Introduction
Os anticorpos monoclonais (mAbs) são proteínas bioterapêuticos com crescente interesse devido à sua capacidade de agir contra várias doenças crónicas e degenerativas 1. Como outras biomoléculas, os mAbs são propensos a sofrer várias alterações físico-químicos em todas as fases do seu ciclo de vida (ou seja, a partir de biossíntese para o produto final). Tais modificações incluem, mas não estão limitados a: desamidação, glicosilação, oxidação, ciclização, isomerização, a agregação e a clivagem proteolítica 2. Assim, técnicas analíticas capazes de resolver isoformas intrínsecas são necessários para monitorar mAbs heterogeneidade e estabilidade a fim de estabelecer especificações de qualidade.
A electroforese capilar (CE) é uma tecnologia de separação de alta performance realizada outinside de um tubo de sílica fundida estreita (gama uM) cheio com um electrólito de fundo (BGE). Após a aplicação de um campo eléctrico (até 30.000 V), molécula carregadas migrar para o eletrodo com carga oposta (ie, separação orientada por electro). O uso de altas tensões no CE permite análises rápidas e uma maior eficiência, que são superiores a electroforese em gel clássica. Eletroforese capilar de zona (CZE) é uma técnica baseada CE rotineiramente utilizado na indústria biofarmacêutica para a avaliação da qualidade do produto 3-9. Ao contrário de outros modos de Ce (por exemplo, electroforese capilar em gel, isoeléctrica capilar de focagem) ou métodos baseados em cromatografia, CZE pode ser realizado sem a utilização de agentes desnaturantes ou interfaces de fase sólida, permitindo a análise da heterogeneidade inerente de mAbs próximo ao seu estado nativo 10 . CZE separação de isoformas de mAb ocorre dentro de um capilar de sílica fundida coberta com um polímero hidrofílico (capilar neutro) e baseia-se na sua mobilidade electroforética diferente, que é regida por carga, massa, tamanho e forma (ou volume hidrodinâmico) 11. porções de mAb são detectados quandoeles são mobilizadas e passe através da janela de detecção, que é detectada por um detector de ultravioleta (UV) a absorvância a 214 nm de 4.
O sucesso da implementação desta técnica analítica dependerá a devida atenção aos detalhes antes e durante o experimento. Agindo de outra forma vai aumentar o custo eo tempo para realizar a análise, levando a falha constante e frustração.
Aqui, apresentamos um guia passo-a-passo para realizar uma análise bem-sucedida de mAb heterogeneidade por CZE através da explicação detalhada sobre a preparação de soluções e amostras, a preparação do sistema CE, os métodos instrumento criado, a aquisição de dados e o processamento. Para o propósito deste tutorial, um factor alfa de necrose anti-tumoral totalmente humano recombinante (anti-TNF) é o mAb usado como modelo de proteína; no entanto, este protocolo pode ser facilmente customizado para a análise de outras proteínas considerando breves modificações. UMAdditionally, várias recomendações para mitigar possíveis problemas são propostos. O leitor é encorajado a seguir rigorosamente o protocolo proposto, como a probabilidade de sucesso irá aumentar.
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Protocol
1. Preparação de Soluções
- Preparar a solução BGE.
- Preparação de 100 ml de uma solução composta de 0,05% (m / v) de celulose hidroxi propil metil celulose (HPMC), 200 mM de ε amino-n-capróico ácido (EACA) e acetato de lítio 30 mM.
NOTA: Como HPMC é um polímero viscoelástico, despeje o pó para um copo de vidro, adicionar 80 ml de água e, finalmente, adicionar a barra de agitação. Continue a adicionar os restantes reagentes como normalmente. Use óculos de segurança ao manusear acetato de lítio, pois pode causar irritação nos olhos. - Ajustar o valor de pH para 4,8 ± 0,1 com 50% (v / v) de ácido acético. Permitir que a solução para estabilizar durante 5 min e ajustar se necessário.
- Adiciona-se água para perfazer a um volume final de 100 ml em balão volumétrico.
- Filtrar através de uma membrana hidrófila com um tamanho de poro de 0,2 um.
- Armazenar de 2-8 ° C por até 7 dias.
- Preparação de 100 ml de uma solução composta de 0,05% (m / v) de celulose hidroxi propil metil celulose (HPMC), 200 mM de ε amino-n-capróico ácido (EACA) e acetato de lítio 30 mM.
- Prepara-se o padrão interno.
- Prepare 1 mLde uma solução composta de 1% (m / v) de histamina.
- Filtrar através de uma membrana hidrófila com um tamanho de poro de 0,2 um.
- Armazenar de 2-8 ° C por até 1 dia.
Preparação 2. Amostra
- Preparar 180 ul de amostra de mAb diluído com tampão Tris (50 mM de Tris (hidroximetil) aminometano, pH 8,0) a uma concentração final de 1 mg / ml.
- Adicionar 20 ul de 1% (m / v) de histamina.
- Misturar e centrifugar a 1000 xg por 5 s.
- Coloque um micro frasco dentro de um frasco universal.
- Transferir a amostra para o micro frasco e tampa do frasco universal. Dispense a amostra para cima, a fim de evitar a introdução de bolhas.
- Armazenar de 2-8 ° C por até 1 dia.
- Colocar o frasco universal (com micro frasco contendo a solução de amostra) na bandeja de entrada da amostra.
3. Preparação do sistema CE.
- Limpeza do sistema CE.
NOTA: th Condutaé o procedimento, pelo menos, uma vez por semana, a fim de evitar a fuga de corrente eléctrica derivado de acumulação de poeira e detritos. No entanto, dependendo da aplicação (por exemplo, o uso de um BGE com o aumento da viscosidade ou com uma concentração elevada de sal, as amostras com o aumento da viscosidade) e eléctrodos alavanca de abertura pode necessitar de ser limpo mais frequentemente para evitar a contaminação cruzada e a mistura de amostras.- Desligue o interruptor de alimentação do instrumento CE e abra a porta da frente.
- Limpe a superfície da tampa da amostra, sistema de fixação da amostra (amostra e tampão bandejas), tampa do cartucho, bar braçadeira, bloco de interface e eletrodos com um não tecido umedecido em água limpe. Repita o procedimento com um limpe e seco antes do uso umedecido em etanol.
- Lavar as alavancas de abertura abundantemente com água. Limpar sua superfície com um tecido não tecido wipe. Repita o procedimento com um limpar e secar antes da instalação umedecido em etanol.
- Limpe as duas extremidades do cabo de fibra óptica cuidadoly com um pano de microfibra umedecido em água. Repita o procedimento com um pano umedecido em etanol.
- Do cartucho.
- Remover um novo capilar de ponto morto (50 um de diâmetro interno) da embalagem.
- Fita para baixo uma extremidade do tubo de proteção capilar para a bancada. Desenrolar, endireitar e puxar o capilar para fora do tubo.
- Cole um pedaço de fita adesiva ou papel para o ambiente de trabalho e adicionar marcas de medição como se segue: comprimento para o detector (30 cm), a janela capilar (0,2 cm) e o comprimento da extremidade de saída (10 cm) (isto é, comprimento 40,2 cm total 30,0 cm de comprimento eficaz).
- Alinhar janela de capilar para a marca de medição de 0,2 cm de papel de referência. Fixar o capilar com fita e marcar o capilar termina 2 mm fora as marcas de medição.
- Cortar a tampa de protecção na extremidade de entrada capilar (a extremidade mais afastada da janela) num movimento linear utilizando a extremidade de descarga da pedra de clivagem.
- Mergulha-se o final capilar para um frasco tapado universal enchido com água, a fim de evitar danos permanentes para o revestimento interior capilar. Repetir este procedimento cada vez que a extremidade capilar é exposto ao ambiente, durante mais de 1 minuto.
- Inserir a extremidade de entrada capilar para o lado de saída do cartucho.
- Empurrar e puxar o capilar através do cartucho conforme necessário até que a janela do capilar está centrada à janela do cartucho.
- Insira a ficha de abertura (100 mm x 200 mm) na janela do cartucho.
NOTA: Confirmar que a luz branca passa através da janela, quando expostos a uma fonte de luz branca. Se a luz que passa através tem um aspecto acastanhado, ajustar, conforme necessário. - Inserir o capilar para dentro do tubo pré-formado do líquido de arrefecimento para um comprimento total de 40,2 cm capilar (com a porca de tubagem pré-instalados, virola e o O-ring em ambas as extremidades nessa ordem).
- Empurrar o capilar através da coolantubo T, conforme necessário até que o capilar exibida no outro lado do tubo.
- Inserir a extremidade da tubagem de fluido de arrefecimento no lado da saída do cartucho e aperte a porca de tubagem.
- Inserir a extremidade de entrada capilar no lado de entrada do cartucho.
- Empurrar e puxar o capilar através do cartucho conforme necessário até que o capilar exibida no lado de entrada do cartucho.
- Inserir a extremidade do tubo de refrigerante no lado de entrada do cartucho e aperte a porca de tubagem.
- Cortar a tampa de protecção na extremidade de saída capilar (a extremidade mais próxima da janela) num movimento linear utilizando a extremidade de descarga da pedra de clivagem.
- Inserir os clipes de vedação-retentor sobre as extremidades capilares e pressione para encaixar na posição. Inspecione visualmente o capilar termina. Se eles não são ainda, repita o procedimento.
- Coloque o modelo capilar de comprimento na borda da bancada.
- Coloque o cartucho voltado para baixo against o molde capilar de comprimento e alinhar o capilar termina com as linhas de referência no modelo. Se as marcas de medição capilar (ver 3.2.4) não se alinham com as linhas de referência, ajustar conforme necessário.
- Segurar o capilar contra o molde capilar de comprimento e cortar ambas as extremidades do capilar utilizando a extremidade de descarga da clivagem de pedra 2 mm abaixo das linhas de referência no modelo.
- Inspecione visualmente o capilar termina com uma lupa. Se extremidades capilares não são suaves, polir-los usando o rosto suave da pedra clivagem.
- Insira a abertura O-ring no orifício da vela abertura usando a ferramenta de inserção O-ring.
- Instale frascos universais cobertas cheias de água no caso do cartucho eo cartucho lugar em caso imediatamente com extremidades capilares inseridos em frascos. Para armazenamento de curto e longo prazo manter a 2-8 ° C.
- Preparação de tampão de bandejas.
- Preencher e coloque univers tampadasfrascos de Al na entrada do tampão e os tabuleiros de saída (Figura 1). posições dos frascos de repetição em pistas 2, 3, 4 e 5, de acordo com o número de amostras a serem analisadas, colocando uma pista para cada seis injecções de amostra.
NOTA: Evite molhar as tampas dos frascos, a fim de evitar a fuga de corrente.
- Preencher e coloque univers tampadasfrascos de Al na entrada do tampão e os tabuleiros de saída (Figura 1). posições dos frascos de repetição em pistas 2, 3, 4 e 5, de acordo com o número de amostras a serem analisadas, colocando uma pista para cada seis injecções de amostra.
Figura 1: Posição e nível de enchimento de frascos universais nas bandejas de entrada e saída de buffer. Encha níveis: 1/1 = 1,400 mL, 3/4 = 1300 mL e 1000 mL = 1/2. Abreviaturas: W = água, HCl = ácido clorídrico 0,1 M. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Sistema CE montagem de componentes.
- Instalar o detector UV.
- Instalar a alavanca de aberturapressionando-se no bloco de interface.
- Instalar o cabo de fibra óptica. Insira a extremidade correspondente à barra de fixação e, mantendo ambas as extremidades, girar no sentido horário. Ligue a outra extremidade ao detector UV.
NOTA: Lidar com o cabo de fibra óptica com cuidado durante este procedimento desde flexão poderia causar sua fratura. - Colocar a amostra e as bandejas de buffer para o sistema de retenção de amostra e encaixe na posição.
- Coloque o cartucho capilar no bloco de interface e, enquanto pressiona a barra de fixação em ambas as extremidades, apertar os botões.
4. Métodos Instrumento Set-up
- Criar o condicionamento, correndo e métodos instrumento desligamento de acordo com os seguintes parâmetros e Tabela 1: Tensão, max: 30,0 kV; Corrente, máx: 300.0 mA; temperatura do cartucho: 20,0 ° C; temperatura de armazenamento da amostra: 10,0 ° C; Detector de UV condições iniciais: Comprimento de onda: 214 nm; Taxa de dados: 4 Hz; Filtro: Normal; largura do pico (pontos): 16-25; sinal de absorbância: Direct.
NOTA: taxa de aquisição de dados pode ser aumentada até 25 Hz, a fim de melhorar a cobertura das zonas de separação estreitas.
| programa de tempo método de condicionamento | |||||||
| Tempo (min) | Evento | Valor | Duração | frasco de entrada | frasco de saída | Resumo | Comentários |
| - | Lavar - Pressão | 2068 mbar | 1,0 min | BI: C1 | BO: C1 | para a frente | HCl 0,1 M |
| - | Lavar - Pressão | 2068 mbar | 2,0 min | BI: B1 | BO: C1 | para a frente | <td> Água|
| - | Lavar - Pressão | 2068 mbar | 10,0 min | BI: E1 | BO: C1 | para a frente | BGE |
| 0.00 | Separado - Tensão | 15,0 KV | 10,0 min | BI: D1 | BO: D1 | 0,17 rampa Min, polaridade normal, | Separado |
| 10.00 | Lavar - Pressão | 2758 mbar | 10,0 min | BI: E1 | BO: C1 | para a frente | BGE |
| 20.01 | Esperar | - | 0,0 min | BI: A1 | BO: A1 | - | dicas de enxaguamento |
| Correndo método de programa de tempo | |||||||
| Tempo (min) | Evento | Valor | Duração | frasco de entrada | Resumo | Comentários | |
| - | Lavar - Pressão | 2068 mbar | 1,0 min | BI: C1 | BO: C1 | Adiante, In / Out inc frasco 6 | HCl 0,1 M |
| - | Lavar - Pressão | 2068 mbar | 2,0 min | BI: B1 | BO: C1 | Adiante, In / Out inc frasco 6 | água |
| - | Lavar - Pressão | 2068 mbar | 4,0 min | BI: E1 | BO: C1 | Adiante, In / Out inc frasco 6 | BGE |
| - | Injectar - Pressão | 34 mbar | 20,0 seg | SI: A1 | BO: B1 | Substituir, Avançado | injecção da amostra |
| - | Esperar | - | 0,4 min | BI: A1 | BO: A1 | In / Out inc frasco 6 | dicas de lavagem |
| 0 | Separado - Tensão | 15,0 KV | 30,0 min | BI: D1 | BO: D1 | 0,17 Min rampa, polaridade normal, In / Out inc frasco 6 | Separação amostra |
| 0,5 | autozero | - | - | - | - | - | - |
| 30.01 | pare de dados | - | - | - | - | - | - |
| 30.02 | Lavar - Pressão | 2068 mbar | 2,0 min | BI: B1 | BO: C1 | Adiante, In / Out inc frasco 6 | água |
| 32.03 | Esperar | - | 0,0 min | BI: A1 | BO: A1 | In / Out inc frasco 6 | dicas de enxaguamento |
| 32.04 | Fim | - | - | - | - | - | Fim |
| programa de tempo método de desligamento | |||||||
| Tempo (min) | Evento | Valor | Duração | frasco de entrada | frasco de saída | Resumo | Comentários |
| - | Lavar - Pressão | 2068 mbar | 1,0 min | BI: E6 | BO: E6 | para a frente | HCl 0,1 M |
| - | Lavar - Pressão | 2068 mbar | 6,0 min | BI: F6 | BO: F6 | para a frente | água |
| - | Lamp - Off | - | - | - | - | - | - |
| - | Esperar | - | 0,0 min | BI: A1 | BO: A1 | - | dicas de enxaguamento |
Tabela 1: Condicionado, correndo e programas de tempo de desligamento.
5. Aquisição de Dados e Processamento
- Programar o conjunto de amostras.
- Programar o capilar para o condicionamento usando o método de condicionamento instrumento. Quando o capilar é usado pela primeira vez, o programa de quatro repetições; caso contrário programar apenas duas repetições do método de condicionamento.
- Programar as amostras a serem analisadas utilizando o método do instrumento em execução.
- Programar o capilar para armazenamento, utilizando o método instrumento desligamento e repita o procedimento indicado no ponto 3.2.22.
- Executar o experimento.
- Exportar os eletroferogramas.
- Calcule o tempo de migração e o teor percentual de base, um dos principaisisoformas ácidas nd usando integração linha de queda vertical do perfil electrofograma.
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Representative Results
A Figura 2 mostra o perfil de corrente eléctrica típica de um EACA 200 mM, 30 mM de acetato de lítio, pH 4,8 com BGE amostra anti-TNFa mAb diluído com tampão Tris (50 mM, pH 8,0). Como pode ser observado, a corrente é estável durante toda a análise e pode oscilar entre os valores de 30 a 35 uA. A Figura 3 mostra o electroferograma CZE de uma amostra em branco onde o pico detectado corresponde ao padrão interno de histamina. Espera-se para a histamina para ter um tempo de migração de 3,7 a 4,1 min. A Figura 4 mostra o electroferograma CZE de TNFa anti-mAb. Como pode ser observado, o pico principal é precedido e seguido por picos de menor intensidade. Uma vez que a separação é conduzida sob polaridade normal (ou seja, de positivo para negativo), a análise revela isoformas básicas (mAb variantes com carga positiva) que migram mais rapidamente e isoformas ácidas (mAb variantes com carga negativa) migração mais lenta do que a isoforma principal.
Figura 2: perfil da corrente eléctrica de uma típica corrida CZE. A corrente BGE é estável a cerca de 30 uA, quando a amostra é diluída de mAb com tampão Tris (50 mM, pH 8,0). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: CZE electrofograma da amostra em branco. Note-se que não há picos são detectados para além do que o padrão interno de histamina. UA = unidades de absorvência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: heterogeneidade físico-química de anti-TNF mAb determinado por CZE. Esta amostra é composta por isoformas básicas, principais e ácidas. Inserção mostra uma visão expandida das variantes resolvidos por CZE. UA = unidades de absorvência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste tutorial, destacamos a importância de práticas adequadas na condução CZE análises de mAbs, a fim de aumentar a probabilidade de sucesso. No entanto, quando CZE é usado de forma rotineira, questões surgem inevitavelmente 12.
Para melhores resultados, é importante seguir as notas que foram incluídos ao longo do protocolo, como eles vão ajudar o analista a superar e resolver problemas difíceis passos. Uma consideração importante para obter uma melhor resolução a um dado conjunto de condições, é a preparação da solução correcta BGE. Este processo requer ter um controle rigoroso sobre a força iónica de agentes tamponantes, concentração de aditivos não-tampão e pH. No geral, o sistema CE exige cuidado e atenção aos detalhes. Ele pode ser facilmente danificadas se qualquer passo de limpeza, relativa ao sistema de montagem ou é ignorado.
O presente método considera a utilização de um capilar de ponto morto. Ao contrário de capilares de sílica fundida descalços,capilares neutros reduzir a adsorção de proteína sobre a parede interna capilar, melhorando assim a eficiência de separação, precisão e repetibilidade 9. No entanto, a sua utilização é limitada pela quantidade de injecções que podem ser executadas. Na nossa experiência, 120 a 150 injectáveis pode ser levada a cabo sem efeito sobre a resolução devido à degradação progressiva do revestimento interior. Uma vez que o capilar atingiu esse limite, será necessário um novo capilar.
Outros protocolos têm sido relatados para a análise físico-química da heterogeneidade de mAbs por CZE, que incluem a utilização de capilares permanently- e dinamicamente-revestidas 13,14. No entanto, estes estudos propõem a utilização de um conjunto fixo de condições para analisar a grande diversidade de mAbs. Em contraste com os métodos existentes, acreditamos que a performance óptima só pode ser conseguida através da adaptação condições experimentais. Por exemplo, o protocolo aqui apresentado tem sido utilizado e ajustado nopassado para analisar a heterogeneidade isoforma de quatro outros mAbs diferentes e um fragmento de Acm 10. A fim de adaptar este protocolo para avaliar outros mAbs, recomenda-se a modulação de BGE força iónica e de pH de acordo com a diversidade e variantes ponto isoeléctrico da molécula a ser analisado.
Novas medidas depois de dominar esta técnica deve incluir a avaliação do desempenho do método. Parâmetros tais como a selectividade e a repetibilidade (em termos do desvio padrão relativo de tempo de migração e a percentagem de área) deve ser testada a fim de confirmar que o método é adequado para o uso pretendido.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glacial acetic acid | Tecsiquim | AT0035-7 | |
| ACS grade hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535-05 | |
| Histamine dihydrochloride | Fluka | 53300 | |
| (Hydroxypropyl) methyl cellulose | Fluka | 09963 | |
| Lithium acetate | Sigma-Aldrich | 517992 | |
| 6-Aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| eCAP Tris Buffer, 50.0 mM, pH 8 | Beckman Coulter | 477427 | |
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System | Beckman Coulter | A66528 | |
| eCAP Neutral capillary | Beckman Coulter | 477441 | |
| Vial, Micro, 200 µl | Beckman Coulter | 144709 | |
| Universal Vial Caps | Beckman Coulter | A62250 | |
| Universal Vials | Beckman Coulter | A62251 | |
| Cable, Optics, UV/Vis | Beckman Coulter | 144093 | |
| UV/Vis Detector Module | Beckman Coulter | 144733 | |
| Cartridge Assembly Kit, Blank | Beckman Coulter | 144738 |
References
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