This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.
Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) är mycket lovande för sjukdom modellering och regenerativ behandlingar. Vi har tidigare rapporterat användning av episomala vektorer (EV) för att generera integrationsfria iPSCs från perifera mononukleära blodceller (PB MNC). De episomala vektorer som används är DNA-plasmider införlivas med oriP och EBNA1 element från Epstein-Barr (EB) -virus, som möjliggör replikation och långsiktiga kvarhållande av plasmider i däggdjursceller, respektive. Med ytterligare optimering, kan tusentals IPSC kolonier erhållas från 1 ml perifert blod. Två kritiska faktorer för att uppnå hög omprogrammering effektivitet är: 1) användningen av en 2A "självklyvning" peptid att länka Oct4 och Sox2 på så sätt åstadkomma ekvimolär uttryck av de två faktorerna; 2) användningen av två vektorer för att uttrycka MYC och Klf4 individuellt. Här beskriver vi en steg-för-steg-protokoll för att generera integration fritt iPSC från vuxna perifera blodprover. Den genererade iPSCs är integration fritt som rest episomala plasmider är omätbara efter fem passager. Även om omprogrammering effektivitet är jämförbar med den för Sendai-virus (SV) vektorer, EV plasmider är betydligt mer ekonomiskt än de kommersiellt tillgängliga SV vektorer. Detta prisvärda EV omprogrammering systemet har potential för kliniska tillämpningar inom regenerativ medicin och ger en metod för direkt omprogrammering av PB multinationella till integrationsfria mesenkymala stamceller, neurala stamceller, osv.
Efter tvångs uttrycket av flera transkriptionsfaktorer (Dvs. Oct4, Sox2, MYC och Klf4), somatiska celler kan omprogrammeras till inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs), som är mycket lovande för tillämpningar inom regenerativ medicin och cellersättningsterapi 1-3. Hittills har olika metoder utvecklats för att öka andelen framgångsrika omprogrammering 4-7. Virala vektorer-inducerade omprogrammering är allmänt används för effektiv generering av iPSCs, eftersom viral integration leder till en hög nivå och stabil expression av de omprogrammering faktorer. Emellertid kan permanent integrering av vektor-DNA i cellgenomet inducera insertionsmutationer 5. Dessutom kan otillräcklig inaktivering av omprogrammering faktorer störa iPSCs differentiering 8. Som sådan, är användningen av iPSCs utan integration av omprogrammering faktorer viktigt, speciellt för användning i cellterapi applikationer.
<p class="jove_content"> Episomala vektorer (EO) används i stor utsträckning i generering av integrationsfria iPSCs. Det mest använda EV är en plasmid som innehåller två element, beskärning av viral replikation (oriP) och EB Nuclear Antigen 1 (EBNA1), från Epstein-Barr (EB) -virus 9. Den oriP elementet främjar plasmid replikation i däggdjursceller, medan EBNA1 elementet binda den oriP-innehållande plasmid DNA till kromosomalt DNA som möjliggör en uppdelning av episom under uppdelningen av värdcellen. I jämförelse med andra integrationsfria metoder, inklusive Sendai-virus (SV) och RNA-transfektion, elbilar har flera fördelar 5,6,10. Som plasmid-DNA, kan elfordon lätt framställas och modifieras i huset, vilket gör dem extremt prisvärd. Dessutom omprogrammering med EV är en mindre arbetsintensiv process eftersom en enda transfektion med elbilar är tillräcklig för iPSC generation, medan flera RNA-transfektioner är nödvändiga för framgångsrik omprogrammering.DErmal fibroblaster har använts i många omprogrammering studier. Emellertid är hudbiopsi inte bara en invasiv och smärtsam process, men också tidskrävande för att expandera celler till tillräckliga mängder för omprogrammering. Av större betydelse, har hudceller av vuxna donatorer ofta utsatts för långsiktig UV-strålning, vilket kan leda till mutationer associerade med tumörer, vilket begränsar ansökningarna om iPSCs härrör från hudfibroblaster 11,12. Nyligen har det rapporterats att normala humana hudceller ansamlas somatiska mutationer och flera cancergener, inklusive de flesta av de viktigaste drivkrafterna för kutan skivepitelcancer, är under stark positiv selektion 13.
I motsats till hudfibroblaster, perifert blod (PB) celler är en föredragen källa av celler för omprogrammering eftersom 1) blodkroppar kan lätt erhållas genom en minimalt invasiv process, 2) perifera blodceller är avkomman av hematopoietiska stamcellerbosatt i benmärgen, vilket skyddas från skadlig strålning. Perifera mononukleära blodceller (PB MNC) kan samlas i en timme från koncentratskiktet följa en enkel gradient centrifugering med användning av Ficoll-Hypaque (1,077 g / ml). De erhållna PB multinationella består av lymfocyter, monocyter och några hematopoetiska progenitorceller (HPC) 14. Även om humana T-lymfocyter är en av de huvudsakliga celltyperna i PB, mogna T-celler innehåller omlagringar av T-cellreceptorn (TCR) -gener och saknar en intakt genomet vilket sålunda begränsar deras potential för tillämpningar 15,16. Emellertid kan föryngring av T-celler via iPSC generation har potentiella tillämpningar inom chimär Antigen Receptor (CAR) T-cellterapi 17-19. I jämförelse, HPC har en intakt genom och är lätt omprogrammerbara. Även om endast 0,01-0,1% celler i perifera cirkulationen är HPC, kan dessa celler utökas ex vivo i erytroid medium som gynnar spridningen av erythrOID progenitorceller 14.
I vår tidigare studie använde vi faktor BCL-XL utöver Yamanaka faktorer (Oct4, Sox2, MYC och Klf4), vilket resulterade i en ökning av PB omprogrammering verkningsgrad 20 10x. BCL-XL, även känd som BCL2L1, är en potent hämmare av celldöd, genom att hämma aktivering av caspaser 21,22. Men, kan BCL-XL också spela en viktig roll för att upprätthålla pluripotens 21,22. Nyligen har vi ytterligare optimerat vår EV omprogrammering systemet genom att separat uttrycka MYC och Klf4 med två vektorer, vilket leder till en ungefär 100x ökning av omprogrammering effektivitet 23. Med användning av denna metod, omprogrammeringen effektivitet, definierat av koloniantal dividerat med utgångscellantalet vid transfektion, är från 0,2 till 0,5% från friska donatorer. Enligt följande, beskriver vi den detaljerade experimentella förfarandet för generering av integrationsfria iPSCs från PB.
Förvärva blodprov från friska donatorer eller patienter är bekvämt och icke-invasivt, vilket gör det till en attraktiv cellkälla för grundforskning och klinisk cellterapi. Här har vi beskrivit ett protokoll för effektiv generering av integrationsfria iPSCs från perifera blodprover. Detta reproducerbar och prisvärd strategi bör gynna iPSC fältet.
Vi har rapporterat att det finns två viktiga faktorer som ansvarar för effektiv PB omprogrammering 30. En är ekvimolär …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Ministry of Science and Technology of China (2015CB964902, 2013CB966902 and 2012CB966601), the National Natural Science Foundation of China (81500148, 81570164 and 81421002), the Loma Linda University School of Medicine GCAT grant (2015), and Telemedicine and Advanced Technology Research Center (W81XWH-08-1-0697).
Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma | S0192 | Store at 4 °C |
Human stem cell factor (SCF) | Peprotech | 300-07 | Store at -20 or -80°C |
Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | AF-200-03 | Store at -20 or -80°C |
Eryrthropoietin (EPO) | Peprotech | 100-64 | Store at -20 or -80°C |
Insulin growth factor-1 (IGF-1) | Peprotech | 100-11 | Store at -20 or -80°C |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | Store at -20 or -80°C |
1-thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | Store at -20 or -80°C |
DMEM/F12 medium | Gibco | 112660-012 | Store at 4 °C |
L-glutamine (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C |
Non-essential amino acids solution (100x) | Gibco | 11140-050 | Store at 4 °C |
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Peprotech | 100-18B | Store at -20 or -80°C |
ITS (100x) | Gibco | 41400-045 | Store at 4 °C |
Ascorbic acid | Sigma | 49752 | Store at -20 °C |
DMEM (high glucose) medium | Thermo | SH30243.01B | Store at 4 °C |
FBS | Hyclone | SV30087.01 | Store at -40 °C |
Ficoll | GE Healthcare, SIGMA | 17-5442-02 | Store at RT |
Trehalose | Sigma | T9531 | Store at 4 °C |
DMSO | Sigma | D2650 | Store at RT, protect from light |
Endofree Plasmid Maxi Kit(10) | Qiagen | 12362 | Store at RT |
IMDM | Gibco | 21056-023 | Store at 4 °C |
Human CD34+ Cell Nucleofection Kit | Lonza | VPA-1003 | Store at RT, nucleofection buffer and supplement buffer should be stored at 4 °C |
Sodium butyrate | Sigma | B5887 | Store at -20 or -80°C |
ROCK inhibitor Y27632 | STEMGENT | 04-0012-10 | Store at -20 °C |
Essential 8 basal medium (E8) | Gibco | A15169-01 | Store at 4 °C, the supplement should be stored at -20 or -80°C |
Matrigel | BD | 354277 | Store at -20 or -80°C |
2x EasyTaq PCR SuperMix(+dye) | TransGen Biotech | AS111 | Store at -20 °C |
Cell detachment solution | STEMGENT | 01-0006 | Store at -20 °C, Accutase as a cell detachment solution to obtain a single cell suspension |
DAPI | Sigma | D9542-1MG | Store at 4 °C or -20 °C |
Anti-nanog-AF488 | BD | 560791 | Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use |
Anti-OCT4 | abcam | ab19857 | Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use |
AF488 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A21202 | Store at 4 °C, secondary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/500 when use |
PE anti-human TRA-1-60-R Antibody | Biolegend | 330610 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
eFluor 570-conjugated anti-SSEA4 | eBioscience | 41-8843 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
Isotype antibody | eBioscience | 11-4011 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
Alkaline Phosphatase Detection Kit | SiDanSai | 1102-100 | Store at 4 °C |
Genomic DNA Extraction Kit | TIANGEN | DP304-02 | Store at RT |
Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | Store at RT |
Flow cytometry cell analyzer | BD | LSRII | for flow cytometry analysis |
Spinning disk confocal microscope (SDC) | PerkinElmer | UltraVIEW VOX | for confocal imaging |
Nucleofection device | Lonza | Nucleofector 2b | for the nucleofection of PB MNC |
ImageQuant LAS-4010 | GE | take photo of AP staining in bulk |