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Biochemistry

使用中性毛细管单克隆抗体亚型的毛细管电泳分离

doi: 10.3791/55082 Published: January 16, 2017
* These authors contributed equally

Introduction

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单克隆抗体(mAbs)是生物治疗性蛋白质与由于其充当针对多种慢性和变性疾病1容量越来越大的兴趣。像其他生物分子,单克隆抗体很容易在其生命周期的各个阶段要经历数理化修改( 从合成到最终产品)。这样的修饰包括,但不限于:脱酰胺,糖基化,氧化,环化,异构化,聚集和蛋白水解切割2。因此,需要能够解决固有亚型的分析技术来监测单抗异质性和稳定性,以便建立质量标准。

毛细管电泳(CE)是outinside充满背景电解质(BGE)一个狭窄的石英管(微米范围)进行高性能的分离技术。在一个电场的应用(高达30,000 V),带电荷的分子对朝带相反电荷( 电驱动的分离)的电极迁移。在CE使用高电压的允许快速分析和提高效率,这是优于传统的凝胶电泳。毛细管区带电泳(CZE)是在生物制药行业常规地用于产品质量评估3-9一个基于CE的技术。不像CE的其它模式( 例如 ,毛细管凝胶电泳,毛细管等电聚焦)或基于色谱的方法,CZE可以不使用变性剂或固相接口来进行的,从而允许接近其天然状态10的mAb的内在非均质性的分析。单克隆抗体同种型的CZE分离覆盖有亲水性聚合物(中性毛细管)一个熔融石英毛细管的内部发生,并且是根据它们不同的电泳迁移率,这是由电荷,质量,尺寸和形状(或流体力学体积)11排除。单抗部分被检测到时,它们被动员并通过检测窗口,这是由紫外线(UV)吸收检测器在214nm 4感测到的。

成功实施此分析技术将取决于适当注意细节之前和在实验过程中。反之,就增加了成本和时间进行分析,最终导致恒定失败和挫折。

在这里,我们提出了一个一步一步的指导,由捷克通过解决方案和样品,CE系统,设置仪器方法,数据采集的制剂的制备的详细解释,进行单抗异质性的一个成功的分析,以及的处理。对于本教程的目的,重组完全人源抗肿瘤坏死因子α(抗TNFα)单克隆抗体作为蛋白质模式;但是,这个协议可以轻松定制审议短暂修改其他蛋白质的分析。一个dditionally,提出了若干建议,以减轻提出的潜在问题。鼓励读者将严格按照该协议,以接替将增加的可能性。

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Protocol

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1.溶液的制备

  1. 准备BGE解决方案。
    1. 制备0.05%组成的溶液100毫升(M / V)羟丙基甲基纤维素(HPMC),200mM的ε氨基正己酸(EACA)和30毫摩尔乙酸锂。
      注:由于HPMC是一种粘弹性聚合物,倒出粉末放入玻璃烧杯中,加水80毫升,最后加入搅拌棒。继续添加其余试剂为常。处理醋酸锂的时候,因为它会导致眼睛不适戴安全防护眼镜。
    2. 调节至pH值4.8±0.1,用50%(体积/体积)乙酸。使该溶液稳定5分钟,并根据需要进行调整。
    3. 加水以弥补至100ml在容量瓶的最终体积。
    4. 通过用0.2μm孔径的亲水性膜过滤。
    5. 保存在2-8℃下7天。
  2. 制备内标。
    1. 准备1毫升的一个的1%(M / V)组胺组成的溶液。
    2. 通过用0.2μm孔径的亲水性膜过滤。
    3. 保存在2-8℃下1天。

2.样品制备

  1. 制备180微升用Tris缓冲液(50mM三(羟甲基)氨基甲烷,pH 8.0)中以1毫克/毫升的最终浓度稀释的mAb的样品。
  2. 加入20μl的1%(M / V)组胺。
  3. 混合,并在1000 xg离心离心5秒。
  4. 放置一个微型瓶通用瓶内。
  5. 样品输送到微瓶和盖子的普遍小瓶。为了避免引入任何气泡向上分配的样本。
  6. 保存在2-8℃下1天。
  7. 将通用瓶(含样品溶液微小瓶)在样品入口盘。

3.准备CE系统。

  1. CE系统的清洗。
    注:次行为是过程每周至少一次,以避免从灰尘和碎屑积聚衍生电流泄漏。然而,根据不同的应用( 例如 ,使用一个BGE的具有增加的粘度或高盐浓度,增加粘度的样品)电极和开口杆,可能需要更频繁地清洁,以防止交叉污染和样品残留。
    1. 关闭CE仪器的电源开关,打开前门。
    2. 清洁样品盖的表面,样品保持系统(样品和缓冲液盘),墨盒盖,夹杆,接口模块和电极沾水擦拭无纺布。以重复该过程的乙醇蘸抹,使用前干燥。
    3. 冲洗打开杆用清水彻底。清洁其表面用无纺布擦拭。与重复此过程乙醇浸湿擦拭,并在安装前干燥。
    4. 清洁光缆小心的两端LY用蘸水的超细纤维布。重复该过程用乙醇湿布。
  2. 盒组件。
    1. 从包装袋中取出一个新的中性毛细管(50微米内径)。
    2. 大盘回落毛细管保护管到工作台的一端。解开,整顿和拉毛细管出管。
    3. 粘一片带或纸到工作台和添加测量标记如下:长度到检测器(30厘米),毛细管窗口(0.3厘米)和长度,所述出口端(10厘米)( ,总40.2厘米长度30.0厘米有效长度)。
    4. 对齐毛细管窗口以在参考纸0.2 cm度量标记。胶带固定毛细管和标记毛细管结束测量标志外2毫米。
    5. 切在毛细管入口端在一个单一的直线运动用的裂解石的冲水边缘的保护帽(从窗口最远的一端)。
      1. 浸入毛细管端插入,以避免到毛细管内涂层永久损坏充满水的封端普遍小瓶中。重复此过程的每个毛细管端被暴露于环境的时间超过1分钟的时间。
    6. 插入毛细管入口端插入暗盒的出口侧。
    7. 推,并通过暗盒必要拉毛细管,直到毛细管窗口居中于盒窗口。
    8. 插入孔插塞(100微米×200微米)到盒窗口。
      注:确认当暴露于光的白色光源的白色光通过的窗口。如果通过通过的光具有褐色外观,根据需要调整。
    9. 插入所述毛细管插入预形成的冷却剂管,用于为40.2厘米的总毛细管长度(预装油管螺母,垫圈和O形环在该顺序两端)。
    10. 通过COOLAN推毛细管根据需要,直到毛细管出现在管的另一侧部T管材。
    11. 将冷却剂管导入盒的出口侧的端部,并拧紧油管螺母。
    12. 插入毛细管入口端插入暗盒的入口侧。
    13. 推,并通过暗盒必要拉毛细管,直到毛细管出现在盒的入口侧。
    14. 将冷却剂管导入盒的入口侧的端部,并拧紧油管螺母。
    15. 切在在一个单一的直线移动所述毛细管出口端(从窗口最靠近端)在使用切割石材的冲水边缘的保护帽。
    16. 将密封固定夹在毛细管两端并按下,使其完全到位。目视检查毛细管末端。如果不连,重复上述步骤。
    17. 放置在工作台上的边缘毛细管长度的模板。
    18. 将朝下AG墨盒ainst毛细管长度模板和对准毛细管模板上的参考线结束。如果毛细管测量标记(见3.2.4)不与基准线对齐,根据需要调整。
    19. 靠住毛细管长度模板毛细管和使用的模板上的参考线下方的切割石头2mm左右齐平边缘切割毛细管的两端。
    20. 目视检查毛细管用放大镜结束。如果毛细管末端不顺畅,使用软面切割石材的光泽他们。
    21. 将光圈O型圈到使用O型圈插入工具孔塞孔。
    22. 立即用插入到小瓶毛细管两端安装装满水到盒壳体和地点盒封万向小瓶入情况。对于短期和长期储存在保持2-8℃。
  3. 缓冲盘的制备。
    1. 填写并放置封顶UNIVERS人小瓶在缓冲器入口和出口托盘( 图1)。与样本的数目,根据在泳道2,3,4和5重复瓶位置进行分析,将一个车道每六个样品注射。
      注:避免以防止电流泄漏润湿瓶盖。

图1
图1:位置和填写缓冲入口和出口托盘通用小瓶的水平。填充量:1/1 = 1400μL,3/4 = 1300μL和1/2 = 1000微升。缩写:W =水,盐酸= 0.1M盐酸。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. CE系统组件装配。
    1. 安装UV检测器。
    2. 安装打开杠杆按成接口块。
    3. 安装光纤电缆。插入相应的结束夹栏,并按住两端,按顺时针方向旋转。另一端连接到UV检测器。
      注意:小心使用光缆在此过程中,因为弯曲可能导致其断裂。
    4. 地方样品和缓冲液盘插入样品保持系统和捕捉到的位置。
    5. 将毛细管盒插入接口模块,并同时按下两端的夹杆,拧紧旋钮。

4.仪器方法建立

  1. 电压,最大:使用以下参数和表1所述创建调理,运行和关闭的仪器方法30.0千伏;目前,最大:300.0μA;墨盒温度:20.0℃;样品储存温度:10.0℃; UV检测器的初始条件:波长:214纳米;数据速率:4赫兹;过滤器:正常;峰宽(分):16-25;吸光度信号:直接。
    注意:数据采集速率可以为了提高窄分离区的覆盖范围提高到25赫兹。
<TD>水出口小瓶
调理方法时间程序
时间(min) 事件 为期 进瓶 出口小瓶 概要 注释
- 冲洗 - 压力 2068毫巴 1.0分钟 BI:C1 BO:C1 前锋盐酸0.1M的
- 冲洗 - 压力 2068毫巴 2.0分 BI:B1 BO:C1 前锋
- 冲洗 - 压力 2068毫巴 10.0分钟 BI:E1 BO:C1 前锋 BGE
0.00 独立 - 电压 15.0 KV 10.0分钟 BI:D1 BO:D1 0.17敏斜坡,正极性分离
10.00 冲洗 - 压力 2758毫巴 10.0分钟 BI:E1 BO:C1 前锋 BGE
20.01 等待 - 0.0分 BI:A1 BO:A1 - 冲洗提示
运行方法时间程序
时间(min) 事件 为期 进瓶 概要 注释
- 冲洗 - 压力 2068毫巴 1.0分钟 BI:C1 BO:C1 前进,输入/输出小瓶INC 6 盐酸0.1M的
- 冲洗 - 压力 2068毫巴 2.0分 BI:B1 BO:C1 前进,输入/输出小瓶INC 6
- 冲洗 - 压力 2068毫巴 4.0分 BI:E1 BO:C1 前进,输入/输出小瓶INC 6 BGE
- 注射 - 压力 34毫巴 20.0秒 SI:A1 BO:B1 覆盖,前进进样
- 等待 - 0.4分 BI:A1 BO:A1 输入/输出小瓶INC 6 清洗提示
0 独立 - 电压 15.0 KV 30.0分钟 BI:D1 BO:D1 0.17敏斜坡,正极性,输入/输出小瓶INC 6 样品分离
0.5 自动归零 - - - - - -
30.01 停止数据 - - - - - -
30.02 冲洗 - 压力 2068毫巴 2.0分 BI:B1 BO:C1 前进,输入/输出小瓶INC 6
32.03 等待 - 0.0分 BI:A1 BO:A1 输入/输出小瓶INC 6 冲洗提示
32.04 结束 - - - - - 结束
关机方法时间程序
时间(min) 事件 为期 进瓶 出口小瓶 概要 注释
- 冲洗 - 压力 2068毫巴 1.0分钟 BI:E6 BO:E6 前锋盐酸0.1M的
- 冲洗 - 压力 2068毫巴 6.0分 BI:F6 BO:F6 前锋
- 灯 - ​​关 - - - - - -
- 等待 - 0.0分 BI:A1 BO:A1 - 冲洗提示

表1:空调,运行和停机时间程序。

5.数据采集与处理

  1. 程序中的样本集。
    1. 程序使用调节仪器方法调理毛细管。当毛细管用于第一时间,节目四次重复;否则程序只有两个重复的调理方法。
    2. 在正在运行的仪器方法的程序要分析的样本。
    3. 编程为使用关断仪器方法存储毛细管,并重复第3.2.22所示的过程。
  2. 运行实验。
  3. 导出电泳。
  4. 计算迁移时间和基本的,主一个的百分含量第二酸性亚型使用电泳型材垂直落差线整合。

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Representative Results

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图2示出一个200毫EACA,30mM乙锂的典型电电流分布,pH值4.8 BGE与用Tris缓冲液(50mM,pH 8.0)中稀释的抗TNFα单克隆抗体样品。如可以观察到的,当前是整个分析稳定和可以为30至35微安值之间振荡。 图3示出一个空白样品的CZE电泳,其中所检测的峰对应于组胺内标。预计对组胺为具有3.7至4.1分的迁移时间。 图4显示抗TNFα单克隆抗体的CZE电泳。如可以注意到,主峰之前和之后由较小强度的峰。因为分离是正常极性( ,从正到负)下进行,该分析揭示了基本同种型(单抗带正电荷的变体)迁移更快和酸性同工型(单抗带负电荷的变体)迁移比主同种型更慢。

图2
图2:一个典型的捷克运行的电流分布。当单克隆抗体样品用Tris缓冲液(50mM,pH 8.0)中稀释BGE电流是大约30微安稳定。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3:空白样品CZE电泳。需要注意的是,从该组胺内标物没有检测到峰值分开。 AU =吸收单位。 请点击此处查看该图的放大版本。

帐篷“FO: - together.within页保留=”1“> 图4
图4:通过CZE测定抗TNFα单克隆抗体的物理化学异质性。该样本是由基本的,主要的和酸性亚型。插图示出了通过CZE解决变体的放大图。 AU =吸收单位。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

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在本教程中,我们强调的正确实践的重要性,在进行捷克以增加的概率成功单克隆抗体的分析。然而,当CZE是在常规基础上使用的,出现不可避免12的问题。

为了达到最佳效果,遵循纳入整个协议的音符,因为它们将有助于克服和解决困难的步骤分析师是很重要的。一个主要考虑在给定的条件,以获得最佳分辨率是BGE解决方案的正确准备。这个过程需要具有以上缓冲剂,非缓冲添加剂和pH的浓度的离子强度严格控制。总体而言,CE系统需要关怀和对细节的关注。它能如果有关系统的清洗或部件的任何一步,那么很容易损坏。

本方法考虑使用中性毛细管。不同于裸石英毛细管,中性毛细血管减少蛋白质吸附到毛细管内壁,从而提高分离效率,精度和可重复性9。然而,它的用途是由能够进行注射量的限制。在我们的经验,120至150注射可以在不分辨率效应进行由于内涂层的逐步退化。一旦毛细管已经达到此限制,新的毛细管将需要。

其它协议已经报道了通过CZE,其中包括使用permanently-和动态涂层毛细管13,14的单克隆抗体的物理化学异质性的分析。然而,这些研究提出一套固定的条件的应用程序来分析mAbs的广泛的多样性。在对比现有方法,我们相信,最佳表现只能通过调整实验条件来实现。例如,这里提出的协议已被使用,并在调整后的过去分析等4个不同的单克隆抗体亚型的异质性和单克隆抗体片段10。为了适应这个协议来评估其它的mAbs,建议进行分析,根据所述变体的多样性和该分子的等电点的BGE离子强度和pH调制。

掌握这一技术后,进一步的措施应包括方法性能的评估。参数,如选择性和可重复性(在迁移时间和面积百分比相对标准偏差计)必须以确认该方法适合于预期的用途进行试验。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glacial acetic acid Tecsiquim AT0035-7
ACS grade hydrochloric acid J.T. Baker 9535-05
Histamine dihydrochloride Fluka 53300
(Hydroxypropyl) methyl cellulose  Fluka 09963
Lithium acetate Sigma-Aldrich 517992
6-Aminocaproic acid Sigma-Aldrich A2504
eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,  pH 8 Beckman Coulter 477427
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System Beckman Coulter A66528
eCAP Neutral capillary  Beckman Coulter 477441
Vial, Micro, 200 µl Beckman Coulter 144709
Universal Vial Caps Beckman Coulter A62250
Universal Vials Beckman Coulter A62251
Cable, Optics, UV/Vis Beckman Coulter 144093
UV/Vis Detector Module Beckman Coulter 144733
Cartridge Assembly Kit, Blank Beckman Coulter 144738

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References

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Espinosa-de la Garza, C. E., Salazar-Flores, R. D., Pérez, N. O., Flores-Ortiz, L. F., Medina-Rivero, E. Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary. J. Vis. Exp. (119), e55082, doi:10.3791/55082 (2017).More

Espinosa-de la Garza, C. E., Salazar-Flores, R. D., Pérez, N. O., Flores-Ortiz, L. F., Medina-Rivero, E. Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary. J. Vis. Exp. (119), e55082, doi:10.3791/55082 (2017).

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