يوضح هذا الأسلوب وسيلة فعالة لإعداد النسخ المتماثل أو المعيبة مخزونات فيروس ترميز الجين الورمي الإنسان ، واستخدمت لاحقا لتحريض مرض التكاثر النقيي في نموذج الفأر.
لدينا مختبر دراسات الأمراض التي يسببها الإنسان من خلال التكاثر النقيي المسرطنة مثل BCR – ABL أو مستقبلات عامل النمو المشتق المسرطنة (ZNF198 – FGFR1 ، BCR – PDGFRα ، الخ). ونحن قادرون على نموذج ودراسة الأمراض التي تصيب البشر ، كما هو الحال في نموذج الفأر لدينا ، عن طريق زرع خلايا نخاع العظم المصاب سابقا مع الارتجاعي التعبير عن الجين الورمي في المصالح. النسخ المتماثل أو المعيبة الارتجاعي ترميز الجين الورمي الإنسان وتنتج علامة (GFP ، RFP ، والمضادات الحيوية الجينات المقاومة ، الخ) عن طريق بروتوكول ترنسفكأيشن عابرة باستخدام الخلايا 293T ، من حقوق الإنسان الكلوي خط الخلايا الظهارية تحويلها من قبل الجين المنتج E1A اتش. 293 الخلايا لديها خاصية غير معتادة للغاية التي يجري transfectable فوسفات الكالسيوم (كابو 4) ، مع ما يصل الى 50-80 ٪ كفاءة ترنسفكأيشن يمكن بلوغه بسهولة. هنا ، وشارك في 293 transfect نحن مع الخلايا ناقلات فيروسات التعبير عن الجين الورمي من الفائدة والبلازميد التي تعبر عن وظائف التغليف هفوة ، بول الحياة الفطرية ، مثل الجينوم واحدة والتغليف يبني القات أو PCL ، في هذه الحالة EcoPak البلازميد. كذلك تم تحسين ترنسفكأيشن الأولية باستخدام الكلوروكين. مخزونات فيروس ecotropic ، التي جمعت في 48 ساعة الثقافة طاف. بعد ترنسفكأيشن ، يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية وتستخدم للعدوى من خطوط الخلوي في ضوء التحول والدراسات في المختبر ، أو الخلايا الأولية مثل خلايا فأر نخاع العظام ، التي يمكن استخدامها للزراعة في نموذج الفأر لدينا .
وأربع نقاط حاسمة ضمان نجاح الأسهم الجيدة فيروسية :
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl + 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 µ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
2M CaCl2 | Sigma | |||
miliQ H2O | sterile-filtered | |||
Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
6 cm plates | for tissue culture | |||
Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
18G needles | single use, one per virus type. | |||
45 um syringe filters | ||||
5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
50 ml conical tubes | ||||
cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. |
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile.