vores kliniske mikrobiologi team, der giver ekspertrådgivning og support (Linda Miller, Nicole Scangarella-Oman og Deborah Butler).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
| Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
| BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
| BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
| Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
| 0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
| Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
| 30 mL free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100 mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
| Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
| 90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
| 1 mL TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| Animal feeding needle - straight 20 x 3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
| Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand - Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
| 75 TN 5.0 µL syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
| Pyrex tube, culture 25x150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
| 70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
| Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
| Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
| Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
| Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |
References
- Eagle, H., Fleischman, R., Levy, M. Continuous' vs. 'discontinuous' therapy with penicillin: the effect of the interval between injections on therapeutic efficacy. N Engl J Med. 248 (12), 481-488 (1953).
- Eagle, H., Fleischman, R., Musselman, A. D. The bactericidal action of penicillin in vivo: the participation of the host, and the slow recovery of the surviving organisms. Ann Intern Med. 33 (3), 544-571 (1950).
- Vogelman, B., et al. Correlation of antimicrobial pharmacokinetic parameters with therapeutic efficacy in an animal model. J Infect Dis. 158 (4), 831-847 (1988).
- Craig, W. A. Pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters: rationale for antibacterial dosing of mice and men. Clin Infect Dis. 26 (1), 1-12 (1998).
- Ambrose, P. G., et al. Pharmacokinetics-pharmacodynamics of antimicrobial therapy: it's not just for mice anymore. Clin Infect Dis. 44 (1), 79-86 (2007).
- Ambrose, P. G., Bhavnani, S. M., Owens, R. C. Clinical pharmacodynamics of quinolones. Infect Dis Clin North Am. 17 (3), 529-543 (2003).
- Andes, D. Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of antimicrobials in the therapy of respiratory tract infections. Curr Opin Inf Dis. 14 (2), 165-172 (2001).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (3), L387-L398 (2008).
- Antibiotics in laboratory medicine, 5th edition. Chapter 15: Evaluation of antimicrobials in experimental animal infections. Lorian, V. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. (2005).
- McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiol Rev. 37 (2), 130-155 (2013).
- Nuermberger, E. Murine models of pneumococcal pneumonia and their applicability to the study of tissue-directed antimicrobials. Pharmacotherapy. 25 (12 Pt 2), 134S-139S (2005).
- Mehrad, B., Standiford, T. J. Use of animal models in the study of inflammatory mediators of pneumonia. ILAR J. 40 (4), 167-174 (1999).
- De Simone, M., et al. Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Smith, G. A simple non-surgical method of intrabronchial instillation for the establishment of respiratory infections in the rat. Lab Anim. 25 (1), 46-49 (1991).
- Berry, V., Ferreira-Cornwell, M. C., Singley, C., Woodnutt, G. Development of experimental murine infections caused by H. influenzae and H. parainfluenzae. Clin Microbiol Infect. 7 (S1), 322 (2001).
- Miles, T. J., et al. Novel cyclohexyl-amides as potent antibacterials targeting bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 21 (24), 7483-7488 (2011).
- Miles, T. J., et al. Novel tricyclics (e.g. GSK945237) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 26 (10), 2464-2469 (2016).
- Hoover, J., et al. Pharmacokinetics/pharmacodynamics of peptide deformylase inhibitor GSK1322322 against Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Staphylococcus aureus in rodent models of infection. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), 180-189 (2016).
- Berry, V., Hoover, J., Singley, C., Woodnutt, G. Comparative bacteriological efficacy of pharmacokinetically enhanced amoxicillin-clavulanate against Streptococcus pneumoniae with elevated amoxicillin MICs and Haemophilus influenzae. Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 908-915 (2005).
- Czock, D., Markert, C., Hartman, B., Keller, F. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of antimicrobial drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5 (5), 475-487 (2009).
- Drusano, G. L., Fregeau, C., Liu, W., Brown, D. L., Louie, A. Impact of burden on granulocyte clearance of bacteria in a mouse thigh infection model. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4368-4372 (2010).
- Miles, T. J., et al. Novel hydroxyl tricyclics (e.g. GSK966587) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 23 (19), 5437-5441 (2013).
- Hunt, E. Pleuromutilin antibiotics. Drugs Future. 25 (11), 1163-1168 (2000).
- Jin, Q., et al. Novel LpxC inhibitors with broad-spectrum gram-negative activity. Proceedings of the 44th National Organic Chemistry Symposium.. College Park, MD, , Abstract T-31 (2015).
- Singley, C., Page, R., Hoover, J., Elefante, P., DeMarsh, P. Efficacy of a LRS inhibitor GSK2251052 against Enterobacteriaceae isolates using a computer-controlled infusion system to recreate human PK profiles in rats. Clin Microbiol Infect. 17 (S4), S429-S430 (2011).
- Berry, V., et al. Comparative in vivo activity of gemifloxacin in a rat model of respiratory tract infection. J Antimicrob Chemother. 45 (S1), 79-85 (2000).
- Tsuji, M., et al. S-649266, a Novel Siderophore Cephalosporin: Efficacy against Klebsiella pneumoniae producing NDM-1 or KPC in rat lung infection model with recreated humanized exposure profile of 2 gram dose with 1 hour and 3 hours infusion. Open Forum Infect Dis. 1 (S1), S106-S107 (2014).
- Tsuji, M., et al. Use of Iron Depleted Mueller Hinton Broth (IDMHB) for microdilution testing of S-649266, a novel siderophore cephalosporin. 26th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Amsterdam, Netherlands, , Abstract P0808 (2016).
- Singley, C., Hoover, J., DeMarsh, P. J., Elefante, P., Zalacain, M. Efficacy of PDF Inhibitor GSK1322322 Against Abscess Infections Caused by MRSA Using a Computer-Controlled Infusion System to Recreate Human PK Profiles in Rats. Proceedings of the 60th Annual Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Boston, MA, , Abstract F1-2114 (2010).
- Hoover, J., Mininger, C., Rittenhouse, S. GSK2251052, a novel LeuRS inhibitor, is effective against multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa in a mouse pneumonia model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract B-1308 (2012).
- Hoover, J., Mininger, C., Novick, S., Rittenhouse, S. Efficacy of GSK2140944 against Streptococcus pneumoniae in a non-neutropenic mouse lung infection model. Proceedings of the 53rd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Denver, CO, , Abstract A-014 (2013).
- Hoover, J. L., et al. Selection of a lung infection model to predict efficacy in community-acquired pneumonia (CAP) caused by S. pneumoniae (SP). Proceedings of the 47th Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Chicago, Illinois, , Abstract A-17 (2007).
- Drusano, G. L., et al. Saturability of granulocyte kill of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of pneumonia. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2693-2695 (2011).
- Peric, M., Browne, F. A., Jacobs, M. R., Applebaum, P. C. Activity of nine oral agents against gram-positive and gram-negative bacteria encountered in community-acquired infections: use of pharmacokinetic/pharmacodynamic breakpoints in the comparative assessment of beta-lactam and macrolide antimicrobial agents. Clin Ther. 25 (1), 169-177 (2003).
- Calbo, E., Garau, J. Application of pharmacokinetics and pharmacodynamics to antimicrobial therapy of community-acquired respiratory tract infections. Respiration. 72 (6), 561-571 (2005).
- Bulik, C. C., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2140944 against Staphylococcus aureus and Streptococcus pneumoniae in a murine-thigh infection model. Proceedings of the 54th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Washington, DC, , Abstract A-680 (2014).
- Bulik, C. C., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli in a murine-thigh infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract A-1270 (2012).
- Andes, D. R., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli using data from a neutropenic murine-pneumonia infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract A-1271 (2012).
