Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En syngen musemodel af metastaserende renalcellecarcinom for Kvantitativ og Longitudinal Vurdering af Prækliniske Terapier

Published: April 12, 2017 doi: 10.3791/55080
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 4,5, 1,2,3
1Department of Urology, University of Minnesota, 2Masonic Cancer Center, University of Minnesota, 3Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, 4Department of Medical Microbiology, Immunology and Cell Biology, Southern Illinois University School of Medicine, 5Simmons Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

Gennemførelse af en orthotopisk model af renalcellekarcinom i immunokompetente mus giver investigator en klinisk relevant system, defineret ved tilstedeværelsen af ​​en primær nyretumor og lungemetastaser i det samme dyr. Dette system kan anvendes til præklinisk afprøve forskellige behandlinger in vivo.

Abstract

Renalcellecarcinom (RCC) påvirker> 60.000 mennesker i USA hvert år, og ~ 30% af RCC-patienter har flere metastaser på tidspunktet for diagnosen. Metastatisk RCC (mRCC) er uhelbredelig, med en median overlevelsestid på kun 18 måneder. Immun-baserede interventioner (fx interferon (IFN) og interleukin (IL) -2) inducere varig respons på en brøkdel af MRCC patienter og multikinasehæmmer hæmmere (f.eks sunitinib eller sorafenib) eller anti-VEGF-receptor monoklonale antistoffer (mAb) er stort set palliativ, som komplette remissioner er sjældne. Sådanne mangler ved de nuværende behandlinger af MRCC patienter giver rationalet for udviklingen af ​​hidtil ukendte behandlingsprotokoller. En nøglekomponent i præklinisk afprøvning af nye terapier til mRCC er en egnet dyremodel. Gavnlige funktioner, der rekapitulere den menneskelige tilstand indbefatter en primær nyretumor, renale tumormetastaser, og et intakt immunsystem til at undersøge enhver terapi-drevet immun effector reaktioner og dannelsen af ​​tumor-induceret immunosuppressive faktorer. Denne rapport beskriver en ortotopisk mRCC musemodel, der har alle disse funktioner. Beskriver vi en intrarenal implantationsteknik hjælp af musen renal adenocarcinom cellelinie Renca, efterfulgt af vurdering af tumorvækst i nyren (primær sted) og lungerne (metastatisk site).

Introduction

Nyrecellecancer (RCC) tegner sig for hovedparten af maligne nyre neoplasmer og omkring 3% af alle voksne maligniteter verdensplan 1, 2. På grund af manglende symptomer, fejldiagnoser og utilstrækkelige screening værktøjer til RCC, vil næsten 30% af patienterne præsentere med metastatisk RCC (mRCC) på tidspunktet for diagnosen, med yderligere 20-30% af patienterne udvikler sig til et metastatisk stadie 2. Disse sager resulterer i ~ 13.500 dødsfald årligt 1, 3. Selvom tidligere påvisning og behandling af primær RCC er forbedret, hastigheden for RCC dødsfald fortsætter med at stige, hvilket antyder, at metastatisk sygdom er i høj grad ansvarlig for mortalitet 3. Terapi udvikling for RCC har udviklet i løbet af det sidste årti med opdagelsen og gennemførelsen af ​​målrettede behandlinger og immunoterapi. Desværre, progressionsfri survival og samlet overlevelse af avancerede tilfælde er stadig et godt stykke under 2 år for de fleste patienter 4, 5, 6. Disse statistikker garanterer behovet for yderligere forskning i identifikation og udvikling af effektive behandlinger for RCC. For i tilstrækkelig grad fremme terapeutiske indgreb for mRCC, der først behov translationelt-relevante prækliniske modeller af sygdommen.

Udvikling af en relevant og konsekvent model til at rekapitulere den menneskelige tilstand af fremskreden RCC bør behandle flere vigtige spørgsmål: 1) er den model, anatomisk relevante; 2) Er tumoren fremskridt i lighed med den humane patologi; 3) Har metastaser opstår fra den primære tumor; og 4) Kan primær og metastatisk tumor progression overvåges over tid? Afhængigt af den type behandling, der undersøges, muse RCC tumorcellelinjer, humane RCC tumorcellelinjer og humant RCC patient-afledte xenogflåder kan anvendes i immunkompetente eller immundefekte mus. En vært med et intakt og funktionelt immunsystem er påkrævet for disse studier, der evaluerer nogle aspekter af immunterapi, der medfører anvendelse af den velbeskrevne Renca cellelinie afledt fra en spontan renal adenocarcinom Balb / c mus 7. De fleste undersøgelser injicere RENCA-celler subkutant (sc), som danner en let efter mål lokal tumor eller intravenøst (iv) i Balb / c-mus for at producere eksperimentelle lunge "metastaser" 8, 9, 10, 11, 12. Anvendelse af et sc-implanteret Renca tumor at modellere humant RCC har en række begrænsninger, herunder unøjagtig innervation af vaskulatur 13, forskelle i mikromiljø 14, 15, og en mangel på organer / tumor cellulære Communication 13, 16. Derudover har mange sc tumorer (især Renca) ikke metastaserer til distale organer, inhibering studiet af en begivenhed, som er en almindelig klinisk karakteristisk 17. At studere mRCC, kan RENCA-celler injiceres iv at etablere tumorbelastning i lungerne-primære placering metastaser i RCC patienter. Intravenøs injektion metode til at initiere metastatiske tumorer imidlertid ikke tillader undersøgelse af hvordan, hvornår eller hvorfor cellerne er migreret fra det primære organ (dvs. nyren) til fjernt sted. En model med både primær og metastatisk sygdom tydeligt i det samme dyr er afgørende for at studere progression og behandling af fremskreden sygdom, især i betragtning af at metastaser er typisk de årsag til dødelighed hos disse patienter.

Vores laboratorium har udviklet en musemodel af mRCC, der inkorporerer alle de funktioner, der er skitseret ovenfor. At etablere PRimary, ortotope tumorer, er RENCA-celler implanteres direkte ind i nyren af ​​dyret gennem den gennemskinnelige peritoneum. Et lille snit i venstre flanke muliggør visualisering af milten (som en milepæl) og den venstre nyre. Anvendelse af en lille nål, er Renca tumorceller injiceres direkte i nyren gennem peritoneum for orthotopisk implantation. Sammenlignet med andre fremgangsmåder til at implantere RENCA-celler under nyrekapslen 18 denne form for implantation muliggør en højere kapacitet, som det er temmelig ikke-invasiv, kræver ikke suturering, er af en lav smerte klasse, og er tidsbesparende, når praktiseres.

This velkarakteriserede model resulterer i reproducerbar primær tumorbelastning (~ 99% take rate) i det injicerede nyre samt metastatisk tumor belastning i lungerne. De væsentlige fordele ved denne model omfatter dens syngen natur, der giver mulighed for immunterapi undersøgelser; dens spontane metastaser, for at studere envanceret sygdom; og dens orthotopisk implantation, at modellere den anatomiske konsekvenser for sygdomsudvikling og behandling. Terapier rettet mod at målrette RCC vil få stor gavn af udnyttelsen af ​​denne model under præklinisk udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Følgende protokol beskriver en eksperimentel procedure til induktion og overvågning af vækst af eksperimentelle ortotope renale tumorer og eventuelle spontane metastaser. Alle de følgende procedurer er udført i overensstemmelse med de institutionelle politikker og godkendte procedurer for human brug af forsøgsdyr.

1. Vedligeholdelse af cellelinier

  1. Opretholde murine renal adenocarcinom cellelinie, Renca, i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), 1% penicillin-streptomycin og 1 mM af hver af ikke-essentielle aminosyrer, L-glutamin og natriumpyruvat (benævnt komplet RPMI). Kulturceller i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
    BEMÆRK: Som med enhver etableret cellelinie, anbefales det at bruge lav passage-nummer RENCA-celler til transfektion og efterfølgende implantation at minimere eventuelle fænotypiske eller genetiske ændringer, der kan opstå efter lang tids culture.
    1. Brug et transposonsystem at konstruere Renca celler stabilt udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) og ildflueluciferase.
      1. Ved hjælp af en kationisk liposom-baseret transfektionsreagens, co-transficere RENCA-celler med en transposase ekspressionsvektor (pPGK-SB11) og et transposon vektor, der koder for ekspressionen af ​​ildflue-luciferase, samt et fusionsgen, der koder for GFP og det zeocinresistensgenet både under transkriptionel kontrol af en tovejs-promotoren (pKT2 / LuBiG) 19.
      2. To dage senere, plade de transficerede celler ved en begrænsende fortynding og tillade cellerne at ekspandere i komplet RPMI suppleret med zeocin (300 ug / ml). Bekræfte GFP-ekspression i hver klon ved flowcytometri. Disse celler benævnes Renca-GL.
        BEMÆRK: Begrænsning-fortyndingskloning vil tillade de valgte celler, der skal afledt af en enkelt celle.
  2. At implantere RENCA-celler intrarenally, forberede RENCA-celler into en enkelt-cellesuspension ved 2 x 10 6 celler / ml i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
    1. Fjerne adhærerende RENCA-celler fra vævsdyrkningskolben 0,25% trypsin i HBSS. Efter ~ 5 minutter tilsættes komplet RPMI til kolben for at neutralisere trypsin og overføre cellerne til et centrifugerør til vask. Centrifuger cellerne ved 300 relative centrifugalkraft g (RCF xg) i 5 min ved 25 ° C.
    2. Supernatanten dekanteres, og cellerne resuspenderes i HBSS. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og justere lydstyrken med HBSS til opnåelse af 2 x 10 6 celler / ml.
    3. Trække cellerne i en 1-ml sprøjte udstyret med en 18-gauge nål for at forhindre forskydningsspænding på cellerne. Erstatte 18-gauge nål med en 28 gauge nål før injektionen af ​​tumorcellerne. En injektion af 0,1 ml leverer 2 x 10 5 celler i nyren.

2. Kirurgisk Område Forberedelse

  1. Forberede en steril kirurgiskområde i en biosikkerhed kabinet ved at placere en steril kirurgisk filmen over en varmepude. Samle alle forsyninger, herunder pincet, skalpel, saks, øjendråber, 5% povidon-iod antiseptisk og sterilt gaze. Autoklaver alle instrumenter før brug.
  2. Udfør operationen ved hjælp af en aseptisk spids teknik. Resteriliseres instrumenter mellem dyr med en vulst sterilisator. Bær sterile handsker, kittel og en ansigtsmaske.

3. Dyrepræparation

  1. Anesthetize musene med ketamin / xylazin (87,5 mg / kg og 12,5 mg / kg, ip) ifølge institutionelle retningslinier. Bestemme anæstetisk dybde ved at udføre en tå-pinch.
  2. Når dyret betragtes som ikke-responsiv, forberede injektionsstedet (fx venstre flanke) på Balb / c-mus ved plukning (med fingrene) eller barbering (ved hjælp trimming) pelsen.
  3. Flytte musene fra kirurgi prep område (fx huset bur) på det kirurgiske område og anvende dyrlæge salve tiløjne til at forebygge tørhed. Liberalt svaber den forberedte incisionsstedet med 5% povidon-iod antiseptisk.
  4. Injicere bupivacainhydrochlorid (0,1 ml af en 2,5 mg / ml opløsning, sc) i det område, hvor snittet sker som en præoperativ analgesi.
  5. Foretage en enkelt snit (~ 1,0 - 1,5 cm) på den venstre flanke af dyret under anvendelse af en steril skalpel eller saks, omhyggeligt for ikke at penetrere peritoneum. Adskil dermis fra peritoneum med steril saks. Dup incisionsstedet med steril bomuldsgaze til fjernelse af eventuelt blod.
  6. Hold musen med begge hænder, med venstre hånd til at holde hovedet og højre hånd for at støtte flanken.
  7. Identificere milten gennem bughinden og, med en finger på højre hånd, palperer musen fra undersiden; nyren skulle nu være synligt gennem bughinden. Hold godt fat i dyret til at give spænding på tværs af bughinden og nyre.
  8. Har en anden person, injicere tumor ceLLS (fremstillet i afsnit 1.2.) gennem den intakte peritoneum ind til centrum af nyren under anvendelse af en 1-ml sprøjte udstyret med en 28-gauge nål. Levere langsomt 0,1 ml (2 x 10 5) af celler. Når cellerne injiceres, holde nålen på plads i 5 - 10 s for at reducere tilbagestrømning af celler. Det er vigtigt at bemærke, at det er nødvendigt for ekstrem forsigtighed i dette trin, som den person injicere cellerne vil bringe nålen ind tæt på fingrene på den person, holde musen.
  9. Fjern nålen og lukke snittet med et tyndt lag af cyanoacrylat vævsklæber.
  10. Sende dyret tilbage i en ren bur med en steril papirserviet. Lad dyrene at komme sig på en varmepude. Efterlad ikke dyr uden opsyn i restitutionsperioden. Må ikke vende tilbage dyrene til standard boligforhold, indtil de er opretstående og sternale. Følg institutionelle retningslinjer på alle procedurer ved hjælp af forsøgsdyr.

4. Bioselvlysende Imaging

  1. Overvåg tumorvækst ved bioluminescerende billeddannelse.
    BEMÆRK: kan opnås proceduremæssige detaljer til udførelse bioluminescerende billeddannelse fra Lim et al. 20 Luciferasesignalet kan detekteres så tidligt som 24 timer efter tumorcelleimplantation. Da der ikke er eksternt synlig tumor i denne model, er det vigtigt at overvåge tumorvækst periodisk. Afhængigt af designet eksperiment, kan ortotopisk tumorvækst forløbe i varierende tidsrum. En fordel ved anvendelse af luciferase-udtrykkende RENCA-celler er, at der gentagne gange kan overvåges tumorvækst i det samme dyr med regelmæssige intervaller under hele eksperimentet, og en specifik forespørgsel af tumorbærende og tumorfrie organer kan gøres på en defineret slutpunkt.
    1. Injicere luciferin (0,1 ml af en 15 mg / ml opløsning i sterilt PBS) ip og lad det cirkulere i 10 minutter før placere musen i bioluminescens imaging system. Placer mo bruge med dens dorsale side op, valset lidt på siden, for at få den injicerede nyre opad.
    2. Måle tumorbyrden i lysphotoner udledes pr sekund (fotonflux) inden for et defineret område af interesse (ROI) ved hjælp af billedanalyse-software.
  2. Kvantificering af tumorbelastning i individuelle organer.
    BEMÆRK: Kvantificering kan udføres på definerede tidspunkter i de enkelte organer efter deres fjernelse fra aflivede mus.
    1. Injicere musene med luciferin, som i trin 4.1.
    2. Efter 10 min aflive musene under anvendelse af en godkendt procedure.
    3. Dissekere ud organerne af interesse (f.eks nyrer og lunger; se afsnit 5 nedenfor). Overføre vævet til 35 x 10 mm petriskåle og placere dem i bioluminescens imaging system.
    4. Måle tumorbyrden i lysphotoner udledes pr sekund (fotonflux) inden for et defineret roi anvendelse af billedanalyse-software.
e_title "> 5. Organ Harvest

  1. Ved en defineret slutpunkt for den enkelte eksperiment aflive tumorbærende mus ifølge foretrukne institutionelle retningslinier (fx CO2, cervikal dislokation, anæstesi overdosis). Men undgå at vride halsen om lunger skal indsamles efter tusch inflation.
  2. Udføre en grov vurdering af primær renal tumorvækst i den injicerede nyre ved at måle den våde organ vægt.
    1. At bestemme tumormassen (ig), isolere 21 og vejer tumorbærende nyre og den kontralaterale nyre fra samme mus, hvor forskellen i nyrevægt definerer tumormassen. dissekere forsigtigt væk enhver uvedkommende bindevæv fra de udskårne nyrer før måling deres vægte.
  3. Vurdere graden af ​​tumormetastase til lungerne ved oppustning lungerne med tusch før udskæring og straks fastsættelse lungerne i Fekete opløsninglass = "xref"> 22. kan derefter udføres Manuel beregning af metastatiske læsioner på lungerne overflade.
    1. Lav en midterlinjen snit med en saks, der starter ved midten af ​​maven, gennem brystkassen, og op gennem halsen / spytkirtler. Fjern forsigtigt brystkassen med en saks og pincet, uden at kompromittere lungevævet.
    2. Blotlægge trachea ved at fjerne bindevævet.
    3. Forberede en 3 ml sprøjte med en 18-gauge nål fyldt med 10% tusch opløsning i HBSS.
    4. Ved hjælp af pincet, omhyggeligt tråd en silke sutur under luftrøret. Dette vil blive brugt til at binde off luftrøret engang oppustet.
    5. Sæt forsigtigt nålen ned i luftrøret og træd langsomt sprøjten til at puste lungerne med tusch løsning. Ca. 1 - 1,5 ml i Indien blæk løsning vil fuldt ud puste lungerne.
    6. Klem luftrøret lukket ved at binde flere knuder, med suturen under nålen til at inhibere tilbagestrømning af blækket.
    7. afte nålen og omhyggeligt skåret væk bindevævet for at fjerne de oppustede lunger.
    8. I stinkskab, placere lungerne i en 15-ml konisk rør indeholdende 5 ml Fekete opløsning (35 ml af 95% EtOH, 15 ml dH2O, 5 ml formaldehyd og 2,5 ml iseddikesyre i en 100 ml glasflaske) 23.
    9. Tillad lungerne at fastsætte / affarvning i 24 - 48 timer ved stuetemperatur før manuelt tælle de affarvet tumornoduler.
    10. Fjern de intakte lunger efter affarvning og omhyggeligt dissekere de faste lungerne ved lap i en 35 x 10 mm petriskål. Tæl antallet af tumorknuder (hvide knuder) på hver lap under et dissektionsmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den vellykkede implantation af RENCA-celler vil resultere i tumorudvikling i nyren og metastase til lungerne af musene. Efter udskæring af tumorbærende og de kontralaterale nyrer blev våde væv vægte (g) målt for at påvise tumorbyrden baseret på forøget vægt (figur 1). RENCA-tumorer kan identificeres ved immunhistokemi gennem cytokeratin 8 og 18-farvning (figur 2). For langsgående undersøgelser blev en luciferase-udtrykkende Renca cellelinie implanteres. Bioluminescerende billeddannelse blev udført ved anvendelse af en in vivo imaging system (IVIS) at spore tumorbyrde og respons på behandling over tid (figur 3A). Metastase til lungerne blev bekræftet ved bioluminescerende billeddannelse (figur 3B) og tusch lungeoppustning (figur 3C).

s / ftp_upload / 55.080 / 55080fig1.jpg"/>
Figur 1. Ortotopisk implantation af Renca tumorceller danner en stor nyremasse. Renca-GL-celler (2 x 10 5 i 0,1 ml) blev injiceret intrarenally, og summen af de udskårne tumorbærende nyrer og tumor-fri kontralaterale nyrer i gram (+ SEM) blev bestemt på dag 24. n = 15 tumoreller frie og tumor-bærende nyrer. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 2
Figur 2. Immunfluorescerende mikroskopisk billede af tumor-fri kontralaterale og tumorbærende nyrer. Renca-GL-celler (2 x 10 5 i 0,1 ml) blev injiceret intrarenally, og tumor-bærende og tumorfrie nyrer blev høstet på dag 12. Nyrerne blev lynfrosset og bearbejdet til immunofluorescence billeddannelse til at visualisere placeringen af ​​kollagen, cytokeratin 8 og 18, og CD31. 10x billeder blev taget og syet sammen for at se hele tumorbærende nyre. Skalapanelerne = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 3
Figur 3. Ortotopisk implantation af Renca tumorceller fører til spontane lungemetastaser. A. Renca-GL-celler (2 x 10 5 i 0,1 ml) blev injiceret intrarenally i Balb / c-mus. Bioluminiscerende billeder blev taget på de angivne dage. B. På dag 23 blev lungerne fra tumor-fri og tumor-bærende mus udskåret, og bioluminiscerende billeder blev taget. C. parallelle sæt af mus på dag 23 havde deres lunger oppustet med tusch til at visualisere lunge tumor knuder.Skalapanelerne = 1 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi præsenterer en protokol for en ortotopisk RCC musemodel. Implantation af muse renale adenocarcinom tumorceller i musen nyre tilvejebringer en klinisk relevant model for mRCC. Denne model resulterer i en primær tumor i nyren og fjernmetastaser i lungerne, som begge er kendetegnende for fremskreden RCC. Beskrivelsen er præsenteret heri er specifik for Renca cellelinien i immunkompetente Balb / c-mus. Under anvendelse af denne orthotopisk model har vi vist, at Renca tumorer reagerer på immunterapi, hvilket viser anvendeligheden af denne model til terapeutisk afprøvning 17, 24, 25, 26, 27. Evnen til at anvende en syngen tumorcellelinie til implantation tilvejebringer fordelen af ​​at studere tumorudvikling i en immunologisk intakt dyr. Den syngen, ortotopisk, og klinisk relevant characteristics af dette system giver en overlegen model, der giver mulighed for afprøvning af behandlinger i en relevant præklinisk model. Dette kan ikke replikeres når tumorerne implanteres subkutant. Det er vigtigt at nævne, at en sådan modellering systemet ikke er begrænset til at evaluere anti-tumor immunrespons eller forskellige immunterapeutiske metoder til behandling RCC. Det ville være muligt at anvende humane tumorceller implanteret intrarenally i immundefekte mus, afhængigt af typen af ​​eksperimenter gennemføres. Tilgængeligheden af etablerede RCC-cellelinier, som kan dyrkes in vitro forbedrer reproducerbarheden af dette in vivo ortotopisk model, som alle dyr kan implanteres med et lige antal tumorceller på samme tid. Endvidere kan tumorcellerne manipuleres in vitro inden intrarenal implantation med muligheder for at styre, hvordan cellerne vokser og / eller reagere på miljømæssige signaler. En begrænsning med dette (og de fleste) implantabel tumormodeller er, at de omgå de tidlige begivenheder er ansvarlige for tumordannelse, en fordel, der gives ved anvendelse af en musemodel gensplejset til dannelse af autoktone tumorer.

En ulempe ved ortotopisk model er den generelle manglende evne til at visualisere tumorvækst, en funktion, der nemt overvåges for en sc tumor ved caliper måling. Nuværende teknologi ved anvendelse af gensplejsede tumorceller og bioluminescerende billeddannelse tillader langsgående målinger af interne tumorer. Vi har vist evnen til at bestemme primær nyretumor og metastatisk byrde på forskellige tidspunkter baseret på bioluminescerende billeddannelse og / eller organ ekstraktion 17, 24, 25. En styrken i vores model er tilgængeligheden af ​​GFP og luciferase-udtrykkende Renca cellelinje, men modellen kræver ikke denne funktion for succes. Vi har karakteriseret ellerthotopic RCC model med både forældrenes Renca og Renca-GL celler. Efter implantation af Renca-GL-celler, kan primære tumorer nemt måles ved bioluminescerende billeddannelse. Det kan være vanskeligt at kontrollere metastaser i hele dyret, men som den primære tumor kan frembringe et signal, der overvælder de lavere signaler, der måtte blive udsendt fra den metastatiske site. Udskæring og billeddannelse de enkelte organer fra hele dyret giver mulighed for visualisering og kvantificering af metastaser i disse organer. I Renca orthotopisk model, de primære nyretumorer giver anledning til spontane mikro-metastaser i lungerne af dyr så tidligt som 7 dage efter implantering, som ses ved luminescens i det udskårne lungevæv 17.

Mens anvendelsen af ​​en luciferase-udtrykkende tumorcellelinie i dette system giver brugeren mulighed for at spore tumorudvikling langs i det samme dyr, det giver også brugeren mulighed for at evaluate præcisionen af ​​implantation teknik. Musen nyre er en lille anatomisk struktur, hvilket gør det muligt, især når der anvendes en lang nål, til at injicere tumorcellerne gennem nyren og gælder i peritoneum. Billeddannelse af musen inden for flere dage efter injektion bestemmer, i hvilket omfang implantation af tumorcellerne er lokaliseret til nyren. En anden funktion, der kan komplicere intrarenal injektion er tilstedeværelsen af ​​en overflod af visceralt fedt, der kan opsummere som de animalske aldre. Nyren er let synlig gennem bughinden i en lean mus, men nyren kan blive skjult under lapper af visceralt fedt, som kan udvikle sig over tid.

Ved afslutningen af ​​et givet eksperiment, kan en række vurderinger anvendes til at bestemme det hele kroppen tumorbelastning. Bioluminescent billeddannelse af de udskårne organer giver et objektivt mål for tumor byrde. Vådvægt primære tumorer normaliseret til den kontralaterale kidney som en intern kontrol giver en bulk masse måling. Den metastatiske byrde i lungen kan også bestemmes ved at puste lungerne med tusch en bloc at muliggøre visualisering af hvide lunge tumorknuder anvendelse af et dissektionsmikroskop. Disse udlæsninger kan etablere hele kroppen tumorbelastning, som kan anvendes som et grundlag for at undersøge den terapeutiske effektivitet ved den prækliniske fase af lægemiddeludvikling. Ekspression af GFP ved de Renca-GL-celler også egner sig til flowcytometrisk analyser af tumorbærende væv. Dog skal udvises forsigtighed for enhver flowcytometrisk vurdering af tumorbærende nyre, især når undersøger sammensætningen og omfanget af ethvert immunologisk respons genereres som følge af behandlingen. Nyrer er meget vaskulære organer, hvilket gør det sandsynligt, at evalueringen af ​​immunresponset (enten pro-tumor eller anti-tumor) i hele tumor-bærende nyrer vil omfatte både "vævs- og kar-lokalisered" immunceller på tidspunktet for orgel høst. For at skelne væv versus blod immunceller, bruger vi en teknik, hvor fluorochrom-mærket anti-CD45,2-monoklonalt antistof (mAb) injiceres iv før eutanasi. Nyrerne fremstilles derefter til strømning cytometri, som omfatter ex vivo farvning med forskellig fluorochrom-mærket anti-CD45,2 mAb 28, 29. Dual CD45,2-farvning diskriminerer celler i vaskulaturen fra vævet på tidspunktet for høst. Denne simpel protokol muliggør identifikation af større leukocyt slægter, der er indeholdt i karrene, som ellers kan forvirre fortolkning af adaptive og medfødte immunrespons i væv. Denne protokol eliminerer også behovet for perfusion, hvilket kan have utilsigtede konsekvenser 28, 29.

Der er i øjeblikket en øget forståelse for og anvendelse af immunterapitil behandling af kræft. Udviklingen af ​​fremtidige immunologisk baserede behandlinger for mRCC (og andre kræftformer) starter i laboratoriet ved hjælp af en clinically- og fysiologisk relevant model. Den orthotopisk RCC model beskrevet heri indeholder en række vigtige funktioner (fx primær renal tumor, fjerne metastaser, tumor-induceret immunsuppression, og komponenter til langsgående overvågning af tumorvækst) til test af effektiviteten af en række terapeutiske modaliteter. Det er også fristende at spekulere, at denne model kan tilpasses i fremtiden at evaluere fremskridt i andre midler til behandling af RCC, såsom kirurgisk og / eller fokale terapiprotokoller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Cancer Institute (R15CA173657 til AW og R01CA109446 til GTS), Simmons Cancer Institute (til AW), og University of Minnestoa forcere 4 Nyre Cancer Foundation (til GTS). Vi takker Dr. Kristin Anderson for at få hjælp med immunofluorescens.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Artificial tears ophthalmic ointment Akorn NDC 17478-162-35
Vetbond Tissue Adhesive 3M CBGBIW011019
Betadine Solution (Povidone-iodine, 5%) Purdue Products, L.P. NDC 67618-155-32
0.25% Marcaine (bupivavaine HCl injection) Hospira 0409-1587-50 
Heating pad Sunbeam
Syringes BD 309659
Gauze Venture 908291
Ketamine Phoenix Pharmaceuticals NDC 57319-609-02
Xylazine  Akorn NDC 59399-111
Hank’s Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387
IVIS Caliper
D-Luciferin, Potassium Salt GoldBio LUCK-1G
India Ink Chartpak Inc 44201
Scissors
Forceps
Sleeping Beauty (SB) transposon system Neuromics SBT0200
Renca ATCC CRL-2947

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 66, 7-30 (2016).
  2. Chow, W. H., Dong, L. M., Devesa, S. S. Epidemiology and risk factors for kidney cancer. Nat. Rev. Urol. 7, 245-257 (2010).
  3. Hollingsworth, J. M., Miller, D. C., Daignault, S., Hollenbeck, B. K. Rising incidence of small renal masses: a need to reassess treatment effect. J. Natl. Cancer Inst. 98, 1331-1334 (2006).
  4. Lee-Ying, R., Lester, R., Heng, D. Current management and future perspectives of metastatic renal cell carcinoma. Int. J. Urol. 21, 847-855 (2014).
  5. Rini, B. I. New strategies in kidney cancer: therapeutic advances through understanding the molecular basis of response and resistance. Clin. Cancer Res. 16, 1348-1354 (2010).
  6. Acquavella, N., Fojo, T. Renal cell carcinoma: trying but failing to improve the only curative therapy. J. Immunother. 36, 459-461 (2013).
  7. Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Cancer Res. 46, 3358-3363 (1986).
  8. Ko, J. S., et al. Direct and differential suppression of myeloid-derived suppressor cell subsets by sunitinib is compartmentally constrained. Cancer Res. 70, 3526-3536 (2010).
  9. Kusmartsev, S., et al. Oxidative stress regulates expression of VEGFR1 in myeloid cells: link to tumor-induced immune suppression in renal cell carcinoma. J. Immunol. 181, 346-353 (2008).
  10. Rocha, F. G., et al. Endostatin gene therapy enhances the efficacy of IL-2 in suppressing metastatic renal cell carcinoma in mice. Cancer Immunol. Immunother. 59, 1357-1365 (2010).
  11. Shanker, A., et al. Treating metastatic solid tumors with bortezomib and a tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonist antibody. J. Natl. Cancer Inst. 100, 649-662 (2008).
  12. VanOosten, R. L., Griffith, T. S. Activation of tumor-specific CD8+ T Cells after intratumoral Ad5-TRAIL/CpG oligodeoxynucleotide combination therapy. Cancer Res. 67, 11980-11990 (2007).
  13. Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation: advantages and disadvantages. Eur. J. Cancer. 40, 852-857 (2004).
  14. Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Mol. Ther. 22, 18-27 (2014).
  15. Devaud, C., et al. Differential potency of regulatory T cell-mediated immunosuppression in kidney tumors compared to subcutaneous tumors. Oncoimmunology. 3, 963395 (2014).
  16. Devaud, C., et al. Cross-talk between tumors can affect responses to therapy. Oncoimmunology. 4, 975572 (2015).
  17. Norian, L. A., et al. Eradication of metastatic renal cell carcinoma after adenovirus-encoded TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)/CpG immunotherapy. PLoS One. 7, 31085 (2012).
  18. Matin, S. F., et al. Immunological response to renal cryoablation in an in vivo orthotopic renal cell carcinoma murine model. J. Urol. 183, 333-338 (2010).
  19. Wilber, A., et al. RNA as a source of transposase for Sleeping Beauty-mediated gene insertion and expression in somatic cells and tissues. Mol. Ther. 13, 625-630 (2006).
  20. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J. Vis. Exp. , (2009).
  21. Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. J Vis Exp. , (2013).
  22. Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse. J. Vis. Exp. , (2010).
  23. Wexler, H. Accurate identification of experimental pulmonary metastases. J. Natl. Cancer Inst. 36, 641-645 (1966).
  24. James, B. R., et al. CpG-mediated modulation of MDSC contributes to the efficacy of Ad5-TRAIL therapy against renal cell carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 63, 1213-1227 (2014).
  25. James, B. R., Brincks, E. L., Kucaba, T. A., Boon, L., Griffith, T. S. Effective TRAIL-based immunotherapy requires both plasmacytoid and CD8a DC. Cancer Immunol. Immunother. 63, 685-697 (2014).
  26. James, B. R., et al. Diet-induced obesity alters dendritic cell function in the presence and absence of tumor growth. J. Immunol. 189, 1311-1321 (2012).
  27. Brincks, E. L., et al. Triptolide enhances the tumoricidal activity of TRAIL against renal cell carcinoma. FEBS J. 282, 4747-4765 (2015).
  28. Anderson, K. G., et al. Cutting edge: intravascular staining redefines lung CD8 T cell responses. J. Immunol. 189, 2702-2706 (2012).
  29. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nat. Protocols. 9, 209-222 (2014).

Tags

Cancer Research renalcellecarcinom metastase nyre orthotopisk intrarenal luciferase
En syngen musemodel af metastaserende renalcellecarcinom for Kvantitativ og Longitudinal Vurdering af Prækliniske Terapier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murphy, K. A., James, B. R., Wilber, … More

Murphy, K. A., James, B. R., Wilber, A., Griffith, T. S. A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies. J. Vis. Exp. (122), e55080, doi:10.3791/55080 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter