Abstract
Aday anti bakteriyel tedavilerin etkinliği tercihan amaçlanan klinik endikasyon taklit modellerinde, keşfi ve geliştirilmesi sürecinin bir parçası olarak enfekte olmuş hayvan modellerinde gösterilmelidir. Imünokompetan sıçanlarda ve farelerde güçlü bir akciğer enfeksiyonları indüklemek için bir yöntem olup, S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae veya A. baumannii sebep olduğu ciddi pnömoni modelinde tedavilerin değerlendirilmesine izin veren açıklanmaktadır. Hayvanlar anestetize edilmiştir ve bir agar-bazlı aşı cerrahi olmayan Entübasyon ile akciğer derinliklerine yatırılır. Ortaya çıkan enfeksiyon, tutarlı, tekrarlanabilir ve en az 48 saat süreyle stabil ve çoğu izolatları için 96 saat kadardır. Pazarlanan antibakteriyel yapılan çalışmalar, in vivo etkinlik ile in vitro duyarlılık iyi bir korelasyon göstermiştir ve farmakokinetik / farmakodinamik hedefler arasında uyum tespitBu model ve klinik olarak kabul edilen hedefler gözlenmiştir. tekniği öğrenme bir başlangıç zaman yatırım olmasına rağmen yeterlilik elde edilir kez, bu hızlı ve verimli yapılabilir. Modelin Faydaları nötropenik ihtiyacının ortadan kaldırılması, artan sağlamlık ve tekrarlanabilirlik, daha patojenleri ve izolatları, bir bağışıklığı konak çalışma tasarım ve zorlu bir enfeksiyon kurulması geliştirilmiş esneklik çalışma yeteneği vardır.
Introduction
enfeksiyon hayvan modellerinde potansiyel ilaç adayı etkinliğini değerlendiren antibakteriyel ilaç keşfi sürecinin kritik bir unsurdur. In vivo etkinlik çalışmaları için önemli veriler sağlar karar (SAR) yapı-aktivite ilişkileri açıklık gelen, keşif çabaları açıklığı boyunca ve farmakokinetik-farmakodinamik belirlenmesi (FK / FD) üzerinden bileşiklerin özelliklerini kurşun kimyasal serisi optimize etmek ve doz seçimi destekleyen klinik geliştirme ve düzenleyici onayı. Yapılan pek çok hayvan enfeksiyon modelleri, bu amaçlar için, literatürde tarif edilmiştir. En yaygın ve yaygın olarak kullanılan modellerden biri Vogelman ve Craig 3, 4 genişletilmiş sonra Kartal 1, 2 öncülüğünde edildi ve nötropenik fare uyluk enfeksiyonudur. Bu model bakteriyel duyarlılık kesme noktaları belirlenmesi desteklenmesi ve insan doz rehberlik PK / PD hedeflerini sağlamak için paha biçilmez olmuştur. Birçok sınav vardırples bu modelin öngörü yeteneği 4-7 kanıtlanmıştır nerede. Ancak, uyluk enfeksiyon modeli dezavantajlarından biri akciğer enfeksiyonları için doğrudan ilgili olmaması. İnsanlarda enfeksiyon bölgesine hayvan modellerinde enfeksiyonun sitesi uyan daha büyük bir ağırlık artık yoktur; ve bu nedenle, pnömoninin tedavisinde bileşikleri incelemek için, hayvanlara bir akciğer enfeksiyonu modeli kullanmak için idealdir.
Deney hayvanlarında akciğer enfeksiyonları uyarılması için çeşitli yöntemler tarif burun soluma, orofaringeal yoldan aspirasyon aerosol maruz kalma ve cerrahi intratrakeal aşılamadan 8 de dahil olmak üzere anti-bakteriyel etkinlik çalışmaları için kullanılmıştır. Bir çok durumda, hayvanların (özellikle fareler) önce güçlü bir akciğer enfeksiyonu elde etmek için nötropenik hale getirilmelidir. Bu ciddi immün sistemi baskılanmış durumda olmasına rağmen, kemirgenlerde yaşayabilir enfeksiyonları üreten bakteri patojen ve suşları sayısısınırlı. Örneğin, zorluklar 11-13 oluşturabilir, başarıyla pnömoni modelleri 9, 10, ve Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ve Klebsiella pneumoniae gibi daha öldürücü patojen, Haemophilus influenzae veya Acinetobacter baumannii kurmak zor olabilir.
1991 yılında Smith, enfeksiyon basit bir cerrahi olmayan zor entübasyon yöntemiyle 14 ile ciğerlere doğrudan bakteri aşılamak tarafından kurulmuştur hangi bağışıklığı sütten kesilmiş sıçanlarda bir akciğer enfeksiyonu modeli tarif. Berry ve ark. Daha sonra fareler 15 enfekte yöntemini değiştirdi. Agar-bazlı inokulum kullanılarak bu aşılama tekniği S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa ve A. baumannii hem imünokompetan sıçanlarda ve farelerde güçlü bir akciğer enfeksiyonları neden olur. Çeşitli karşı barındıran da dahil olmak üzere izolatların geniş bir yelpazede, müsaitance belirleyicileri ve diğer aşılama yolları vasıtasıyla uygulanabilir bir enfeksiyon üretmek olmayanlar. Ayrıca, etkinlik, bağışıklığı hayvanlarda belirlenecek ağır bağışıklık yetersizliği olmayan hasta popülasyonları için geleneksel nötropenik fare modeli daha alakalı bir durum sağlar. Birden fazla patojen ve izolatların boyunca bu modelin tutarlılığı ve güvenilirliği antibakteriyel etkinlik çalışmaları için mükemmel bir çözümdür.
Protocol
S. pneumoniae
Tüm prosedürler GSK Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokoller ile uyumludur ve karşılamak veya Laboratuar Hayvan Bakımı Akreditasyon Amerikan Derneği (AAALAC), Sağlık ve İnsan Birleşik Devletleri Bölümü standartları aşan Hizmetler ve tüm yerel ve federal hayvan refahı yasaları.
NOT: Aksi belirtilmedikçe, tüm işlemler aseptik teknik kullanılarak yapılmalıdır.
1. Kültür Bakteriyel izolatları
- Suyu kültürü genellikle aşılama için yeterli malzeme sağlamaz olarak, S. pneumoniae veya H. influenzae ile 6 agar plakalarına 3 hazırlayın.
- Standart mikrobiyolojik teknikler kullanılarak, -80 ° C'de depolama donmuş bir stok kültürü çıkarın tamamen çözdürün ve çizgi koyun kanlı (S. pneumoniae) ile desteklenmiş triptik soya agar üzerine plaka başına 100 ul kadar veya çikolata agar (H. influenzae) üzerine. Veya% 5 CO2 olmadan, 37 ° C de bir gece boyunca inkübe edilir.
- K. pneumoniae, P. aeruginosa veya A. baumannii ile suyu kültürleri hazırlayın.
- , -80 ° C'de depolama dondurulmuş bir stok kültürü çıkarmak Tamamen çözülme ve 50 ml beyin kalp infüzyon (BHI) et suyuna stoklar kısım 100 uL. hafifçe çalkalama (yaklaşık 120 rpm) 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
- [İsteğe bağlı] bir günlük faz kültürü isteniyorsa, kısım 50 ml taze BHI et suyu içerisine elde edilen gecelik kültürden 1 ml. hafifçe çalkalama (yaklaşık 120 rpm) 37 ° C'de 3 saat süreyle inkübe edilir.
2. Tuzlu Bakteriyel Cezalar hazırlayın
- Tüm süspansiyon hazırlama adımları (2.3 2.1), çevre havası ve 37 ° C arasındaki bir sıcaklıkta, steril tuzlu su kullanmaktadır. Kazıma koloniler tarafından agar plakaları S. pneumoniae veya H. influenzae Hasat gecede büyümesteril bir çerçevenin bulunduğu yüzeyden. Bir bulutlanana kadar steril tuzlu su 5 ml hasat malzeme transfer opak süspansiyon elde edildi ve homojen hale gelene kadar hafifçe girdap edilir.
- K. pneumoniae Santrifüj 50 mL, P. aeruginosa ve aşılama için amaçlanan A.baumannii Nihai besiyeri kültürleri (örneğin, gece boyunca veya faz kültürleri log) 4500 x g, 5 dakika karıştırıldı. Bir pipet ve ıskarta ile süpernatantı. Homojen bir süspansiyon elde etmek için en az 5 ml steril tuzlu su içinde pelet, yavaşça girdap yeniden süspanse edin.
- Gerekirse, 8 ila 10 günlük 9 koloni oluşturan birim (CFU) / ml aralığındaki bir yoğunluk elde steril salin kullanılarak daha da süspansiyon seyreltin. CFU / mL belirlemesi için bir numuneyi çıkarın. Seri sulandırmak ve Bölüm 7.5 ve 7.6 açıklandığı gibi kısım plaka.
3. Agar bazlı inokulum hazırlayın
- agar edi küçük bir şişe (yaklaşık 50 ml) hazırlayınüreticinin talimatlarına Ding veya önceden hazırlanabilir ve depolanabilir katı besin agar bir şişe eritin. yaklaşık 50 ° C'ye soğumasını sağlayın.
- hayvanlar enfekte olacak prosedür alanına enfeksiyon süreci için sıvı agar ve gerekli tüm araç ve gereçleri taşıyın. bölgede 42 ° C 'ye ayarlanmış küçük bir su banyosu muhafaza edin.
- Agar uygun bir su banyosu içine sığacak ölçülerde olan bir steril tüp içine daha sonra yaklaşık 50 ° C sıcaklık ve kısım 9 ml ulaşmasına izin verin. ağar, yaklaşık 42 ° C'ye kadar dengeleyecek kadar su banyosu içinde, bu tüp bırakın. su kabında agar yüzeyini kaplayan fakat kap veya kapak temas olmayacak bir derinlikte olduğundan emin olun.
- su banyosu içinde 9 ml agar ihtiva eden tüpe Aşama 2.3 salin bakteri süspansiyonu 1 ml. , Tüp kap karıştırmak için birkaç kez ters ve su banyosu iade.
4.nesthetize, entübe ve inoküle Hayvanlar
Not: - 20 ağırlığında 120 g ya da erkek CD-1 fareleri - 100 ağırlığında belirli patojensiz (SPF), bağışıklığı erkek Sprague-Dawley fareleri 25 g önerilmektedir. Gıda ve su ad libitum tüm hayvanları sağlamak ve odun yongaları veya standart 12 saat aydınlık-karanlık döngüsü ile diğer emici yatak üzerinde sosyal onlara ev.
- Herhangi bir deney yapma önce almak ve hayvan türleri için uygun büyüklükte bir metal kanül ve polietilen boru sterilize edin. Steril 1 ml tek kullanımlık şırınga ve steril tek kullanımlık 25-gauge iğne edinin.
Dikkat: Her zaman bir kesici kapta bu şırınga ve iğneler atmayın.- 1.0 mm ve 1.0 OD - - sıçanları satın alma veya uzunluğu yaklaşık 12 cm olan bir metal kanül imalatı için, 0.9 kadar bir kimliği 1,2 mm, ve bir ucunda yaklaşık 45 ° açıyla bükülür. 0.4 mm OD 0.8 mm iç çapa sahip bir polietilen boru bir 11 ila 12 inç uzunluğunda kesilir. (Bakınız
- Fareler için, bir 20. hayvan besleme tüpü satın alabilirsiniz. pense ile tutup keskin çekerek tüpün ucundan topu çıkarın ve sonra yavaşça yaklaşık 45 ° açı uca bükün. 0.28 mm ve OD 0.61 mm kimliğine sahip polietilen boru bir 11- 12-inç uzunluğunda kesin. Ayrıca satın alma ve bir bardak 100 ul mikro-enjeksiyon şırınga ve 30-gauge metal mikro-enjeksiyon iğnesi sterilize edin. (1B Bakınız Şekil).
- cam, vidalı kapaklı tüp metal kanül yerleştirin ve standart yöntemlerle otoklav sterilize etmek. Islatın ve mağaza kapalı beher içeren alkol polietilen boru uzunlukları kesti.
- 1.0 mm ve 1.0 OD - - sıçanları satın alma veya uzunluğu yaklaşık 12 cm olan bir metal kanül imalatı için, 0.9 kadar bir kimliği 1,2 mm, ve bir ucunda yaklaşık 45 ° açıyla bükülür. 0.4 mm OD 0.8 mm iç çapa sahip bir polietilen boru bir 11 ila 12 inç uzunluğunda kesilir. (Bakınız
- çalışma yüzeyi ve entübasyon cihazını hazırlayın.
- su banyosu yakın çalışma yüzeyine temiz bir kağıt mat, yerleştirin. Bu yüzeye, cam saklama tüp içinde, metal kanül aktarın. Depolama tüpün kapağını açın ve cannu ve "sap" ucunu kaydırıntüpün açık ucuna la.
- serbestçe hareket emin steril forseps kullanarak, kaptan polietilen boru bir uzunluğu kaldırmak ve steril metal kanül içinden geçen takın. boru içine iğne birkaç mm kaydırarak polietilen boru serbest ucuna (sıçanlar için) steril bir tek 25-gog iğne ya da (fareler için) bir cam mikro-enjeksiyon şırınga steril 30-gauge metal iğne monte edin. (Fareler için sıçan 1A ve 1B Şekil Bakınız Şekil).
- Metal kanül ve polietilen boru hem yerleştirin kılavuz işaretleri tek ötenazi hayvan üzerinde aşağıda açıklanan entübasyon prosedürü izleyerek hayvanda yerleştirme derinliği gösterir. sonra düzgün metal kanül yerleştirin gözlem için göğüs boşluğu açın ve (Bölüm 4.7 açıklandığı gibi) uygun polietilen boru ilerlemek. silinmez bir kalem kullanarak, bu hayvanın ve poli ağzını karşılayan metal kanül işaretlemekgeri kalan hayvanlarda uygun bir yerleştirmeyi kolaylaştırmak metal kanülün üst uygun etilen boru.
- öğürme refleksi (yaklaşık 1 dakika) inhibe kadar bir çeker (ya da, uygun bir atma sistemi kullanılarak) içinde, 1.5 L / dak oksijen ≤5% izofluran ile birlikte kapalı bir odada bir süre sonra, 6 hayvan için tasarlanan anestetize.
NOT: Önceden herhangi bir deneylerini için, kazara ölümcül maruz kalmayı önlemek için kullanılan özel koşullar altında izofluran için (odası ve hayvan boyutu / tür / zorlanma örneğin boyut / türü) güvenli doz ve pozlama süresini kurmak. - tuzlu su içine steril ucu yerleştirerek ve geri pistonu çekerek steril serum fizyolojik ile (sıçanlar için) steril tek kullanımlık 1 ml şırınga doldurun. Aşağıda tarif edildiği gibi (fareler için) steril cam mikro-enjeksiyon şırınga doldurun. polietilen boru üzerine monte iğneye şırınga takın ve Syring kadar boru içinden serum fizyolojik tüm hacmini floşe boşaltılır.
- (Fareler için) mikro-enjeksiyon şırınga doldurmak için, tamamen şırınga (polietilen boru üzerine monte), metal piston ve iğne kaldırmak ve bir kenara hem ayarlayın.
- (Yukarıda anlatıldığı gibi) steril tuzlu su ile steril bir tek 1 ml şırınga doldurun ve steril bir tek 25-gauge iğne takılır. (Metal piston eklenecektir) mikro-enjeksiyon şırınga üst içine iğne takın ve tuzlu su ile mikro-enjeksiyon şırınga doldurana kadar tek kullanımlık şırınga pistonu bastırın.
- Bir kesici kabına mikro-enjeksiyon şırınga doldurmak için kullanılan tek kullanımlık şırınga ve iğne atın. mikro-enjeksiyon şırınga ucuna (polietilen boru üzerine monte), metal mikro-enjeksiyon iğnesi yeniden takın ve tuzlu tüm hacim şırınga ve tüp aracılığıyla akana kadar iç karartıcı, metal pistonu yeniden takın.
- sağa sola agar bazlı inokulum ile şırınga doldurunboru (örn tamamen agar ile dolu) dolana sadece kadar tüp aracılığıyla su banyosunda kabı ve gömme agar m.
- fareler için, tek kullanımlık şırınga (polietilen boru üzerine monte) 25-gauge iğne kaldırın. Bir kesici kabında kullanılan şırınga atın. inokulum içine steril ucu yerleştirerek ve geri pistonu çekerek su banyosunda kaptan agar bazlı aşı ile yeni, steril tek kullanımlık 1 ml şırınga doldurun. boru tamamen ağar ile doldurulur sadece kadar pistonu basarak tüp aracılığıyla (polietilen boru üzerine monte) iğne ve gömme agar yeniden takın.
- Fareler için, mikro-enjeksiyon şırınga (polietilen boru üzerine monte), metal mikro-enjeksiyon iğnesi ve metal pistonu çıkartın ve bir kenara koyun. steril tek 1 ml şırınga ve steril tek 25 ölçek iğne kullanılarak üzere kaptan agar bazlı aşı ile mikro-enjeksiyon enjektörü doldurmakBölüm 4.4'te anlatılan dolum prosedürü kullanarak su banyosu. Yeniden takın (polietilen boru üzerine monte), metal mikro-enjeksiyon iğnesi, tüp tamamen ağar ile doldurulur sadece kadar tüp yoluyla metal piston ve gömme agar yerleştirin.
- anestezik odasından bir hayvan çıkarın. Şekil 1C 'de gösterildiği gibi sola sağa ve kuyruk kafa ile atılan mat bir yatar pozisyonda hayvan yerleştirin.
- (Polietilen boru ile donatılmış metal kanül yani) entübasyon aygıtı kullanma, hayvan entübe ve sol akciğer geniş lob içine kanül yerleştirin (Şekil 1D bakınız).
- hayvanın ağzına metal kanül serbest ucunu takın. serbest ucu yukarı açılı şekilde kanül çevirin ve nazikçe dikkatlice hafif çevirme hareketleriyle laringeal yapılar atlayarak, trakea içine ilerlemek. karşı soluk borusu içine ekleme teyitŞekil 1C 'de gösterildiği gibi, sol işaret parmağı ile trakea halkaları palpe hafifçe hafifçe ileri ve geri birkaç kez kanül kaydırarak yemek borusu.
- kanül trakea sol ve sağ bronşlara ayrılır çatallaşmayı ulaştığında, hayvanın sol tarafına doğru hafif bir büküm hareket kanül sol bronş içine yerleştirildiğinden emin olun. sonuna uygun derinliğe ulaşıldı onaylamak için önceden yerleştirilen kılavuz işareti kullanarak sol akciğerin aşağı dörtte üçü, yolunu yarılamış kadar metal kanül ilerlemek.
- yerinde metal kanül ile, birkaç mm hortumu polietilen ilerlemek. sadece yeteri kadar metal kanül ucunu çıkmak ve akciğer delmeyin ilerlemiştir sağlamak için boru üzerine önceden yerleştirilen kılavuz işareti kullanın.
- yerine iki kanül ile, agar suspe bölgesinin (sıçanlar için) 100 uL ya da (fareler için) 20 uL aşılamak için bağlanmış bir şırınga kullanınnsion derin sol akciğer büyük lob içine (Şekil 1D bakınız). polietilen boru birkaç mm çekiniz ve daha sonra yavaşça sağlam entübasyon aygıtı kaldırın. geri cam saklama tüp içine ayarlayın ve kurtarmak için taze bir kafes içine hayvan taşımak.
- , Anestezi entübasyon ve kalan hayvanların aşılamak devam edin.
- anestezi hayvanların partileri arasında, şırınga (tüp üzerine monte) iğne çıkarılır. fareler için, bir dikiş iğnesi konteyner kullanılan tek kullanımlık şırınga atmak ve su banyosunda inokulum yeni, steril tek kullanımlık şırınga doldurun. Fareler için, Bölüm 4.4 de açıklanan dolum tekniği kullanılarak su banyosunda inokulum aynı cam mikro-enjeksiyon şırınga doldurun.
- Agar entübasyon cihazda kalınlaştırmak başlarsa, tüp aracılığıyla kalan tüm agar yıkayın. (Polietilen boru üzerine monte iğne bırakarak) şırınga iğne çıkarılır. açıklanan prosedürleri takipBölüm 4.4 tamamen açık, herhangi bir tıkanma için gerekli yinelenen, entübasyon cihaz üzerinden sıcak, steril tuzlu su temizlemek için. 4.5'te anlatıldığı gibi şırınga boş tüm tuzlu ve tekrar agar inokülumu hazırlar.
- Tuzlu su süspansiyondan tespit CFU kullanılarak hayvan başına nihai bakteriyel inokulum hesaplayın, ağar içine tuzlu süspansiyon (örneğin on kat) nihai seyreltme faktörü ve örneğin 100 uL (hayvanlar damlatılır hacmi (Bölüm 2.3) sıçanlar veya fareler için 20 uL).
5. Potansiyel Mis-aşılamadan veya Diğer Advers Olaylar Hayvanlar değerlendirin
- Dikkatle potansiyel yanlış aşılama için değerlendirmek için anestezi, entübasyon sırasında agar damlatma ve kurtarma tüm hayvanları gözlemlemek. Derhal kanar herhangi bir hayvan (yerel IACUC kurallarına göre) euthanize, (örneğin yorucu nefes veya nefes nefese gibi) anormal solunumu sergiler, hareket etmeznormalde kafes hakkında, ya da anestezi kurtarma üzerine parlak gözlü ve sağlıklı görünmüyor.
- solunum spontan durması (aşı yeterince derin yerleştirilmiş ve bloklar havayolu değil, genellikle zaman) oluşursa, gözlem ölümü teyit ve (örneğin servikal dislokasyon veya torakotomi gibi) ötenazi ikincil yöntemi gerçekleştirmek.
- Anestezi sadece yordamı gerçekleştirmek için birkaç dakika gerekli olduğu gibi, zaman hayvanların uzunluğu izofluran maruz aza indirir. Enjekte anestezikler kullanılması halinde, hayvanlar tamamen uyanık kadar gözlem altında olduğundan emin olun. Enjekte anestezi kullanırken kurtarma için bir ısıtılmış bir ortamda, hayvanlar, özellikle fareler yerleştirin.
- belirgin nefes, piloerection, azaltılmış aktivite ve düşük vücut sıcaklığı: solunum hastalığı aşağıdaki belirtileri çalışma süresi boyunca en az günde iki kez hayvanları gözlemlemek. Hemen experie can çekişen olan herhangi bir hayvan (yerel IACUC kurallarına göre) euthanizences nefes veya solunum sıkıntısı yorucu, taşıma üzerine belirgin düşük vücut sıcaklığı, hareket edemez veya isteksiz, ya da yiyecek ve su ulaşamaz.
6. Yönetici Testi Tedaviler
- Hazırlayın ve planlı çalışma tasarımına göre deney tedavileri yönetmek. 1 ya da 2 saat sonrası enfeksiyon tedavilerin uygulanmasını başlayın (ya da daha yüksek bir başlangıç bakteri yükü isteniyorsa ileri tedavi gecikme). hazırlanması ve test tedavilerin uygulanması için özel ayrıntıları bu çalışmanın amacı hem de her bir tedavi özelliklerine bağlı olarak verilemez. (Örnek olarak Şekil 3'e bakınız.)
- enfekte, tedavi edilmemiş hayvanların Set kenara bir grup olarak temel kontrolleri hizmet etmek. Bölüm 7 'de tarif edilen prosedürler takip edilerek, diğer gruplar için başlatılır zaman tedavi olarak bu hayvanların akciğerlerindeki bakteri yükü numaralandır.
- PK / PD analizleri için, değerlendirmekkan ve / veya enfekte olmuş hayvanların dokularında uygulanan tedavi (ler) farmakokinetik profili. Farmakokinetik çalışmalar için özel prosedürler bu makalenin kapsamı dışındadır.
7. Akcigerlerinden Canlı Bakteri numaralandırma
- Tedavi inhalasyon maruz tarafından çalışma süresi (genellikle 24, 48 veya 96 saat sonrası enfeksiyon) sonunda diğer gruplar (başlangıç) ve kalan tüm hayvanlar için başlatılan anda tedavi edilmemiş hayvanların bir grup Euthanize giderek karbon seviyeleri yükselen yerel IACUC kurallarına tarafından tavsiye edilen şekilde kapalı bir odada ya da alternatif bir yöntem dahilinde dioksit. gözlem ölümü doğrulayın ve (örneğin servikal dislokasyon veya torakotomi gibi) ötenazi ikincil yöntemi gerçekleştirmek.
- temiz bir kağıt mat bir yatar pozisyonda hayvanların koyun ve iyice alkol ile göğüs üzerinde kürk ıslak.
- Steril makas kullanarak, kas tabakası ve göğüs kafesi altında yatan, cilt kestigöğüs boşluğunu açmak için sternum paralel. Yavaşça gerekirse trakea onları ayırmak için makas kullanılarak steril forseps ile akciğerlere kavramak ve çıkarmak için çekin. Aşırı kan emmek için steril gazlı bez üzerine akciğerleri yerleştirin. Kalp de kaldırıldı, bunu uzak teşrih ve atın.
- İç bölümleri ortaya çıkarmak ve akciğerleri (artı yanlışlıkla kapalı snipped olan tüm parçaları) bir laboratuar blender torbanın dibine yerleştirmek için steril forseps kullanmak için steril bir makas ile akciğerlerde küçük snips olun. Kısaca doku püre torbanın dış üzerinde (örneğin bir kalem veya işaretleyici gibi) kalın yuvarlak bir nesne döndürün. torbasına serum fizyolojik pipetle 1 ml, bir laboratuar blender içine poşetler ve 2 dakika yüksek hızda laboratuar blenderi çalıştırın.
- Bir pipet kullanarak tüpler veya plakalar içine harmanlanmış çanta homojenize örnekleri aktarın. 900 uL salin içine 9-parça tuzlu su içine 1 bölümlük Homojenat aliquotting tarafından homojenat on kat sulandırmak (örneğin 100 uL Homojenate). Meydana çıkan süspansiyon seyreltilir benzer bir şekilde daha on kat. en az 6 seri seyreltme, orijinal homojenattan hazırlanmıştır kadar bir on misli bir faktör ile her yeni elde edilen süspansiyonu seyreltilip devam edin.
- Koyun kanı ile takviye edilmiş triptikaz soya agar plakaları üzerine tüm seyreltileri 20 uL, her (S. pneumoniae, K. pneumoniae, P. aeruginosa veya A baumannii) veya çikolata agar plakaları (H. influenzae) üzerine pipetle üç eşit kısım. Ya da CO 2 olmadan, 37 ° C de bir gece boyunca inkübe edilir. (A Elde edilen plakanın bir örnek için Şekil 1e bakınız).
- Bir "sayılabilir" sayısını (yani çok az koloniler makul saymak) içeren ilk seyreltme üç çoğaltır her kolonileri sayın. üç kez tekrarlanan deneyin ortalama değeri hesaplanır. toplam 1 mL 20 uL kaplama için hesabına 50 (ortalama değer çarpılarak akciğerlerde başına CFU belirleyinkoloniler sayıldı hangi orijinal homojenattan nihai seyreltme faktörü Homojenat) ve faktoring.
Representative Results
Araçlar, gerekli hayvan yönelim ve entübasyon derinliği Şekil 1'de gösterilmiştir. Ayrıca, seri seyreltme ve akciğer homojenatı örnek üçlü sonra kaplama bir agar plaka üzerinde büyüyen kolonilerin temsili bir örneği de gösterilmiştir. Bazal kontroller yukarıda birkaç günlük 10 CFU bakteri yükü bir artış tipik bile 96 saat sonrası enfeksiyon, en bakteriyel izolatların için enfekte akciğerlerde görülmektedir ve hayvanlar arasındaki değişkenlik düşük (Şekil 2). Bazı H. influenzae için, küçük bir büyüme söz konusu olabilir; Bununla birlikte, enfeksiyon 48 veya 96 saatlik bir sürede (Şekil 2B) olan kendi kendini gidermek başlar gerekir. Iki farklı dizi 16, 17 için temsili bileşikleri için, Şekil 3'te gösterildiği gibi, akciğer enfeksiyonu modeli, SAR desteklemek için talebi kimyasal serisi optimizasyonu esnasında kullanılabilir. Bu tutarlı, tekrarlanabilir bir araya sağlarhod S. pneumoniae 'ye karşı inhibitör imünokompetan hayvanlarda PK / PD değerlendirmek ve yeni bir polipeptit deformilaz (PDF) etkinlik ile bağlantılıdır minimum inhibitör konsantrasyonu (fAUC / MIC) üzerinden konsantrasyon-zaman eğrisi altında kalan serbest ilaç alanı belirlemek için kullanılmıştır için ve H. influenzae (Şekil 4). Buna ek olarak, durağanlık için fAUC / MIC hedefler ve bir temel kontrol 11 S. pneumoniae ve 5 H. influenzae izolatlan (Tablo 1) 18 boyunca tespit edildi arasında CFU 10 azalma 1-log. sıçanlarda insan farmakokinetik profiller yeniden bir ilaç verme sistemi ile bu enfeksiyon modeli bağlanması klinik çalışmalar önce, insan dozaj rejimleri değerlendirmek için uygun bir araç oluşturur. Bunun bir örneği, amoksisilin-klavulanat bir uzun süreli salınımlı formülasyon, eşdüzey olan organizmalar için, mevcut doz rejimleri daha etkili olduğunu göstermektedir ki, Tablo 2'de özetlenmiştirted MİK 19 değerleri.
Şekil 1: Cerrahi olmayan Entübasyon. Araçlar sıçan (A) ve fareyi (B) entübasyon için gösterilmiştir. Tekniği gerçekleştiren bireysel sağ elini ise sola sağa ve kuyruk baş, C'de gösterildiği gibi bir kez anestezi, hayvan yerleştirilmelidir. Doğru kanül yerleştirme onay trakea halkaları palpe yardımcı olmak için boğaz hafifçe sola işaret parmağı yerleştirin. Sıçan akciğer (D) alttan görünüşü gösterilen aşı derin sol akciğer yerleştirilmelidir. Örnek seri seyreltme ve sonra kaplama agar üzerinde büyüyen koloniler E gösterilene benzer görünür. Şekil 1D, Copyright © Gill Smith [Laboratuvar Hayvanları, Cilt 25 (1991), G. Smith, A49] 14 - sıçan solunum yolu enfeksiyonları, sayfalar 46 kurulması için intrabronkiyal damlatma basit cerrahi olmayan bir yöntem. izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Enfekte hayvanların Akciğerler Bakteriyel Büyüme Temsilcisi Örnekleri. N = 5 hayvan / grup standart sapma CFU verileri ortalama ± S. pneumoniae (A), H. influenzae (B), P. aeruginosa (C), K. pneumoniae (D) ve A. baumannii çeşitli izolatları için gösterilir (E). her bir çiftin (açık gri) birinci çubuğu başlangıç bacte olan1 ya da 2 saat sonrası enfeksiyon riyali yükü, ikinci çubuk 48 saat sonrası enfeksiyon (koyu gri) veya 96 saat sonrası enfeksiyon (siyah) de sonu çalışmada büyüme kontrolü ise. Hiçbir veri sansür yöntemleri uygulanmıştır; Bu nedenle, bu sonuçlar grup başına her 5 hayvandan elde edilen verileri içerir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Kurşun Optimizasyon sırasında çeşitli kimyasal Serisi Etkilerinin Değerlendirilmesi. tarif edilen teknikler kullanılarak akciğer enfeksiyonu modelleri abakteriel tip IIA topoizomeraz programının bir parçası olarak yapı-aktivite ilişkileri araştırmak için kullanıldı. Umut verici bileşikler, 7 ve 1 karşı değerlendirilmiştir duyarlı kuinolon-16 (a) ya da kinolon dirençli(B) sırasıyla S. pneumoniae 17 izolat. Her sembol CFU grubunu temsil eden çizgiler ortalama ve standart sapma ile bir sıçan akciğerlerinde tespit eder. Ölçümü (LLQ) alt sınırı 1,7 log 10 CFU / akciğer oldu. Bileşikler steril su 9 mL içinde çözüldü, (saf serbest ana molekülün 56 veya 112 mg) tartıldı, 3 ml su içine 3 mL seyreltilmiş (1: 1) ve günde iki kez 1 ml / 125 g sıçan oral gavaj yoluyla uygulanmıştır ( 6 - 7 saat arayla) 2 gün boyunca, 1 saat sonrası enfeksiyon başlayan. Tedavi edilmemiş kontrol (NTC) taban 1 saat sonra enfeksiyondan örneklenmiş ya da büyüme kontrolü için çalışma (48 saat) sonunda tuzlu su ile muamele edilmiş ve örneklenmiştir. . Bakteriyel tip IIA Topoizomerazlar hedefleyen güçlü antibakteriyel olarak Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Cilt 21, et TJ Miles arkadaşları, Roman sikloheksil-amidler yeniden basıldı Şekil 3A, Sayfalar 7483-7488, Elsevier izniyle Telif Hakkı (2011) 16.. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Cilt 26, et TJ Miles arkadaşları, Roman trisikliklerden (örn GSK945237) bakteriyel tip IIA topoizomerazların kadar güçlü inhibitörleri, Sayfa 2464 yeniden basıldı Şekil 3B - 2469, Elsevier izniyle Telif Hakkı (2016) 17. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: PK / Bir Roman PDF İnhibitörü PD Karakterizasyonu. Emax modelleri yeni PDF inhibitörü 18 PK / PD hedeflerini belirlemek için S. pneumoniae (A) veya H. influenzae (B) izolatları ile akciğer enfekte bağışıklığı farelerde etkinlik verileri arasında değişen doz kullanılarak oluşturulmuştur. çevrelerMaddenin değişen dozları ile tedavi edilen 4-5 fare / gruptan ortalama bakteri yükünü temsil etmektedir. Analizler serbest ilaç 24 saat AUC (açık daireler) ya da EAA / MIC (dolu daireler) ile etkinliğini korelasyon uygulanmıştır. Izniyle, Mikrobiyoloji, [Antimikrobiyal Ajanlar ve Kemoterapi, hacim 60, 2016, sayfalar 180-189] Copyright © American Society 18. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| kan dolaşımının durması | 10 azalma 1-log | ||||||
| organizma | MIC (ug / ml) | R2 için çizgi fiT (%) | fAUC | fAUC / MIC | fAUC | fAUC / MIC | Max öldürülmesi (10 azalma log) |
| S. pneumoniae | |||||||
| 10127 | 0.25 | 99.9 | 2.0 | 8.1 | 3.6 | 14.4 | 2.8 |
| 1316009S | 0.25 | 96.1 | 6.5 | 26.0 | 15.1 | 60.3 | 1.8 |
| ATCC10813 | 0.5 | 100 | 8.4 | 16.9 | 22.2 | 44.5 | 1.2 |
| 1307007S | 1 95.8 | 16.1 | 16.1 | 20.1 | 20.1 | 2.7 | |
| ATCC6303 | 1 | 99.8 | 19.8 | 19.8 | 24.8 | 24.8 | 2.8 |
| 1629 | 2 | 100 | 15.8 | 7.9 | 21.2 | 10.6 | 2.4 |
| 298.443 | 2 | 99.9 | 26.5 | 13.2 | 31.0 | 15.5 | 2.3 |
| 336.808 | 2 | 86 | 8.2 | 4.2 | 19.0 | 9.5 | 2.6 |
| 338.860 | 2 | 99.5 | 2.9 | 1.5 | 6.7 | 3.4 | 2.8 |
| & #160; 340.449 | 2 | 94.6 | 8.0 | 4.0 | 14.9 | 7.4 | 2.1 |
| L11259 | 2 | 100 | 7.1 | 3.5 | 9,0 | 4,5 | 2.0 |
| ± SD ortalama | NA | NA | 11.0 ± 7.5 | 11.0 ± 7.9 | 17.0 ± 8.2 | 19.5 ± 17.8 | 2.3 ± 0.5 |
| Medyan | NA | NA | 8.2 | 8.1 | 19.0 | 14.4 | 2.4 |
| H. influenzae | |||||||
| 1998-100-126H | 1 | 99.7 | 7.3 | 7.3 | 13.4 | 13.4 | 2.9 |
| 503-008H | 1 | 99.8 | 7.1 | 7.1 | 13.9 | 13.9 | 2.7 |
| 08003H | 2 | 99.9 | 14.5 | 7.2 | 16.7 | 8.3 | 2.7 |
| H128 | 2 | 96.6 | 15.3 | 7.6 | 26.0 | 13.0 | 2.7 |
| 19001H | 4 | 91.9 | 14.8 | 3.7 | 37.3 | 9.3 | 3.0 |
| ± SD ortalama | NA | NA | 11.8 ± 4.2 | 6.6 ± 1.6 | 21.5 ± 10.2 | 11.6 ± 2.6 | 2.8 ± 0.1 |
| Medyan | NA | NA | 14.5 | 7.2 | 16.7 | 13.0 | 2.7 |
| NA, uygulanamaz. | |||||||
Tablo 1: S. pneumoniae ve H. influenzae İzolatlarının karşı Roman PDF inhibitörü PK / PD Hedefler. Serbest ilaç EAA ve durağanlık için AUC / MİK hedefler ve 1-log akciğerde enfekte ve bileşik 18 ile tedavi edilen bağışıklığı farelerde 11 S. pneumoniae ve 5 H. influenzae için belirlenmiştir başlangıca CFU 10 azalma. datKlinik gelişim için seçme insan dozları yardım etmek için kullanıldı. Bu tablo adapte izniyle olmuştur, Mikrobiyoloji, [Antimikrobiyal Ajanlar ve Kemoterapi, hacim 60, 2016, sayfalar 180-189] Copyright © American Society 18.
| Tedavi Grup | B suşu (AMX / CA MIC) için ± SD 10 S. pneumoniae (CFU / akciğer) log ortalama: | |||||||
| 05010S (2 ug / ml) | 16001S c (4 ug / ml) | 16001S (4 ug / ml) | 30005S (4 ug / ml) | 20009S (4 ug / ml) | 05003S (8 ug / ml) | 404.053 (8 ug / ml) | 47003S (8 ug / ml) | |
| Kontrol | 7.3 ± 0.4 | 7.0 ± 0.8 | 5.7 ± 1.2 | 7.1 ± 0.7 | 7.1 ± 0.4 | 6.4 ± 0.6 | 6.8 ± 0.4 | 6.0 ± 0.3 |
| AMX / CA | ||||||||
| 2000/125 mg bid (oran 16: 1) | ≤ 1.7 ** | 2.8 ± 1.2 ** | 2.2 ± 0.8 ** | 2.3 ± 0.9 ** | 2.5 ± 0.9 ** | 2.0 ± 0.9 ** | 3.8 ± 1.4 ** | 1.8 ± 0.2 ** |
| 1000/125 mg tid (oran 8: 1) | NT | NT | 2.8 ± 0.5 ** | 2.7 ± 1.3 ** | 3.3 ± 0.9 ** | 4.9 ± 0.5 ** | 6.6 ± 1.3 | 4.7 ± 0.7 ** |
| NT | NT | 3.0 ± 1.3 * | 2.1 ± 0.7 ** | 3.2 ± 0.4 ** | 5.2 ± 0.9 * | 6.4 ± 0.6 | 4.9 ± 0.4 ** | |
| 875/125 mg bid (oran 7: 1) | NT | NT | 4.5 ± 1.2 * | 5.6 ± 1.3 * | 5.2 ± 0.7 ** | 6.3 ± 0.7 | 6.4 ± 0.7 | 5.5 ± 0.4 |
| 500/125 mg tid (oran 4: 1) | 3.1 ± 1.3 ** | 4.5 ± 0.9 ** | NT | NT | NT | NT | NT | NT |
| Azitromisin, 1000/500 mg od | NT | NT | NT | 5.8 ± 2.0 | 7.1 ± 0.9 | 3.1 ± 1.0 ** | 6.6 ± 0.4 | 67; 0.6 |
| Levofloksasin, 500 mg od | NT | NT | 4.2 ± 0.8 * | 5.7 ± 0.8 * | 4.9 ± 0.8 ** | 3.0 ± 1.3 ** | 3.5 ± 0.2 ** | 3.9 ± 0.8 ** |
| Tedavi Grubu d | Suşu için ± SD 10 H. influenzae (CFU / akciğer) ortalama log: | |||||||
| H128 (β-laktamaz pozitif) | kabarık kanepe (β-laktamaz negatif, ampisilin dirençli) | |||||||
| Kontrol | 6.4 ± 0.6 | 6.7 ± 0.6 | ||||||
| AMX / CA | ||||||||
| 2000/125 mg bid (oran 16: 1) | 2.0 ± 0.7 ** | 3.1 ± 0.9 ** | ||||||
| 1000/125 mg tid (oran 8: 1) | 2.1 ± 1.0 ** | 3.6 ± 1.1 ** | ||||||
| 875/125 mg tid (oran 7: 1) | 2.8 ± 1.3 ** | 3.8 ± 1.3 ** | ||||||
| 875/125 mg bid (oran 7: 1) | 2.0 ± 0.8 ** | 5.1 ± 1.1 ** | ||||||
| Azitromisin, 1000/500 mg od | 3.2 ± 1.7 * | 5.8 ± 1.1 | ||||||
| Levofloksasin, 500 mg od | ≤ 1.7 ** | ≤ 1.7 ** | ||||||
| Bir AMX / CA, amoksisilin-klavulanat; günde iki kez teklifi; tid., günde üç defa; OD, günde bir kez. | ||||||||
| b algılama sınırı <1.7 idi; * Kontrolden önemli ölçüde farklı (p ≤ 0.05); ** Kontrolünden önemli ölçüde farklı (p ≤ 0.01); NT, test değil. | ||||||||
| C koloni 16001S iki ayrı deneylerde test edilmiştir. | ||||||||
| D Amoksisilin-klavulanat 500/125 mg (4: 1) ile günde H. influenzae türlerine karşı test edilmemiştir üç kez. | ||||||||
Tablo 2: Farklı Amoksisilin / klavulanat doz rejimleri için Recreated İnsan Plazma Pozlama Profilleri etkinliği. Bu modeli kullanarak S. pneumoniae veya H. influenzae izolatları ile akciğer enfekte immünkompetan sıçanlarda oluşturulan veriler göstermiştir ki amoksisilin-klavulanat geliştirilmiş formülasyonu (2Günde iki kez 000/125 mg), in vitro duyarlılığı 19, yükseltilmiş izolatlarına karşı, standart doz rejimleri daha etkili olmuştur. Bu tablo adapte izniyle olmuştur, Mikrobiyoloji, [Antimikrobiyal Ajanlar ve Kemoterapi, hacim 49, 2005, sayfalar 908-915] Copyright © American Society 19.
Discussion
Bu enfeksiyon modeli yeniden optimum başarısı için, aşağıdaki ek öneriler dikkate alınmalıdır. Bir çalışmada, önceki kullanım in vivo - 3 kez, yeni izolat ölümcüllüğü 2 pasaj ile arttırılabilir. Dondurulmuş bakteriyel stokları her zaman orijinalinden mümkün olduğunca az geçişleri ile türevi kaynak vivo birincil hazırlanan ve tekrar oluşması göreceli veya çözülmüş stok yeniden önerilmez edilmelidir. log fazı büyüme kültürleri pnömonili hastalarda kurtarıldı son klinik izolat kullanılarak ve / veya hazırlanması da enfeksiyon kurulması artırmak için yardımcı olabilir. Agar (örneğin 2 ml tuzlu su süspansiyonu 8 ml agar eklendi) içine bir beş kat seyreltme yerine kullanılabilir (bakteriyel inokulum geliştirmek için on kat ve aşı hacmi ayarlanabilir hayvanın büyüklüğüne göre olabilir, örneğin 200 uL / hayvan genellikle) 250 g farelere aşılanır. içine tuzlu bakteri süspansiyonu eklemeden önceAgar (yani Adım 2.3 at) bakteriyel yoğunluk tahmin ya da görsel denetim, MacFarland standartları veya optik yoğunluk ölçümleri ile tahmin edilebilir. Her in vivo deneyler yapılması önce izole in vitro büyüme özelliklerine aşina olmak için yararlıdır. büyüme ve işlemedeki Tutarlılık herhangi bir izolat için bakteri yoğunluğunun en doğru yansıtan bir parametredir. Bu tür ortam ve doku homojenleştiriciler alternatif olarak, tarif edilen farklı standart mikrobiyolojik yöntemler, inokulum hazırlanması ve enfekte dokulardan bakteri sayımı için uygun şekilde kullanılabilmektedir.
Oldukça hazırlanması ya da Deneyden bir gün önce, agar eriyik 50 ° C olarak ayarlanmış ayrı bir su banyosu içinde bir gece boyunca depolamak için tavsiye edilir. Bu süreci basitleştirmek ve ağar enfeksiyonu sırasında çok sıcak olan karşı korunmaya yardımcı olur. 41 bir ısı - 42 ° C maintai arasında iyi bir denge eldening kısa süreli bakteri hayatta kalmak için çok sıcak olmadan sıvı halde ağar. besleyici agar Olası bir alternatif olarak, asil agar başarılı bazı deneylerde kullanılmıştır. Agar inokulum biri tüp bütün deney için genellikle yeterlidir (ve tavsiye edilir), ancak birden fazla tüpler hayvanların çok sayıda enfekte için hazırlanmış olabilir (örneğin 60'dan fazla) ya da enfekte süreci uzun 30 daha uzun sürer zaman - 45 dakika ise birden çok aşı borular gerekli olduğu gibi agar her tüpe salin bakteri süspansiyonu ekleyin gerekmektedir. Bu, bakterinin yaşamda kalması ve / veya spor aşılamadan önce yüksek bir sıcaklıkta büyük ölçüde maruz kaldıklarında etkilenecek riskini azaltır. Kullanarak birden aşı tüpleri ek hayvan randomizasyon girişimler gerekebilir dikkat edilmelidir. Mümkün olduğunda, aynı inokulum hazırlanması tüm hayvanları enfekte. Te ile yeterlik mevcut seviyesi deneyler boyutunu uyarlamak için tavsiye edilirchnique.
Yetenekli bir bilim adamı entübe ve en az 30 saniye bir hayvanı aşılamak ve 5 kadar aşılamak olabilir - (ağar inokulum dolu bir şırınga ile yani) toplu iş başına 6 hayvan. tekniği öğrenme olanlar için, hız katılaşmaya başlayacaktır agar kadar önemlidir; Ancak, aşı doğru şekilde yerleştirilmiş daha önemlidir. parti başına 1 veya 2 hayvan başlayın ve teknik daha tanıdık hale geldikçe artar. Hayvanlar entübasyon sırasında nefes almaya devam; 3 dakika - dolayısıyla aşılama için zaman penceresi hayvan yaklaşık 2 olmalıdır izofluran, kurtarır ne kadar çabuk bağlıdır. sürecinde uyandırmak Hayvanlar yeniden anestezi ve ikinci kez denedi, ama o kadar tekrar tekrar yapmak için tavsiye edilmez edilebilir. yeterlik ulaşıldıktan sonra ilk denemede başarılı aşılama hayvanların neredeyse% 100 beklenmektedir. ilk fareler kullanılarak tekniğini öğrenmesi daha kolay olduğunu unutmayın; fareler daha narin ve daha küçük çokls hızla manipüle değilse katılaşmış agar ile tıkanmaya daha yatkındır. Ön ısınma şırıngalar, tüpler ve tuzlu yanı sıra, düşük ayarda bir ısıtma yastığı olarak, bir ılık (sıcak değil) yüzeyinde entübasyon cihazı tutmak gibi, agar katılaşma önlemeye yardımcı olabilir. tekniği öğrenirken, bir koyu renkli boya (örneğin konsantre metilen mavisi gibi) yerine agar bakteri süspansiyonu kullanılarak inokulum doğru yerleştirilmesi uygulama da yararlıdır. hemen boyanın aşılamayı takiben (hayvan anestezi ve ötenazi arasındaki kurtarmak için izin verilmez) hayvan açıklanan prosedür gerçekleştirmek, ama euthanize. boya konulmuş yeri belirlemek ve buna göre teknik ayarlamak için teşrih.
Bu modelde birincil son nokta enfekte akciğerlerden CFU olduğunu. Survival bakteri yükünün iyi bir gösterge değildir ve tavsiye edilen son nokta değildir. Bu predicte gibi grup başına 6 hayvan - etkinlik çalışmaları için, ileri n 5D en az% 90 güç ≥1 günlüğünü grupları arasında 10 CFU farkları saptamak için. Hayvanlar kafes arkadaşları arada kalması, ya da gerçek bir raslantısal hale getirme işlemi takip edilebilir şekilde gruplarda enfekte olabilir. gruplar kafes tarafından atanır ise, gruplar son enfekte sonu çalışmada büyüme kontrolleri ile rastgele sırayla enfekte gerektiğini unutmayın (yani bakteri hayatta kalma onaylamak için / spor yüksek bir sıcaklığa maruz sürenin uzunluğu etkilenmedi su banyosunda). Resim veri sansürleme yöntemleri gerekli olması halinde, ve hiçbiri yanlış aşılanmış çalışmanın başlangıcında (önceki herhangi bir tedavi başlanmadan) açık olan herhangi bir hayvan hemen çıkarılması dışında önerilmektedir. Çalışmanın sonunda önce ötenazi hayvanların örneklenmesi gerekir ve sonuç dışlanma için geçerli bir neden prospektif tespit edilmiştir sürece veri kümesi içinde (enfeksiyon veya tedavi ilgisiz yani bir olay) dahil. İlaç ertelenmiş olabilir affvb bazı örnekler ve tüm in vivo enfeksiyon modeller arasında önemli bir husustur. Bir bileşiğin ötenazi sırasında sık sık yakın verilen uzun bir yarı-ömre sahip olup, bu (bakteriyel numaralandırma işlemi sırasında bakteriler, ex vivo öldürme Seyreltme ve kaplama devam etmek için yeterince yüksek bir konsantrasyonda, doku homojenatı içinde mevcut olabilir gece boyunca inkübasyon sırasında agar plakaları üzerinde numune ya da). Bu, aktive edilmiş mangal kömürü ve / veya homojenleştirmeden önce numuneye ilave edilebilir bakteriyel hücrelere zarar vermeden aktif molekül bozan bir katkı önlemek. Diğer yöntemler (süpernatan içinde kalması gerekir) aktif bileşiğin büyük bir kısmı bertaraf örnekleri santrifüj ve farklı seyreltme kullanılarak ve yeterince olmayan bir inhibitör konsantrasyonu, aktif bileşiğin seyreltilmesi için şemaları kaplama içerir.
I, Şekil 2'de gösterilen örnekler ile, bu model başarılı bir şekilde gösterdiği gibidiğer bir model (örneğin, H. influenzae) yetişmez da dahil olmak üzere geniş bir organizma aralığına sahip kemirgenlerde akciğer enfeksiyonları nduces. Bu enfeksiyonlar deneyler belirli bir izolatın model yetmezliği ve / veya zayıf performans nedeniyle tekrarlanması gerekir olasılığını azaltarak, tutarlı ve tekrarlanabilir. hayvanlar immün yetmezliği olmasına rağmen, hepsi de eğer hızla enfeksiyonu gidermek mümkün değildir. Bu, pek çok izolatlar tekrarlanan enjeksiyonları nötropeni korumak için gerek kalmadan en az 96 saat boyunca geçerli bir enfeksiyon iddia ettiği gibi, çalışma uzunluğu artan esneklik sağlar. Bağışıklığı hayvanlarda antibakteriyel etkinliği okuyan potansiyel yararı, daha önce 21 20 not edilmiştir ve bazı bileşiklerin (örneğin oksazolidinon) için, nötropenik olmayan kemirgenler veri daha doğru olanlar hale nötropeni ile karşılaştırıldığında insan maruziyet hedeflerini tahmin edebilir, o kanıtlar vardır 5. t çok amaçlı yararKarşılaştırma için, kurşun optimizasyon çalışmalarını 16, 17 desteklemek için bu model ile oluşturulan olmuştur yayınlanmış ve yayınlanmamış büyük bir veri toplama 22-24 parçası o modeli Şekil 3 ve 4 ve Tablo 1 ve 2. Bu çalışmalarda gösterilmiştir olan yukarıda açıklandığı gibi, önerilen insan dozunun onayı 19 25-29 ve PK / PD karakterizasyonu 18 için, 30-32 görüntü albüm bu model başlangıçta burun inhalasyon yöntemi ile karşılaştırıldığında yapmak daha karmaşık rejimleri, pek çok faydaları vardır. uygulama ve rutin kullanımı ile teknikler gerçekleştirmek için basit hale gelmelidir.
Bu başlangıçta bakteri yükü genellikle diğer akciğer enfeksiyonu modellerinde hedef daha düşük olduğu bazı çalışmalarda olabileceğini belirtti. Bu durum, özellikle, farelerde agar gerekli seyreltme ve küçük meydan hacmi büyük ölçüde bağlıdır. Bununla birlikte, aynı zamanda not edilmelidirBu bakteri üremesi ilk yük nispeten düşük olduğu hatta tüm olgularda görüldü. Hedef başlangıç bakteri yükü 6 ağır pnömoni 33, insan hastalarda tahmini yoğunluklarına tekabül 10 CFU / akciğer (6.8 günlük ortalama akciğer ağırlığı göre farelerde doku 10 CFU / g olarak 7.3) günlük 6.5. Daha yüksek bir başlangıç yükü ilave bakteriyel inokulum konsantre ya da ek bakteri gelişimini sağlamak için bileşiğin tatbikat başlamasını geciktirdiğini ile elde edilebilir; Ancak, çok fazla zorluk yük artan bağımsız duyarlılık tüm antibakteriyel tedavilere dirençli anormal şiddetli ve akut hastalıkları (en az 24 saat, yani ölümü) sebep olabilir. aşı başlangıçta hayvanın sol akciğer içine tercihen yerleştirilir rağmen, enfeksiyon genellikle her iki akciğerde yayılır. Progresif akciğer hastalığı, diğer organlara bakterilerin yayılması ve nihai morbidite genellikle Observ olduğunuS. pneumoniae, K. pneumoniae ve P. aeruginosa ile Ed. Ilgi, H. influenzae ve A. baumannii enfeksiyonları genellikle daha ihtiva ve nadiren öngörülen bakteriyel aşı olarak ölüme yol.
Bu modelde elde edilen etkinlik sonuçları, in vitro duyarlılık profilleri yanı sıra tanımlanan PK / PD hedefleri ile de korelasyon var. Bakteriyel yük azalma rutin test edilen ajana duyarlı kabul izolatları için gözlenir bu olarak dayanıklı sergi taban 16, 17, 19, 24-29, yukarıda herhangi bir değişiklik ya da bakteri üremesi sırasında. İki kinolon ve bu modeli 32 kullanarak bir makrolid değerlendiren sıçanlarda yapılan çalışmalar için gerekli olan PK / PD hedefi ile, nötropenik farelerde belirlenen hedef ve daha da önemlisi korelasyon başlangıca kıyasla S. pneumoniae 10 azalma 1-log göstermiştir toplum kökenli bakteriyel Pneum klinik hedeflerOnia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, yeni bir mekanizma, antibiyotik, birden fazla S. pneumoniae karşı test ve nötropenik Uyluk modelinde 1-log 10 azaltılması için gerekli olandan olarak akciğer enfeksiyonu modeli 31 içinde 1 log-10 azaltılması için de benzer bir PK / PD hedef gerekli 36 akciğer penetrasyonu dikkate alındı (dosyadaki verileri). Akciğer penetrasyon 37 kabul edildi Benzer şekilde, P. aeruginosa 'ya karşı GSK2251052 farelerde tespit PK / PD hedefleri, 38 staz, 1- ve akciğer modeli 30 ve nötropenik Uyluk enfeksiyon modeli arasında CFU 10 azalma 2-günlük için tutarlı . zayıftı burun aşılama kullanarak nötropenik akciğer enfeksiyonu modeli ile korelasyon; Bununla birlikte, GSK2251052 Bu çalışmada 38 statik bir tepki daha üretmemiştir. Bu 6 günlük ile karşılaştırıldığında 8 günlük 10 CFU / fare oldu yüksek bakteriyel inokulum, atfedilebilir
Bu bağışıklığı pnömoni modelinin bazı sınırlamalar vardır. Birincisi, yüksek bakteriyel aşı genellikle çok şiddetli bir enfeksiyon gibi çalışmalar sonuç için gerekli çünkü kendiliğinden direniş ortaya çıkması değerlendirmek için çok uygun değildir. Girişimleri takiben (dosyadaki verileri) önceden varolan toksinler kaldırmak için aşı iyice yıkanması rağmen (en az 24 saat içinde can çekişen olma yani hayvanlar) bakteriyel 7 veya 8 günlük, hızlı morbidite görülmüştür başlangıçta 10 CFU yükünü elde etmek. ODaha büyük kemirgenler kullanarak bu sorunu aşmak mümkün olabilir. Sıçanlar, özellikle de daha ağır sıçanları (> 250 g), daha iyi bir fare ile karşılaştırıldığında daha yüksek inokulum tolere görünmektedir ve çalışmalar bu tür için uygun olabilir. patojen etkileşimlerinde: İkinci bir kısıtlama bir enfeksiyon-arttırıcı olarak agar kullanımı bazı ev sahibi değerlendirilmesi için bir model kullanılarak engel olmasıdır. Hastalığın tam akciğer içinde kurulana kadar agar korumalı bir odak noktası temin ettiğine inanılmaktadır. Oldukça bu sorunu aşabilmesi için agar daha tuzlu suda aşının teslim etmek mümkündür; Bununla birlikte, bu sadece bazı izolatlar enfeksiyonu üretecek unutulmamalıdır. Üçüncüsü, teknik uzman olmak için gerekli bir öğrenme eğrisi vardır. prosedür, özellikle farelerde, hassas olabilir. Yanlışlıkla yemek borusuna metal kanül yerleştirmek kolay ve aşırı güç yemek borusu ya da trakea ya delik yol açabilir. inokulum Dikkatli yerleştirme aynı zamandaGerekli veya hayvanların ya yeterince enfekte kurtarmak ya da olmayabilir. sorunsuz ve doğru, ancak, sabır ve azim ile, bir derece yetkin hale gelebilir ve hızlı bir şekilde teknik gerçekleştirin.
, Nötropeni için şartının kaldırılması sağlamlık ve tekrarlanabilirlik artan araştırmacılar daha patojenleri ve izolatları çalışma izin, deneysel tasarım esnekliği artırmak ve pnömoni için farmakodinamik karakterize etmek zorlu bir enfeksiyon sağlayarak, bu bağışıklığı akciğer enfeksiyonu modeli antibiyotik keşif önemli değer katan topluluk. Ek araştırmacılar tarafından bu modelin artan kullanımı daha yaygın kabul görmesi ve uygun yorumlanması için destekleyici bilgiler sağlamaya devam etmek için gerekli kıyaslama sağlamak yardımcı olacaktır.
Disclosures
Yazarlar, tüm şirket içinde stok GlaxoSmithKline İlaç çalışanları ve kendi hisselerini ödenir.
Acknowledgments
JH kabul ve ilk bize bu modeli öğretmek için akıl hocası, arkadaşı ve eski yöneticisi Valerie Berry teşekkür eder; ve bize temellerini öğretti ve antibakteriyel PK / PD alanına bağlılığımızı ilham Gary WOODNUTT. Tüm yazarlar bizim bilim verdiği destek ve takdir David Payne teşekkür etmek istiyorum. Biz bu yöntemleri, özellikle Pete DeMarsh Rob Straub, Roni Sayfası ve Nerissa Simon kullanılarak oluşturulan verilerin vücuda katkıda in vivo mikrobiyoloji meslektaşları bizim eski kabul etmek istiyorum. Son olarak, bizim teşekkürler özellikle biz talep tüm MİK (Lynn McCloskey, Josh Batı ve Sharon Min) sağlamak için, onların yardım için in vitro mikrobiyoloji meslektaşları gidin; ve uzman tavsiyesi ve desteği (Linda Miller, Nicole Scangarella-Umman ve Deborah Butler) sağlayan klinik mikrobiyoloji ekibi için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
| Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
| BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
| BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
| Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
| 0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
| Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
| 30 mL free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100 mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
| Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
| 90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
| 1 mL TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| Animal feeding needle - straight 20 x 3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
| Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand - Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
| 75 TN 5.0 µL syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
| Pyrex tube, culture 25x150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
| 70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
| Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
| Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
| Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
| Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |
References
- Eagle, H., Fleischman, R., Levy, M. Continuous' vs. 'discontinuous' therapy with penicillin: the effect of the interval between injections on therapeutic efficacy. N Engl J Med. 248 (12), 481-488 (1953).
- Eagle, H., Fleischman, R., Musselman, A. D. The bactericidal action of penicillin in vivo: the participation of the host, and the slow recovery of the surviving organisms. Ann Intern Med. 33 (3), 544-571 (1950).
- Vogelman, B., et al. Correlation of antimicrobial pharmacokinetic parameters with therapeutic efficacy in an animal model. J Infect Dis. 158 (4), 831-847 (1988).
- Craig, W. A. Pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters: rationale for antibacterial dosing of mice and men. Clin Infect Dis. 26 (1), 1-12 (1998).
- Ambrose, P. G., et al. Pharmacokinetics-pharmacodynamics of antimicrobial therapy: it's not just for mice anymore. Clin Infect Dis. 44 (1), 79-86 (2007).
- Ambrose, P. G., Bhavnani, S. M., Owens, R. C. Clinical pharmacodynamics of quinolones. Infect Dis Clin North Am. 17 (3), 529-543 (2003).
- Andes, D. Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of antimicrobials in the therapy of respiratory tract infections. Curr Opin Inf Dis. 14 (2), 165-172 (2001).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (3), L387-L398 (2008).
- Antibiotics in laboratory medicine, 5th edition. Chapter 15: Evaluation of antimicrobials in experimental animal infections. Lorian, V. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. (2005).
- McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiol Rev. 37 (2), 130-155 (2013).
- Nuermberger, E. Murine models of pneumococcal pneumonia and their applicability to the study of tissue-directed antimicrobials. Pharmacotherapy. 25 (12 Pt 2), 134S-139S (2005).
- Mehrad, B., Standiford, T. J. Use of animal models in the study of inflammatory mediators of pneumonia. ILAR J. 40 (4), 167-174 (1999).
- De Simone, M., et al. Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Smith, G. A simple non-surgical method of intrabronchial instillation for the establishment of respiratory infections in the rat. Lab Anim. 25 (1), 46-49 (1991).
- Berry, V., Ferreira-Cornwell, M. C., Singley, C., Woodnutt, G. Development of experimental murine infections caused by H. influenzae and H. parainfluenzae. Clin Microbiol Infect. 7 (S1), 322 (2001).
- Miles, T. J., et al. Novel cyclohexyl-amides as potent antibacterials targeting bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 21 (24), 7483-7488 (2011).
- Miles, T. J., et al. Novel tricyclics (e.g. GSK945237) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 26 (10), 2464-2469 (2016).
- Hoover, J., et al. Pharmacokinetics/pharmacodynamics of peptide deformylase inhibitor GSK1322322 against Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Staphylococcus aureus in rodent models of infection. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), 180-189 (2016).
- Berry, V., Hoover, J., Singley, C., Woodnutt, G. Comparative bacteriological efficacy of pharmacokinetically enhanced amoxicillin-clavulanate against Streptococcus pneumoniae with elevated amoxicillin MICs and Haemophilus influenzae. Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 908-915 (2005).
- Czock, D., Markert, C., Hartman, B., Keller, F. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of antimicrobial drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5 (5), 475-487 (2009).
- Drusano, G. L., Fregeau, C., Liu, W., Brown, D. L., Louie, A. Impact of burden on granulocyte clearance of bacteria in a mouse thigh infection model. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4368-4372 (2010).
- Miles, T. J., et al. Novel hydroxyl tricyclics (e.g. GSK966587) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases. Bioorg Med Chem Lett. 23 (19), 5437-5441 (2013).
- Hunt, E. Pleuromutilin antibiotics. Drugs Future. 25 (11), 1163-1168 (2000).
- Jin, Q., et al. Novel LpxC inhibitors with broad-spectrum gram-negative activity. Proceedings of the 44th National Organic Chemistry Symposium.. College Park, MD, , Abstract T-31 (2015).
- Singley, C., Page, R., Hoover, J., Elefante, P., DeMarsh, P. Efficacy of a LRS inhibitor GSK2251052 against Enterobacteriaceae isolates using a computer-controlled infusion system to recreate human PK profiles in rats. Clin Microbiol Infect. 17 (S4), S429-S430 (2011).
- Berry, V., et al. Comparative in vivo activity of gemifloxacin in a rat model of respiratory tract infection. J Antimicrob Chemother. 45 (S1), 79-85 (2000).
- Tsuji, M., et al. S-649266, a Novel Siderophore Cephalosporin: Efficacy against Klebsiella pneumoniae producing NDM-1 or KPC in rat lung infection model with recreated humanized exposure profile of 2 gram dose with 1 hour and 3 hours infusion. Open Forum Infect Dis. 1 (S1), S106-S107 (2014).
- Tsuji, M., et al. Use of Iron Depleted Mueller Hinton Broth (IDMHB) for microdilution testing of S-649266, a novel siderophore cephalosporin. 26th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Amsterdam, Netherlands, , Abstract P0808 (2016).
- Singley, C., Hoover, J., DeMarsh, P. J., Elefante, P., Zalacain, M. Efficacy of PDF Inhibitor GSK1322322 Against Abscess Infections Caused by MRSA Using a Computer-Controlled Infusion System to Recreate Human PK Profiles in Rats. Proceedings of the 60th Annual Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Boston, MA, , Abstract F1-2114 (2010).
- Hoover, J., Mininger, C., Rittenhouse, S. GSK2251052, a novel LeuRS inhibitor, is effective against multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa in a mouse pneumonia model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract B-1308 (2012).
- Hoover, J., Mininger, C., Novick, S., Rittenhouse, S. Efficacy of GSK2140944 against Streptococcus pneumoniae in a non-neutropenic mouse lung infection model. Proceedings of the 53rd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Denver, CO, , Abstract A-014 (2013).
- Hoover, J. L., et al. Selection of a lung infection model to predict efficacy in community-acquired pneumonia (CAP) caused by S. pneumoniae (SP). Proceedings of the 47th Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Chicago, Illinois, , Abstract A-17 (2007).
- Drusano, G. L., et al. Saturability of granulocyte kill of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of pneumonia. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2693-2695 (2011).
- Peric, M., Browne, F. A., Jacobs, M. R., Applebaum, P. C. Activity of nine oral agents against gram-positive and gram-negative bacteria encountered in community-acquired infections: use of pharmacokinetic/pharmacodynamic breakpoints in the comparative assessment of beta-lactam and macrolide antimicrobial agents. Clin Ther. 25 (1), 169-177 (2003).
- Calbo, E., Garau, J. Application of pharmacokinetics and pharmacodynamics to antimicrobial therapy of community-acquired respiratory tract infections. Respiration. 72 (6), 561-571 (2005).
- Bulik, C. C., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2140944 against Staphylococcus aureus and Streptococcus pneumoniae in a murine-thigh infection model. Proceedings of the 54th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Washington, DC, , Abstract A-680 (2014).
- Bulik, C. C., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli in a murine-thigh infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract A-1270 (2012).
- Andes, D. R., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli using data from a neutropenic murine-pneumonia infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract A-1271 (2012).
