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Biochemistry

Electroforesis Capilar La separación del anticuerpo monoclonal isoformas El uso de un capilar Neutral

doi: 10.3791/55082 Published: January 16, 2017
* These authors contributed equally

Introduction

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Los anticuerpos monoclonales (mAb) son proteínas bioterapéuticos con creciente interés debido a su capacidad para actuar contra varias enfermedades crónicas y degenerativas 1. Al igual que otras biomoléculas, mAbs son propensos a someterse a varias modificaciones fisicoquímicas en todas las etapas de su ciclo de vida (es decir, desde la biosíntesis en el producto final). Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a: la desamidación, glicosilación, oxidación, ciclación, isomerización, la agregación y la escisión proteolítica 2. Por lo tanto, se necesitan técnicas analíticas capaces de resolver isoformas intrínsecas para supervisar mAbs heterogeneidad y la estabilidad con el fin de establecer las especificaciones de calidad.

La electroforesis capilar (CE) es una tecnología de separación de alto rendimiento realizado outinside de un tubo de sílice fundida estrecho (rango de micras) lleno de un electrolito de fondo (BGE). Tras la aplicación de un campo eléctrico (hasta 30,000 V), molécula cargadas migran hacia el electrodo con carga opuesta (es decir, la separación electro-driven). El uso de altas tensiones en CE permite análisis rápidos y aumento de la eficiencia, que son superiores a electroforesis en gel clásico. Electroforesis de zona capilar (CZE) es una técnica basada en la CE se utiliza rutinariamente en la industria biofarmacéutica para la evaluación de la calidad del producto 3-9. A diferencia de otros modos de CE (por ejemplo, electroforesis en gel capilar, isoeléctrico capilar de enfoque) o métodos basados en la cromatografía, CZE puede llevarse a cabo sin el uso de desnaturalizantes o interfaces en fase sólida, lo que permite el análisis de la heterogeneidad inherente de mAbs cerca de su estado nativo 10 . Separación CZE de isoformas de mAb se produce en el interior de un capilar de sílice fundida cubierto con un polímero hidrófilo (capilar neutro) y se basa en su movilidad electroforética diferente, que es gobernado por la carga, la masa, el tamaño y la forma (o volumen hidrodinámico) 11. restos de mAb se detectan cuandose movilizan y pasan a través de la ventana de detección, que es detectado por un detector de ultravioleta (UV) de la absorbancia a 214 nm 4.

La implementación exitosa de esta técnica analítica dependerá de la debida atención a los detalles antes y durante el experimento. Actuar de otra manera se incrementará el costo y el tiempo para llevar a cabo el análisis, en última instancia conduce a la insuficiencia constante y frustración.

A continuación, presentamos una guía paso a paso para llevar a cabo un análisis exitoso de mAb heterogeneidad mediante CZE través de la explicación detallada de la preparación de soluciones y muestras, la preparación del sistema de la CE, los métodos de instrumentos creados, la adquisición de datos, y el procesamiento. Para el propósito de este tutorial, un factor de necrosis antitumoral recombinante alfa totalmente humano (anti-TNF) mAb se utiliza como modelo de proteína; Sin embargo, este protocolo se puede personalizar fácilmente para el análisis de otras proteínas considerando breves modificaciones. UNdicionalmente, una serie de recomendaciones para mitigar los posibles problemas se proponen. Se invita al lector a seguir estrictamente el protocolo propuesto, como la probabilidad de tener éxito se incrementará.

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Protocol

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1. Preparación de soluciones

  1. Preparar la solución de BGE.
    1. Preparar 100 ml de una solución compuesta de 0,05% (m / v) de celulosa hidroxi propil metil celulosa (HPMC), 200 mM ε-amino n-caproico (EACA) y acetato de litio 30 mM.
      NOTA: Como HPMC es un polímero viscoelástico, verter el polvo en un vaso de precipitados de vidrio, añadir 80 ml de agua y, finalmente, añadir la barra de agitación. Continúe añadiendo los reactivos restantes como normalmente. Use gafas de seguridad al manipular acetato de litio, ya que puede causar irritación en los ojos.
    2. Ajustar a pH 4,8 ± 0,1 con 50% (v / v) de ácido acético. Deje que la solución se estabilice durante 5 min y ajustar según sea necesario.
    3. Añadir agua para completar hasta un volumen final de 100 ml en matraz aforado.
    4. Filtrar a través de una membrana hidrófila con un tamaño de poro 0,2 micras.
    5. Almacenar a 2-8 ° C durante un máximo de 7 días.
  2. Preparar el estándar interno.
    1. Preparar 1 mlde una solución compuesta de 1% (m / v) de histamina.
    2. Filtrar a través de una membrana hidrófila con un tamaño de poro 0,2 micras.
    3. Almacenar a 2-8 ° C durante un máximo de 1 día.

Preparación 2. Muestra

  1. Preparar 180 l de muestra mAb diluido con tampón Tris (tris 50 mM (hidroximetil) aminometano, pH 8,0) a una concentración final de 1 mg / ml.
  2. Añadir 20 l de 1% (m / v) de histamina.
  3. Mezclar y centrifugar a 1.000 xg durante 5 seg.
  4. Colocar un vial micro dentro de un vial universal.
  5. Transferir la muestra en el vial micro y tapar el vial universal. Dispensar la muestra hacia arriba con el fin de evitar la introducción de burbujas.
  6. Almacenar a 2-8 ° C durante un máximo de 1 día.
  7. Colocar el vial universal (con vial micro que contiene la solución de muestra) en la bandeja de entrada de muestra.

3. Preparación de Sistema CE.

  1. Limpieza del sistema de la CE.
    NOTA: J Conductaes el procedimiento por lo menos una vez a la semana con el fin de evitar la fuga de corriente eléctrica derivada de la acumulación de polvo y escombros. Sin embargo, dependiendo de la aplicación (por ejemplo, el uso de un BGE con el aumento de la viscosidad o con alta concentración de sal, las muestras con un aumento de viscosidad) electrodos y palancas de apertura puede requerir ser limpiado más frecuentemente para evitar la contaminación cruzada y el arrastre de muestra.
    1. Apague el interruptor de alimentación del instrumento CE y abrir la puerta principal.
    2. Limpiar la superficie de la cubierta de la muestra, la muestra que contiene el sistema (tampón de muestra y bandejas), cubierta del cartucho, la barra de sujeción, bloque de interfaz y los electrodos con un material no tejido humedecido en agua y limpie. Repita el procedimiento con una mezcla de etanol-humedecido limpie y seque antes de su uso.
    3. Enjuagar las palancas de apertura a fondo con agua. Limpiar su superficie con un trapo no tejido. Repita el procedimiento con una mezcla de etanol-humedecido limpie y seque antes de la instalación.
    4. Limpiar los dos extremos del cable de fibra óptica cuidadoly con un paño de microfibra humedecido en agua. Repita el procedimiento con un paño humedecido con etanol.
  2. El conjunto de cartucho.
    1. Retirar un nuevo capilar neutro (50 micras de diámetro interno) de su envoltorio.
    2. Pegue un extremo del tubo de protección capilar a la mesa de trabajo. Uncoil, enderezar y tire de la capilaridad hacia fuera del tubo.
    3. Stick un trozo de cinta o papel para la mesa de trabajo y añadir marcas de medición de la siguiente manera: longitud al detector (30 cm), ventana capilar (0,2 cm) y la longitud al extremo de salida (10 cm) (es decir, longitud 40,2 cm total 30,0 cm de longitud efectiva).
    4. Alinear la ventana capilar hasta la marca de medición de 0,2 cm en el documento de referencia. Fijar el capilar con cinta y marcar el capilar final: 2 mm fuera de las marcas de medición.
    5. Cortar la tapa de protección en el extremo de entrada capilar (el extremo más alejado de la ventana) en un solo movimiento lineal utilizando el borde a ras de la piedra de escisión.
      1. Sumergir el extremo capilar en un vial tapado universales lleno de agua a fin de evitar daños permanentes en el revestimiento interno capilar. Repita este procedimiento cada vez que el extremo capilar se expone al ambiente durante más de 1 min.
    6. Insertar el extremo de entrada capilar en el lado de salida del cartucho.
    7. Empujar y tirar del capilar a través del cartucho como sea necesario hasta que la ventana está centrada capilar a la ventana cartucho.
    8. Inserte la clavija del orificio (100 micras x 200 micras) en la ventana del cartucho.
      NOTA: Confirme que la luz blanca pasa a través de la ventana cuando se expone a una fuente de luz blanca. Si la luz que pasa a través de tiene una apariencia de color marrón, realice los ajustes necesarios.
    9. Insertar el capilar en el tubo de refrigerante preformada para una longitud total de 40,2 cm capilar (con la tuerca de la tubería pre-instalado, casquillo y la junta tórica en ambos extremos en ese orden).
    10. Empuje el capilar a través de la coolant tubo como sea necesario hasta que el capilar aparece en el otro lado de la tubería.
    11. Insertar el extremo del tubo de refrigerante en el lado de salida del cartucho y apretar la tuerca de la tubería.
    12. Insertar el extremo de entrada capilar en el lado de entrada del cartucho.
    13. Empuje y tire del capilar a través del cartucho según sea necesario hasta que el capilar aparece en el lado de entrada del cartucho.
    14. Insertar el extremo del tubo de refrigerante en el lado de entrada del cartucho y apretar la tuerca de la tubería.
    15. Cortar la tapa de protección en el extremo de salida capilar (el extremo más cercano de la ventana) en un solo movimiento lineal utilizando el borde a ras de la piedra de escisión.
    16. Inserte los clips de foca-retención sobre los extremos de los capilares y presione hasta que encaje en su posición. inspeccionar visualmente los extremos del capilar. Si no lo son, incluso, repita el procedimiento.
    17. Coloque la plantilla capilar de longitud en el borde de la mesa de trabajo.
    18. Coloque el cartucho hacia abajo against la plantilla capilar de longitud y alinear el capilar termina con las líneas de referencia en la plantilla. Si las marcas de medición capilar (véase 3.2.4) no se alinean con las líneas de referencia, realice los ajustes necesarios.
    19. Mantenga el capilar contra la plantilla capilar de longitud y corte ambos extremos del capilar utilizando el borde a ras de la escisión de piedra 2 mm por debajo de las líneas de referencia de la plantilla.
    20. inspeccionar visualmente el capilar termina con una lupa. Si extremos de los capilares no son lisas, bruñido utilizando la cara suave de la piedra de escisión.
    21. Inserte la junta tórica abertura en el orificio del tapón de apertura utilizando la herramienta de inserción junta tórica.
    22. Instalar viales tapados universales llenas de agua en la vaina del cartucho y el cartucho lugar en caso inmediatamente con extremos capilares insertados en viales. Para el almacenamiento a corto y largo plazo, mantener a 2-8 ° C.
  3. Preparación de bandejas de amortiguamiento.
    1. Llenar y colocar tapados universAL viales en la entrada de la memoria intermedia y bandejas de salida (Figura 1). posiciones de los viales de repetición en los carriles 2, 3, 4 y 5 de acuerdo con el número de muestras a analizar, la colocación de un carril por cada seis inyecciones de muestra.
      NOTA: no mojar los tapones de los viales con el fin de evitar la fuga de corriente.

Figura 1
Figura 1: Posición y el nivel de llenado de viales universales en las bandejas de entrada y de salida de amortiguación. Llenar los niveles: 1/1 = 1.400 l, 3/4 = 1.300 l y 1/2 = 1000 l. Abreviaturas: W = agua, HCl = ácido clorhídrico 0,1 M. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Sistema de montaje de componentes del CE.
    1. Instalar el detector de UV.
    2. Instalar la palanca de aperturapresionando hacia arriba en el bloque de interfaz.
    3. Instalar el cable de fibra óptica. Inserte el extremo correspondiente a la barra de sujeción y, manteniendo ambos extremos, gire hacia la derecha. Conectar el otro extremo al detector UV.
      NOTA: Maneje el cable de fibra óptica con cuidado durante este procedimiento, ya que podría causar la flexión de su fractura.
    4. Coloque la muestra y las bandejas de amortiguamiento en el sistema de retención de la muestra y encajen en su posición.
    5. Coloque el cartucho capilar en el bloque de interfaz y, mientras presiona la barra de sujeción en ambos extremos, apretar los botones.

4. Métodos de configuración del instrumento

  1. Crear el acondicionamiento, el funcionamiento y los métodos de instrumentos de apagado de acuerdo con los siguientes parámetros y en la Tabla 1: Tensión, max: 30,0 kV; Actual, máxima: 300,0 mu; Cartucho de temperatura: 20.0 ° C; temperatura de almacenamiento de la muestra: 10,0 ° C; detector UV condiciones iniciales: Longitud de onda: 214 nm; Velocidad de datos: 4 Hz; Filtro: normal; anchura del pico (Puntos): 16-25; señal de absorbancia: Directo.
    NOTA: velocidad de adquisición de datos se puede aumentar hasta 25 Hz con el fin de mejorar la cobertura de zonas de separación estrechos.
<td> Agua vial Outlet
programa de tiempo método acondicionado
Tiempo (min) Evento Valor Duración vial de entrada vial de salida Resumen comentarios
- Enjuague - Presión 2068 mbar 1.0 min BI: C1 BO: C1 Adelante HCl 0,1 M
- Enjuague - Presión 2068 mbar 2.0 min BI: B1 BO: C1 Adelante
- Enjuague - Presión 2068 mbar 10,0 min BI: E1 BO: C1 Adelante BGE
0.00 Separada - Tensión 15.0 KV 10,0 min BI: D1 BO: D1 0,17 rampa Min, polaridad normal Separar
10.00 Enjuague - Presión 2758 mbar 10,0 min BI: E1 BO: C1 Adelante BGE
20.01 Espere - 0.0 min BI: A1 BO: A1 - consejos de enjuague
Ejecución del programa de tiempo método
Tiempo (min) Evento Valor Duración vial de entrada Resumen comentarios
- Enjuague - Presión 2068 mbar 1.0 min BI: C1 BO: C1 Adelante, Entrada / Salida inc vial 6 HCl 0,1 M
- Enjuague - Presión 2068 mbar 2.0 min BI: B1 BO: C1 Adelante, Entrada / Salida inc 6 vial Agua
- Enjuague - Presión 2068 mbar 4,0 min BI: E1 BO: C1 Adelante, Entrada / Salida inc vial 6 BGE
- Inyectar - Presión 34 mbar 20.0 seg SI: A1 BO: B1 Anular, Adelante inyección de la muestra
- Espere - 0,4 min BI: A1 BO: A1 Entrada / Salida inc vial 6 consejos de lavado
0 Separada - Tensión 15.0 KV 30,0 min BI: D1 BO: D1 0,17 rampa mínima, polaridad normal, de entrada / salida inc vial 6 La separación de la muestra
0,5 Cero automático - - - - - -
30.01 Deja de datos - - - - - -
30.02 Enjuague - Presión 2068 mbar 2.0 min BI: B1 BO: C1 Adelante, Entrada / Salida inc vial 6 Agua
32.03 Espere - 0.0 min BI: A1 BO: A1 Entrada / Salida inc vial 6 consejos de enjuague
32.04 Fin - - - - - Fin
programa de tiempo método shutdown
Tiempo (min) Evento Valor Duración vial de entrada vial de salida Resumen comentarios
- Enjuague - Presión 2068 mbar 1.0 min BI: E6 BO: E6 Adelante HCl 0,1 M
- Enjuague - Presión 2068 mbar 6,0 min BI: F6 BO: F6 Adelante Agua
- Lámpara - Off - - - - - -
- Espere - 0.0 min BI: A1 BO: A1 - consejos de enjuague

Tabla 1: acondicionado, correr y programas de tiempo de apagado.

5. Adquisición de Datos y Procesamiento

  1. Programar el conjunto de la muestra.
    1. Programar el capilar para el acondicionamiento usando el método acondicionado instrumento. Cuando el capilar se utiliza por primera vez, el programa de cuatro repeticiones; de lo contrario programar sólo dos repeticiones del método acondicionado.
    2. Programar las muestras a ser analizadas utilizando el método de funcionamiento del instrumento.
    3. Programar el capilar de almacenamiento mediante el método de apagado del instrumento y repita el procedimiento indicado en el apartado 3.2.22.
  2. Ejecutar el experimento.
  3. Exportar la electropherograms.
  4. Calcular el tiempo de migración y el contenido porcentual de, un principal básicond isoformas ácidas usando integración de la línea de caída vertical del perfil de electroferograma.

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Representative Results

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La Figura 2 muestra el perfil de corriente eléctrica típica de un EACA 200 mM, acetato de litio 30 mM, pH 4,8 BGE con muestra de anti-TNFa mAb diluido con tampón de Tris (50 mM, pH 8,0). Como se puede observar, la corriente es estable durante todo el análisis y puede oscilar entre los valores de 30 a 35 mu. Figura 3 muestra el electroferograma CZE de una muestra en blanco en el que el pico detectado se corresponde con el patrón interno de histamina. Se espera para la histamina para tener un tiempo de migración de 3.7 a 4.1 min. Figura 4 muestra el electroferograma CZE de anticuerpos anti TNF-mAb. Como puede observarse, el pico principal está precedido y seguido por picos de intensidad más pequeño. Ya que la separación se lleva a cabo en virtud de polaridad normal (es decir, de positivo a negativo), el análisis revela isoformas básicas (mAb variantes con carga positiva) que migran más rápidamente y isoformas ácidas (mAb variantes con carga negativa) la migración más lenta que la isoforma principal.

Figura 2
Figura 2: Perfil de la corriente eléctrica de un ensayo normal CZE. La corriente BGE es estable en torno a 30 mu cuando la muestra mAb se diluye con tampón de Tris (50 mM, pH 8,0). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: CZE electroferograma de la muestra en blanco. Tenga en cuenta que no hay picos se detectan aparte de la del estándar interno de histamina. AU = unidades de absorbancia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

tienda "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 4
Figura 4: la heterogeneidad físico-química de anticuerpos anti-TNFa mAb determinado por CZE. Esta muestra se compone de isoformas básicas, principal y ácidos. El recuadro muestra una vista ampliada de las variantes se resolvieron mediante CZE. AU = unidades de absorbancia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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En este tutorial, destacamos la importancia de las prácticas adecuadas cuando se realizan los análisis de CZE de anticuerpos monoclonales con el fin de aumentar la probabilidad de tener éxito. Sin embargo, cuando se utiliza CZE de forma rutinaria, los problemas surgen inevitablemente 12.

Para obtener los mejores resultados, es importante seguir las notas que se incluyeron durante todo el protocolo, ya que ayudarán al analista para superar y resolver problemas de pasos difíciles. Una consideración importante para obtener una resolución óptima en un conjunto dado de condiciones es la correcta preparación de la solución de BGE. Este proceso requiere que tiene un control estricto sobre la fuerza iónica, de los agentes de tamponamiento concentración de aditivos no de tamponamiento y el pH. En general, el sistema de la CE requiere cuidado y atención al detalle. Se puede dañarse fácilmente si cualquier paso en relación con la limpieza del sistema o el montaje se ignora.

El presente método considera la utilización de un capilar neutral. A diferencia de los capilares de sílice fundido desnudos,capilares neutros reducen la adsorción de proteínas sobre la pared interior capilar, mejorando así la eficiencia de la separación, la precisión y la repetibilidad 9. Sin embargo, su uso está limitado por la cantidad de inyecciones que se puede realizar. En nuestra experiencia, 120 a 150 inyecciones pueden llevarse a cabo sin efecto sobre la resolución debido a la degradación progresiva de la capa interior. Una vez que el capilar se ha alcanzado este límite, se requerirá una nueva capilar.

Otros protocolos se han reportado para el análisis de la heterogeneidad fisicoquímica de mAbs por CZE, que incluyen el uso de capilares permanently- y dinámicamente con recubrimiento de 13,14. Sin embargo, estos estudios proponen la aplicación de un conjunto fijo de condiciones para analizar la amplia diversidad de mAbs. En contraste con los métodos existentes, creemos que el rendimiento óptimo sólo puede lograrse mediante la adaptación de las condiciones experimentales. Por ejemplo, el protocolo que se presenta aquí se ha utilizado y se ajusta en elpasado para analizar la heterogeneidad isoforma de otros cuatro anticuerpos monoclonales diferentes y un fragmento de mAb 10. Con el fin de adaptar este protocolo para evaluar otros anticuerpos monoclonales, se recomienda la modulación de la fuerza iónica y pH BGE según la diversidad variantes y el punto isoeléctrico de la molécula que va a analizarse.

Nuevas medidas después de dominar esta técnica deben incluir la evaluación de la eficacia del método. Los parámetros tales como la selectividad y capacidad de repetición (en términos de la desviación estándar relativa de tiempo de migración y el porcentaje de área) deben ser probados con el fin de confirmar que el método es adecuado para el uso previsto.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glacial acetic acid Tecsiquim AT0035-7
ACS grade hydrochloric acid J.T. Baker 9535-05
Histamine dihydrochloride Fluka 53300
(Hydroxypropyl) methyl cellulose  Fluka 09963
Lithium acetate Sigma-Aldrich 517992
6-Aminocaproic acid Sigma-Aldrich A2504
eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,  pH 8 Beckman Coulter 477427
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System Beckman Coulter A66528
eCAP Neutral capillary  Beckman Coulter 477441
Vial, Micro, 200 µl Beckman Coulter 144709
Universal Vial Caps Beckman Coulter A62250
Universal Vials Beckman Coulter A62251
Cable, Optics, UV/Vis Beckman Coulter 144093
UV/Vis Detector Module Beckman Coulter 144733
Cartridge Assembly Kit, Blank Beckman Coulter 144738

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References

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Espinosa-de la Garza, C. E., Salazar-Flores, R. D., Pérez, N. O., Flores-Ortiz, L. F., Medina-Rivero, E. Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary. J. Vis. Exp. (119), e55082, doi:10.3791/55082 (2017).More

Espinosa-de la Garza, C. E., Salazar-Flores, R. D., Pérez, N. O., Flores-Ortiz, L. F., Medina-Rivero, E. Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary. J. Vis. Exp. (119), e55082, doi:10.3791/55082 (2017).

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