Summary
这种技术演示了一个有效的方式来准备复制缺陷型逆转录病毒编码的人类癌基因的股票，随后诱导骨髓增殖性疾病的小鼠模型中使用。
Abstract
我们的实验室研究人类Bcr - Abl的或生长因子受体产生的致癌基因（ZNF198 - FGFR1的，BCR -PDGFRα等）等癌基因诱导骨髓增生性疾病。我们能够在我们的小鼠模型，以模型和研究一个与人类类似的的疾病，以前与利益表达的原癌基因的逆转录病毒感染的骨髓细胞移植。复制缺陷的逆转录病毒编码的人类癌基因和标记（GFP，RFP，耐抗生素基因等）是产生一个瞬时转染293T细胞，腺病毒E1A基因产品转化一个人的肾上皮细胞系的协议。 293细胞有高度磷酸三钙（投诉警察课4）转染不同寻常的特性，容易达到50-80％的转染效率。在这里，我们共同利益和质粒表达GAG - POL - ENV包装的功能，如包装构造吉或PCL，在这种情况下的单基因质粒EcoPak，的原癌基因表达逆转录病毒载体转染293细胞。最初的转染，进一步提高使用氯喹。 ecotropic病毒的股票，收集培养上清48小时。转染后，可以储存在-80 ° C和用于感染细胞系，改造和体外研究，或小鼠骨髓细胞如原代细胞，在我们的小鼠模型，然后可以用于移植。
Protocol
- 改造，板3 - 5X10 6细胞/ 6厘米的组织cultureplate 293T细胞前的晚上。
注：我们使用易于转染和efficacyas病毒产生细胞的293T细胞 。 这些细胞是缺乏包装病毒的，除非引入一个辅助质粒。
- 第一天上午，轻轻取出介质替换为4毫升293T细胞MED含有氯喹25毫米。培养箱中培养1小时。
注：板应在80％左右融合。
- 同时，病毒混合2板准备的时间，在5毫升管：
- 2 × 10毫克逆转录病毒质粒的构建
- 2 × 5毫克的包装构造（EcoPak）
- 2 × 62毫升氯化钙
- 完成至1 ml，用无菌DDH 2 O
注：虽然逆转录病毒质粒编码的兴趣和标记的癌基因，EcoPak编码GAG - POL - ENV。 连同293T细胞时，就会产生ecotropic逆转录病毒（RV）的特定的小鼠细胞，但不会对人体细胞的感染 。 氯喹和氯化钙2已被证明能增加转染效率。
- 添加2X sterileHBS1毫升下降明智的混合物，一边轻轻振荡管。
- 立即加入该解决方案2板，每1毫升，轻轻地，一滴一滴。
- 培养箱中培养7至11小时。
- 在今晚（7日至11小时以后），轻轻取出介质，轻轻地取代用5毫升的新鲜293T中等。培养箱中培养，直到中午，第二天。
注：这一步很重要，因为你需要从细胞中的氯喹起飞。如果长时间保存，氯是有毒的。在板块的解决方案看起来很模糊，由于非常精细，尘埃状沉淀转染混合物。
注：重要的是做极端温柔的所有媒体的变化，细胞已致敏的氯喹，可以很容易地脱离板 。
- 第二天，18至24小时。检索病毒（约中午）之前，轻轻取出介质，非常轻柔3毫升新鲜293T中型取代。替换在孵化器的O / N。
- 第三天早上（18至24小时。以后），轻轻吸了10毫升注射器配有一个18 G针中期形成的板块。这上清包含的逆转录病毒。
- 更改针到45毫米的注射器过滤器，倒置注射器多次组合的解决方案，通过过滤上清液，cryotubes等分
注：此外，如果你正在为5 0 ml锥形管3 +病毒，池中所有相同的病毒上清板块。拌匀，然后分装上清含有cryotubes逆转录病毒过滤。
- 管含有病毒的全上清保存在-80℃直至使用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
四个关键点，将保证一个良好的病毒股票的成功：
- 生产的293T细胞很健康，这意味着他们已经非常有规律的时间表上的分裂，从来没有杂草丛生，并在组织培养板，每6厘米的3.5-5万的优化密度镀，使他们达到一个密度80％的板转染上午。
- 此外氯喹，提高转染效率和随后的病毒滴度，约3 - 5倍，稳定细胞lysozomes和增加到达细胞核内的DNA的一小部分。丁酸钠（另一种溶酶体稳定）也被用于这一目的。氯喹可以省略，在这种情况下，改变介质的7-11小时。转染后在这一点上是不是必需的。
- DNA的质量是非常重要的。载体和包装质粒DNA纯化的首选方法是两次铯，溴化乙锭的浮力密度离心纯化。我们喜欢的DNA的浓度至少应达到1毫克/毫升，OD 260/280比例应在1.75-1.90之间。 Qiagen公司，纯化的DNA也会工作，虽然，在作者的手中，结果不是很好。这一点很重要的DNA解决方案的结合体积小（<50％最终毫升UL总），以避免Tris和EDTA（TE）的磷酸钙沉淀的不良影响。
- 逆转录病毒载体和宿主范围的包装构造的选择有重要意义。在小鼠造血干细胞的稳定表达，骨髓增生肉瘤病毒为基础的向量是首选。一个共同的载体骨干米格RI，包含一个MPSV长末端重复序列，为引进一种致癌基因的多克隆位点，和下游的内部核糖体进入网站链接的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因。 HSC的小鼠，病毒转导的ecotropic宿主范围是最优的，但这类股票在生理温度不稳定，不能离心浓缩。
一些检查点：如果需要的话，收获后，293细胞可以被用来制造免疫检查由逆转录病毒载体（例如，传统知识）编码的蛋白质的表达蛋白裂解物。我们还可以使用一个LacZ基因编码的对照质粒转染的时间（无需包装载体），β-半乳糖苷酶检测转染efficinecy检查，当我们收集上清等板块在不同的板块。注意：这将测试的细胞和试剂，但不能用于病毒决策的质粒的质量。
在使用任何病毒，滴度需要确定。这是至关重要的，在相同的实验，以匹配不同的病毒滴度，并确保造血干细胞的有效传导。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
| 293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
| coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
| EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
| 2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl+ 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 μ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
| 2M CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| miliQ H2O | sterile-filtered | |||
| Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
| 6 cm plates | for tissue culture | |||
| Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
| 10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
| 18G needles | single use, one per virus type. | |||
| 45 um syringe filters | ||||
| 5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
| 50 ml conical tubes | ||||
| cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. | |||
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile. |
||||
References
- DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).
- Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
- Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes. Blood. 83, 43-50 (1994).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70, 5701-5705 (1996).
- Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
- Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).
- Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).
- Van Etten, R. A.
- Van Etten, R. A. Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice. Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).
