This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.
प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) रोग मॉडलिंग और पुनर्योजी उपचार के लिए महान वादा पकड़। हम पहले episomal वैक्टर (ईवी) के उपयोग परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (पीबी एमएनसी) से एकीकरण से मुक्त IPSCs उत्पन्न करने की सूचना दी। Episomal इस्तेमाल किया वैक्टर डीएनए एपस्टीन बर्र (ईबी) वायरस से oriP और EBNA1 तत्व है, जो क्रमश: स्तनधारी कोशिकाओं में plasmids की प्रतिकृति है और लंबी अवधि के लिए retainment अनुमति देते हैं, के साथ शामिल plasmids हैं। आगे अनुकूलन के साथ, IPSC कालोनियों के हजारों परिधीय रक्त के 1 एमएल से प्राप्त किया जा सकता है। उच्च reprogramming क्षमता प्राप्त करने के लिए दो महत्वपूर्ण कारक हैं: 1) एक 2A का उपयोग "आत्म दरार" पेप्टाइड OCT4 और Sox2 से जोड़ने के लिए, इस प्रकार दो कारकों की equimolar अभिव्यक्ति को प्राप्त; 2) दो वैक्टर का उपयोग MYC और KLF4 व्यक्तिगत रूप से व्यक्त करते हैं। यहाँ हम एकीकरण-मुक्त IP पैदा करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णनवयस्क परिधीय रक्त के नमूनों से अनुसूचित जाति। के रूप में अवशिष्ट episomal plasmids पांच मार्ग के बाद undetectable हैं उत्पन्न IPSCs एकीकरण से मुक्त हैं। हालांकि reprogramming दक्षता सेंडाइ वायरस (एसवी) वैक्टर के बराबर है, ईवी plasmids काफी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एसवी वैक्टर की तुलना में अधिक किफायती हैं। यह सस्ती ईवी reprogramming प्रणाली पुनर्योजी चिकित्सा में नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए क्षमता रखती है और एकीकरण से मुक्त mesenchymal स्टेम कोशिकाओं, तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं, आदि के लिए पंजाब बहुराष्ट्रीय कंपनियों के प्रत्यक्ष reprogramming के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है।
कई प्रतिलेखन कारक के लिए मजबूर करने के बाद अभिव्यक्ति (यानी OCT4, Sox2, MYC और KLF4), दैहिक कोशिकाओं प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs), जो पुनर्योजी चिकित्सा और सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी 1-3 में अनुप्रयोगों के लिए महान वादा धारण करने के लिए reprogrammed किया जा सकता है। तिथि करने के लिए, विविध तरीकों 4-7 reprogramming की सफलता की दर बढ़ाने के लिए विकसित किया गया है। वायरल वैक्टर प्रेरित reprogramming व्यापक रूप से IPSCs के कुशल उत्पादन के लिए प्रयोग किया जाता है क्योंकि वायरल एकीकरण के लिए एक उच्च स्तरीय, reprogramming कारकों के स्थिर अभिव्यक्ति की ओर जाता है। हालांकि, सेल जीनोम में वेक्टर डीएनए की स्थायी एकीकरण इन्सर्शनल म्युटाजेनेसिस 5 उत्पन्न हो सकता है। इसके अलावा, reprogramming कारकों की अपर्याप्त निष्क्रियता IPSCs भेदभाव 8 को परेशान कर सकता है। जैसे, reprogramming कारकों के एकीकरण के बिना IPSCs का उपयोग विशेष रूप से सेल थेरेपी अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए आवश्यक है।
<p class="jove_content"> Episomal वैक्टर (ईवीएस) व्यापक रूप से एकीकरण से मुक्त IPSCs की पीढ़ी में उपयोग किया जाता है। सबसे अधिक इस्तेमाल किया ईवी दो तत्वों, वायरल प्रतिकृति (oriP) और ईबी परमाणु प्रतिजन 1 (EBNA1) की उत्पत्ति, एपस्टीन बर्र (ईबी) वायरस 9 से युक्त एक प्लाज्मिड है। जबकि EBNA1 तत्व गुणसूत्र डीएनए कि मेजबान सेल के विभाजन के दौरान episome के विभाजन के लिए अनुमति देता है oriP युक्त प्लास्मिड डीएनए tethers oriP तत्व, स्तनधारी कोशिकाओं में प्लाज्मिड प्रतिकृति को बढ़ावा देता है। सेंडाइ वायरस (एसवी) और आरएनए अभिकर्मक सहित अन्य एकीकरण से मुक्त दृष्टिकोण, की तुलना में, ईवीएस कई फायदे 5,6,10 के पास है। प्लास्मिड डीएनए के रूप में, ईवीएस आसानी से उत्पादन किया जा सकता है और घर में संशोधित, उन्हें बेहद किफायती बनाने। इसके अलावा, ईवी साथ reprogramming एक कम श्रम गहन प्रक्रिया के बाद से ईवीएस के साथ एक एकल अभिकर्मक IPSC पीढ़ी के लिए पर्याप्त है, जबकि कई आरएनए transfections सफल reprogramming के लिए आवश्यक हैं।डीermal fibroblasts कई reprogramming अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, त्वचा बायोप्सी न केवल एक आक्रामक और दर्दनाक प्रक्रिया है, लेकिन reprogramming के लिए पर्याप्त मात्रा में कोशिकाओं के विस्तार के लिए भी समय लेने वाली है। अधिक चिंता का विषय, वयस्क दाताओं की त्वचा कोशिकाओं को अक्सर लंबे समय तक पराबैंगनी प्रकाश विकिरण, जो ट्यूमर के साथ जुड़े इस प्रकार की त्वचा fibroblasts 11,12 से निकाली गई IPSCs के लिए आवेदन पत्र सीमित म्यूटेशन को जन्म दे सकती को उजागर किया गया है। हाल ही में, यह बताया गया है कि सामान्य मानव त्वचा कोशिकाओं दैहिक म्यूटेशन और त्वचीय स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा के प्रमुख ड्राइवर के सबसे सहित कई कैंसर जीन, संचित, मजबूत सकारात्मक चयन 13 के तहत कर रहे हैं।
त्वचा fibroblasts के विपरीत, परिधीय रक्त (पंजाब) कोशिकाओं reprogramming के लिए कोशिकाओं का एक बेहतर स्रोत है क्योंकि 1) रक्त कोशिकाओं को आसानी से एक न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया के माध्यम से प्राप्त की जा सकती हैं, 2) परिधीय रक्त कोशिकाओं hematopoietic स्टेम कोशिकाओं की संतान हैंअस्थि मज्जा में रहने वाले, इस प्रकार हानिकारक विकिरण से रक्षा की। परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (पीबी एमएनसी) Ficoll-hypaque (1.077 g / एमएल) का उपयोग कर एक साधारण ढाल centrifugation निम्नलिखित बफी कोट परत से एक घंटे में एकत्र किया जा सकता है। प्राप्त पीबी बहुराष्ट्रीय कंपनियों लिम्फोसाइटों, monocytes और कुछ Hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (HPCs) 14 से बना रहे हैं। हालांकि मानव टी lymphocytes, पंजाब में प्रमुख प्रकार की कोशिकाओं में से एक हैं परिपक्व टी कोशिकाओं टी सेल रिसेप्टर (TCR) जीन की rearrangements होते हैं और एक अक्षुण्ण जीनोम इस प्रकार अनुप्रयोगों 15,16 के लिए अपनी क्षमता को सीमित करने की कमी है। हालांकि, IPSC पीढ़ी के माध्यम से टी कोशिकाओं की कायाकल्प chimeric एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) टी सेल थेरेपी 17-19 में संभावित आवेदन कर सकते हैं। इसकी तुलना में, HPCs एक अक्षुण्ण जीनोम है और आसानी से reprogrammable हैं। हालांकि केवल 0.01 – परिधीय संचलन में 0.1% की कोशिकाओं HPCs हैं, इन कोशिकाओं को विस्तारित किया जा सकता पूर्व एर्य्थ्रोइद माध्यम में विवो कि erythr के प्रसार के पक्ष मेंOID पूर्वज 14 कोशिकाओं।
हमारे पिछले अध्ययन में, हम यामानाका कारकों (OCT4, Sox2, MYC और KLF4) है, जो पंजाब reprogramming दक्षता 20 में एक 10x वृद्धि के परिणामस्वरूप के अलावा कारक बीसीएल-एक्सएल का इस्तेमाल किया। बीसीएल-एक्सएल भी BCL2L1 के रूप में जाना जाता है, कोशिका मृत्यु का एक शक्तिशाली अवरोध करनेवाला, caspases 21,22 की सक्रियता के द्वारा बाधा है। लेकिन, बीसीएल-एक्सएल भी pluripotency 21,22 बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं। हाल ही में, हम आगे की अलग-अलग दो वैक्टर, जो reprogramming दक्षता 23 में एक लगभग 100x वृद्धि हो जाती है साथ MYC और KLF4 व्यक्त करने से हमारे ईवी reprogramming प्रणाली अनुकूलित है। स्वस्थ दाताओं से 0.5% – इस विधि का प्रयोग, reprogramming दक्षता, अभिकर्मक पर सेल नंबर शुरू करने से विभाजित कॉलोनी संख्या से परिभाषित 0.2 है। इस प्रकार के रूप में, हम पंजाब से एकीकरण से मुक्त IPSCs पैदा करने के लिए विस्तृत प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन है।
स्वस्थ दाताओं या रोगियों से रक्त के नमूने हासिल करना यह बुनियादी अनुसंधान और नैदानिक सेल थेरेपी के लिए एक आकर्षक सेल स्रोत बना सुविधाजनक और noninvasive है। यहाँ हम परिधीय रक्त के नमूनों से एकीकरण से मुक्त IP…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Ministry of Science and Technology of China (2015CB964902, 2013CB966902 and 2012CB966601), the National Natural Science Foundation of China (81500148, 81570164 and 81421002), the Loma Linda University School of Medicine GCAT grant (2015), and Telemedicine and Advanced Technology Research Center (W81XWH-08-1-0697).
Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma | S0192 | Store at 4 °C |
Human stem cell factor (SCF) | Peprotech | 300-07 | Store at -20 or -80°C |
Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | AF-200-03 | Store at -20 or -80°C |
Eryrthropoietin (EPO) | Peprotech | 100-64 | Store at -20 or -80°C |
Insulin growth factor-1 (IGF-1) | Peprotech | 100-11 | Store at -20 or -80°C |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | Store at -20 or -80°C |
1-thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | Store at -20 or -80°C |
DMEM/F12 medium | Gibco | 112660-012 | Store at 4 °C |
L-glutamine (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C |
Non-essential amino acids solution (100x) | Gibco | 11140-050 | Store at 4 °C |
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Peprotech | 100-18B | Store at -20 or -80°C |
ITS (100x) | Gibco | 41400-045 | Store at 4 °C |
Ascorbic acid | Sigma | 49752 | Store at -20 °C |
DMEM (high glucose) medium | Thermo | SH30243.01B | Store at 4 °C |
FBS | Hyclone | SV30087.01 | Store at -40 °C |
Ficoll | GE Healthcare, SIGMA | 17-5442-02 | Store at RT |
Trehalose | Sigma | T9531 | Store at 4 °C |
DMSO | Sigma | D2650 | Store at RT, protect from light |
Endofree Plasmid Maxi Kit(10) | Qiagen | 12362 | Store at RT |
IMDM | Gibco | 21056-023 | Store at 4 °C |
Human CD34+ Cell Nucleofection Kit | Lonza | VPA-1003 | Store at RT, nucleofection buffer and supplement buffer should be stored at 4 °C |
Sodium butyrate | Sigma | B5887 | Store at -20 or -80°C |
ROCK inhibitor Y27632 | STEMGENT | 04-0012-10 | Store at -20 °C |
Essential 8 basal medium (E8) | Gibco | A15169-01 | Store at 4 °C, the supplement should be stored at -20 or -80°C |
Matrigel | BD | 354277 | Store at -20 or -80°C |
2x EasyTaq PCR SuperMix(+dye) | TransGen Biotech | AS111 | Store at -20 °C |
Cell detachment solution | STEMGENT | 01-0006 | Store at -20 °C, Accutase as a cell detachment solution to obtain a single cell suspension |
DAPI | Sigma | D9542-1MG | Store at 4 °C or -20 °C |
Anti-nanog-AF488 | BD | 560791 | Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use |
Anti-OCT4 | abcam | ab19857 | Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use |
AF488 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A21202 | Store at 4 °C, secondary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/500 when use |
PE anti-human TRA-1-60-R Antibody | Biolegend | 330610 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
eFluor 570-conjugated anti-SSEA4 | eBioscience | 41-8843 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
Isotype antibody | eBioscience | 11-4011 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
Alkaline Phosphatase Detection Kit | SiDanSai | 1102-100 | Store at 4 °C |
Genomic DNA Extraction Kit | TIANGEN | DP304-02 | Store at RT |
Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | Store at RT |
Flow cytometry cell analyzer | BD | LSRII | for flow cytometry analysis |
Spinning disk confocal microscope (SDC) | PerkinElmer | UltraVIEW VOX | for confocal imaging |
Nucleofection device | Lonza | Nucleofector 2b | for the nucleofection of PB MNC |
ImageQuant LAS-4010 | GE | take photo of AP staining in bulk |