This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.
Indusert Pluripotent stamceller (iPSCs) holder store løftet for sykdom modellering og regenerativ behandling. Vi har tidligere rapportert ved bruk av episomale vektorer (EV) for å generere integrasjonsfrie iPSCs fra perifert blod mononukleære celler (MNC) PB. De episomale vektorer som anvendes er DNA-plasmider innlemmet med oriP og EBNA1 elementer fra Epstein-Barr (EB) virus, som gir mulighet for replikasjon og langvarig bibeholdelse av plasmider i pattedyrceller, respektivt. Med ytterligere optimalisering, kan tusenvis av IPSC kolonier oppnås fra 1 ml av perifert blod. To viktige faktorer for å oppnå høy effektivitet omprogrammering er: 1) bruk av et 2A "selv-spaltning" peptid for å koble OCT4 og SOX2, og dermed oppnå ekvimolar ekspresjon av de to faktorer; 2) bruk av to vektorer for å uttrykke MYC og KLF4 individuelt. Her beskriver vi en steg-for-steg-protokollen for å generere integrering fritt iPSC'er fra voksne perifere blodprøver. De genererte iPSCs er integrering fritt som rest episomale plasmider er umulig å oppdage etter fem passasjer. Selv om omprogrammering effektivitet er sammenlignbar med Sendai-virus (SV) vektorer, EV plasmider er betydelig mer økonomisk enn de kommersielt tilgjengelige SV vektorer. Denne rimelige EV omprogrammering system har potensial for kliniske applikasjoner i regenerativ medisin og gir en tilnærming for direkte omprogrammering av PB MNCs til integrering fritt stamceller, nevrale stamceller, osv.
Etter tvunget uttrykk for flere transkripsjonsfaktorer (Dvs. OCT4, SOX2, MYC og KLF4), kan somatiske celler omprogrammeres til indusert Pluripotent stamceller (iPSCs), som holder store løftet for applikasjoner i regenerativ medisin og celle replacement therapy 1-3. Hittil har ulike metoder blitt utviklet for å øke suksessraten for omprogrammering 4-7. Virale vektorer-indusert omprogrammering er mye brukt for effektiv generering av iPSCs, fordi viral integrering fører til et høyt nivå, stabil ekspresjon av de reprogrammerings-faktorer. Imidlertid kan permanent integrering av vektor DNA i cellegenomet indusere insertional mutagenese 5. I tillegg kan utilstrekkelig inaktivering av reprogrammerings faktorer forstyrrer iPSCs differensiering 8. Som sådan, er bruken av iPSCs uten integrering av reprogrammerings faktorer avgjørende, spesielt for bruk i celleterapi anvendelser.
<p class="jove_content"> Episomale vektorer (elbiler) er mye brukt i produksjon av integrasjonsfritt iPSCs. Den mest brukte EV er et plasmid inneholdende to elementer, opprinnelse på viral replikasjon (oriP) og EB Nuclear antigen 1 (EBNA1), fra Epstein-Barr (EB) virus 9. Den oriP element fremmer plasmid replikasjon i pattedyrceller, mens den EBNA1 element platformer den oriP-inneholdende plasmid-DNA til kromosomalt DNA som gjør det mulig for oppdeling av episom under delingen av vertscellen. I forhold til andre integrasjonsfrie tilnærminger, inkludert Sendai Virus (SV) og RNA transfeksjon, elbiler har flere fordeler 5,6,10. Som plasmid DNA, kan elbiler lett produsert og endret i huset, noe som gjør dem svært rimelig. I tillegg omprogrammering med EV er en mindre arbeidskrevende prosess, siden en enkelt transfeksjon med el-biler er tilstrekkelig for IPSC generasjon, mens flere RNA-transfeksjoner er nødvendig for vellykket omprogrammering.Dermal fibroblaster er blitt anvendt i mange studier omprogrammering. Imidlertid er huden biopsi ikke bare en invasiv og smertefull prosess, men også tidkrevende for å utvide cellene til tilstrekkelige mengder for omprogrammering. Av større interesse er det hudceller hos voksne givere ofte vært utsatt for langvarig UV-lysstråling, som kan føre til mutasjoner assosiert med tumorer, og dermed begrense søknadene for iPSCs avledet fra hudfibroblaster 11,12. Nylig har det blitt rapportert at normale menneskelige hudceller samle somatiske mutasjoner og flere kreftgener, inkludert de fleste av de viktigste driverne av kutane plateepitelkarsinom, er under sterk positiv seleksjon 13.
I motsetning til hudfibroblaster, perifert blod (PB) -celler er en foretrukket kilde for celler for omprogrammering fordi 1) blodlegemer kan lett oppnås ved en minimalt invasiv prosess, 2) perifere blodceller er avkommet av hematopoetiske stamcellerbosatt i benmargen, og dermed beskyttet mot skadelig stråling. Perifere blod mononukleære celler (MNC) PB kan samles i en time fra buffy coat-lag etter en enkel sentrifugering ved hjelp av Ficoll-Hypaque (1,077 g / ml). De oppnådde PB MNCer er sammensatt av lymfocytter, monocytter og noen Hematopoetiske progenitorceller (HPCS) 14. Selv om humane T-lymfocytter er en av de store celletyper i PB, modne T-celler inneholder rearrangementer av T-cellereseptoren (TCR) gener og mangler et intakt genom og dermed begrense deres muligheter for anvendelser 15,16. Imidlertid kan foryngelse av T-celler via IPSC generasjon har potensielle bruksområder i kimære antigen reseptor (CAR) T-cellen terapi 17-19. Til sammenligning HPCS har en intakt genom og er lett reprogrammable. Selv om bare 0,01 til 0,1% celler i perifer sirkulasjon er HPCS, kan disse cellene bli utvidet ex vivo i erytroide medium som favoriserer spredning av erythrOID stamceller 14.
I vår forrige undersøkelse, brukte vi den faktoren BCL-XL i tillegg til de Yamanaka faktorer (OCT4, SOX2, MYC og KLF4), noe som resulterte i en 10x økning i PB omprogrammering effektivitet 20. BCL-XL, også kjent som BCL2L1, er en potent hemmer av celledød, ved å inhibere aktivering av kaspaser 21,22. Men, kan BCL-XL også spille en viktig rolle i å opprettholde pluripotency 21,22. Nylig har vi ytterligere optimalisert vårt EV omprogrammering system ved separat å uttrykke MYC og KLF4 med to vektorer, noe som fører til en tilnærmet 100 ganger økning i effektivitet omprogrammering 23. Ved hjelp av denne metoden, omprogrammering effektivitet, definert ved koloni-nummer delt av startcellenummer ved transfeksjon, er 0,2 til 0,5% fra friske donorer. Som følger, beskriver vi den detaljerte eksperimentelle prosedyren for å generere integrering fritt iPSCs fra PB.
Anskaffelse av blodprøver fra friske donorer eller pasienter er praktisk og ikke-invasiv, noe som gjør det til et attraktivt celle kilde for grunnforskning og klinisk celleterapi. Her har vi beskrevet en protokoll for svært effektiv generasjon av integrasjonsfritt iPSCs fra perifere blodprøver. Dette reproduserbar og rimelig tilnærming bør gagne IPSC feltet.
Vi har rapportert at det er to viktige faktorer ansvarlig for svært effektiv PB omprogrammering 30. En er ekvimolar e…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Ministry of Science and Technology of China (2015CB964902, 2013CB966902 and 2012CB966601), the National Natural Science Foundation of China (81500148, 81570164 and 81421002), the Loma Linda University School of Medicine GCAT grant (2015), and Telemedicine and Advanced Technology Research Center (W81XWH-08-1-0697).
Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma | S0192 | Store at 4 °C |
Human stem cell factor (SCF) | Peprotech | 300-07 | Store at -20 or -80°C |
Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | AF-200-03 | Store at -20 or -80°C |
Eryrthropoietin (EPO) | Peprotech | 100-64 | Store at -20 or -80°C |
Insulin growth factor-1 (IGF-1) | Peprotech | 100-11 | Store at -20 or -80°C |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | Store at -20 or -80°C |
1-thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | Store at -20 or -80°C |
DMEM/F12 medium | Gibco | 112660-012 | Store at 4 °C |
L-glutamine (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C |
Non-essential amino acids solution (100x) | Gibco | 11140-050 | Store at 4 °C |
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Peprotech | 100-18B | Store at -20 or -80°C |
ITS (100x) | Gibco | 41400-045 | Store at 4 °C |
Ascorbic acid | Sigma | 49752 | Store at -20 °C |
DMEM (high glucose) medium | Thermo | SH30243.01B | Store at 4 °C |
FBS | Hyclone | SV30087.01 | Store at -40 °C |
Ficoll | GE Healthcare, SIGMA | 17-5442-02 | Store at RT |
Trehalose | Sigma | T9531 | Store at 4 °C |
DMSO | Sigma | D2650 | Store at RT, protect from light |
Endofree Plasmid Maxi Kit(10) | Qiagen | 12362 | Store at RT |
IMDM | Gibco | 21056-023 | Store at 4 °C |
Human CD34+ Cell Nucleofection Kit | Lonza | VPA-1003 | Store at RT, nucleofection buffer and supplement buffer should be stored at 4 °C |
Sodium butyrate | Sigma | B5887 | Store at -20 or -80°C |
ROCK inhibitor Y27632 | STEMGENT | 04-0012-10 | Store at -20 °C |
Essential 8 basal medium (E8) | Gibco | A15169-01 | Store at 4 °C, the supplement should be stored at -20 or -80°C |
Matrigel | BD | 354277 | Store at -20 or -80°C |
2x EasyTaq PCR SuperMix(+dye) | TransGen Biotech | AS111 | Store at -20 °C |
Cell detachment solution | STEMGENT | 01-0006 | Store at -20 °C, Accutase as a cell detachment solution to obtain a single cell suspension |
DAPI | Sigma | D9542-1MG | Store at 4 °C or -20 °C |
Anti-nanog-AF488 | BD | 560791 | Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use |
Anti-OCT4 | abcam | ab19857 | Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use |
AF488 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A21202 | Store at 4 °C, secondary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/500 when use |
PE anti-human TRA-1-60-R Antibody | Biolegend | 330610 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
eFluor 570-conjugated anti-SSEA4 | eBioscience | 41-8843 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
Isotype antibody | eBioscience | 11-4011 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
Alkaline Phosphatase Detection Kit | SiDanSai | 1102-100 | Store at 4 °C |
Genomic DNA Extraction Kit | TIANGEN | DP304-02 | Store at RT |
Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | Store at RT |
Flow cytometry cell analyzer | BD | LSRII | for flow cytometry analysis |
Spinning disk confocal microscope (SDC) | PerkinElmer | UltraVIEW VOX | for confocal imaging |
Nucleofection device | Lonza | Nucleofector 2b | for the nucleofection of PB MNC |
ImageQuant LAS-4010 | GE | take photo of AP staining in bulk |